專利名稱：控制黃龍病的驅蟲劑組合物和基因方法
技術領域：
本發明涉及含有倍半萜以控制柑橘類植物中黃龍病(HLB)的驅蟲劑組合物。也公開了通過柑橘類植物的遺傳修飾控制HLB的方法。
背景技術：
黃龍病(HLB)，也知道為柑橘靜脈韌皮部變性(CVPD)、柑橘綠化病、黃梢病(從中文黃龍病翻譯)、臺灣的立枯病(由作為立即枯萎病的中文翻譯)、菲律賓的葉黃斑病和印度的柑橘枯病，可能是由媒介物病原體(vectored pathogen)引起的最嚴重的柑橘疾病。病原體是能運動的細菌，韌皮部桿菌(Candidatus Liberibacter spp.),其通過亞洲柑桔木虱(胸喙類木虱科)——也知道為柑桔木風——、或在非洲通過非洲木虱(Triozaerytreae)、非洲柑桔木風傳染。HLB主要分布在亞洲的熱帶和亞熱帶。它在亞洲中的所有柑橘生長區中都有報道。在中國、臺灣、印度、斯里蘭卡、馬來西亞、印度尼西亞、緬甸、菲律賓、巴基斯坦、泰國、琉球群島、尼泊爾、留尼汪、毛里求斯、和阿富汗，該疾病已經影響了莊稼。在亞洲之外地區諸如沙特阿拉伯、巴西和美國的佛羅里達也報道了該疾病。雖然已有的殺蟲劑和驅蟲劑組合物在控制HLB可以是有用的，但是這些組合物的安全性受到懷疑，因為許多這些組合物對于生態系統中的其它生物是過度有毒的。另外，許多這些組合物是壽命超長，且在它們所施加的環境中幾乎無限期地持續。而且，許多昆蟲種類已經進化出對于多種已知殺蟲劑和驅蟲劑組合物的耐性。因此，存在對于相對無毒、短壽命、有效的驅蟲劑組合物的需求，諸如生物驅蟲劑組合物。在越南很早就知道鄰近柑橘生長、或與柑橘間作的番石榴對于亞洲柑桔木虱具有殺蟲劑或驅蟲劑作用。番石槽是番石槽屬(genus Psidium)桃金娘科(桃金娘科(Myrtaceae))的植物，所述科包括大約100種熱帶灌木和小樹。最經常遇到的物種和通常簡稱為“番石榴”的一種是蘋形番石榴(番石榴(Psidium guajava))。套種番石榴和柑橘的保護作用可能是由于番石榴葉產生的揮發物，因為該保護作用是整年存在的。從番石榴葉的水蒸餾中得到的番石榴葉油使用GC-MS鑒定出57種成分，包括27種萜(或倍半萜)連同14種醇和4種酯，解釋番石榴的保護作用的準確機理是未知的。最近的報道(Rouseff 等人，Sulfur Volatiles in Guava (Psidium guajava L.)Leaves:Possible Defense Mechanism, J. Agric. Food Chem, 56:8905-10，2008)提議硫揮發物諸如二甲基二硫醚對于番石榴的相斥作用承擔責任，而不是主要揮發物諸如β -石竹烯，因為后者也在柑橘中存在。但是，番石榴葉中含有的硫揮發物在微小的水平放出和僅在受傷后大約30分鐘的時間段中持續，表明這些化合物與在越南柑橘-番石榴中所觀察到的無關或者極少的關系。另一方面，β_石竹烯在未損害的柑橘葉中通常以O. 2%以下的總揮發物的濃度存在，而其通常占多于50%的番石榴葉放出的總揮發物。仍然存在控制柑橘類植物中的HLB的需求，而本發明提供了對該問題的新的解決方案。發明概沭
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已經發現，由番石榴葉產生的倍半萜諸如β-石竹烯和α-可巴烯驅除柑桔木虱(Diaphorina citri)和/或非洲木風(Tryoza erytrae)昆蟲。因此,本發明滿足在柑橘類植物中通過提供含有倍半萜的生物驅蟲劑組合物控制HLB的產業的需求。同時提供通過柑橘類植物的遺傳修飾以過度表達編碼倍半萜合成酶來控制HLB的方法。因此，本發明總體上涉及在柑橘類植物中控制HLB的方法，其包括表達至少一種編碼柑橘類植物中具有倍半萜合成酶活性的多肽的基因，以驅除柑桔木虱和/或非洲木虱昆蟲來控制HLB，其中過度積累的倍半萜是β-石竹烯、α-可巴烯或、其組合。在該方法中，至少一種基因具有β_石竹烯合成酶和/或α-可巴烯合成酶活性。在某些實施方式中，至少一種基因的表達通過其自身的啟動子和終止子區所驅動。在其它優選的實施方式中，至少一種基因的表達通過異源調節子區驅動，所述異源調節子區提供強的組成型組織專一或誘導型表達。更優選地，異源調節子區提供細胞溶膠、葉綠體或、線粒體中的強的組織專一的表達。在另外的實施方式中，本方法進一步包括表達編碼法尼焦磷酸合成酶的基因，以增加由具有倍半萜合成酶活性多肽產生的倍半萜的積累。本發明也涉及控制柑橘類植物的黃龍病(HLB)的方法，包括施加至少一種純化的倍半萜，其驅除柑桔木虱和/或非洲木虱昆蟲，以控制柑橘類植物的HLB病，其中至少一種倍半萜選自石竹烯和α-可巴烯、或其組合。在該方法中，至少一種純化的倍半萜由選自植物、細菌和酵母的生物進行純化。在優選的實施方式中，至少一種純化的倍半萜由番石榴植物純化，優選地，番石榴植物的葉提取物。在一些優選的實施方式中，至少一種倍半萜通過緩慢的遞送系統施加到柑橘類植物，所述系統如由昆蟲學者用于遞送信息素的那些。


圖IA和B示出SEQ ID NOs: I和3的核苷酸序列以及EQ ID N0s:2和4蛋白質序列。圖2示出由番石榴葉放出(上色譜)和提取(下色譜)的揮發性萜。圖3示出從不同柑橘基因型的葉放出的揮發物的代表性的氣相色譜分離。圖4示出在不同發育階段的番石榴葉放出的揮發物的代表性的氣相色譜分離A，新條；B，幼小；C，成熟；D，老年。圖5A示出SEQ ID NO:2的倍半萜的代表性的總離子色譜。測定用法尼焦磷酸作為底物體外表達的蛋白質粗提物進行。峰2對應于內標。圖5B示出背景校正的峰I的TIC碎片圖和從庫得到的β_石竹烯的質譜的比較。圖6示出分別在兩臂和四臂氣味測量計柑桔木虱對于柑橘揮發物土番石榴氣味(A)和柑桔木虱對于番石榴揮發物對清潔空氣(B)的選擇的代表性百分比和數量。圖7示出青蒿素(Artemisia annua)的β _石竹烯合成酶QHSl的氨基酸序列(登錄號AAL79181)、薇甘菊(Mikania micrantha)的β -石竹烯合成酶的氨基酸序列(登錄號ACN67535)、黃瓜(Cucumis sativus)的β -石竹烯合成酶的氨基酸序列(登錄號AAU05952)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)的β_石竹烯/ α _蛇麻烯合成酶的氨基酸序列(登錄號ΑΑ085539)、玉米(Zea mays)的(E) - β-石竹烯合成酶的氨基酸序列(登錄號ABY79206)和稻(Oryza sativa)的(E) - β -石竹烯/ β -欖香烯合成酶的氨基酸序列(登錄號ABJ16553)的對比。以黑色突出和以灰色突出的分別是這些序列中相同和相似的殘基。圖8Α和8Β青蒿素的β _石竹烯合成酶QHSl的氨基酸序列(登錄號AAL79181)、薇甘菊的石竹烯合成酶的氨基酸序列(登錄號ACN67535)、黃瓜的β -石竹烯合成酶的氨基酸序列(登錄號AAU05952)、擬南芥的β -石竹烯/ α -蛇麻烯合成酶的氨基酸序列(登錄號ΑΑ085539)的對比(Α)，以及玉米的(E)-β -石竹烯合成酶的氨基酸序列(登錄號ΑΒΥ79206)和稻的(E) - β -石竹烯/ β -欖香烯合成酶的氨基酸序列(登錄號ABJ16553)的對比(B)。以黑色突出和以灰色突出的分別是這些序列中相同和相似的殘基。圖9示出青蒿素的β_石竹烯合成酶QHSl的氨基酸序列(登錄號AAL79181)、薇甘菊的石竹烯合成酶的氨基酸序列(登錄號ACN67535)、黃瓜的β -石竹烯合成酶的氨基酸序列(登錄號AAU05952)、香橙(Citrus junos) (E) - β -金合歡烯合成酶的氨基酸序列(登錄號ΑΑΚ54279)、香橙萜烯合成酶的氨基酸序列(登錄號AAG01339)、推定的葡萄柚(Citrus X paradise)職烯合成酶的氨基酸序列(登錄號AAM00426)、和擬南芥的β-石竹烯/α-蛇麻烯合成酶的氨基酸序列(登錄號ΑΑ085539)的比對。以黑色突出和以灰色突出的分別是這些序列中相同和相似的殘基。設計用于擴增β_石竹烯合成酶基因的引物以下劃線示出。圖10示出對應于柑橘倍半萜合成酶的部分DNA序列(SEQ ID NO: 3)和應用RACE方法學快速擴增其5,-和3,-端的引物。圖11示出擬南芥法尼焦磷酸合成酶I (FPPSl)的核苷酸和氨基酸序列(登錄號X75789)的比對。下劃線示出的是用于設計擴增編碼功能FPP合成酶基因的全長cDNA的引物的序列。
具體實施例方式本發明涉及控制HLB的方法，其基于以下觀察由番石榴葉產生的倍半萜驅除HLB媒介柑桔木風和/或非洲木風昆蟲。萜烯是基于異戊二烯單元(C5H8)的不飽和烴，其可以是無環的或者環狀的。倍半職是基于C15結構的職烯。番石榴，像其它芳香植物或精油植物一樣，在它們的葉中積累了大量的倍半萜。典型地，倍半萜諸如石竹烯和α-可巴烯占由番石榴葉放出的揮發物的總量的50-60%。在番石榴植物中，倍半萜通常在葉和莖表面上的特定的解剖結構、腺毛或分泌腔中進行合成和積累。在植物中積累的倍半萜可以通過不同方式諸如蒸汽蒸餾法進行提取，所述蒸汽蒸餾法產生所謂的含有濃縮倍半萜的精油。在本發明的某些實施方式中，作為控制HLB的方法，從番石榴植物提取的至少一種倍半萜，優選地為β_石竹烯，通過噴灑或緩慢的遞送系統施加到柑橘類植物。緩慢的遞送系統已經由昆蟲學家用于遞送信息素。在這種系統中，純的β-石竹烯放置在PVC樹脂中，所述樹脂保存和釋放化合物。該樹脂直接施加到果園中的柑橘樹。其具有在3-4月的時間段期間中釋放化合物的性能。植物天然提取物的價格和可用性依賴于豐富、油產量和植物的地理來源。由于它們結構的復雜性，通過化學合成生產單獨的倍半萜分子通常被該方法的成本所限制，并且不總是化學上或財政上可行的。因此，生產倍半萜分子的生化途徑的工程學需要倍半萜的生物合成的清楚的理解和分離編碼涉及特定生物合成步驟的酶的基因的分離。植物中倍半萜的生物合成已經被廣泛研究。所有萜烯的共同的五-碳前體是異戊烯焦磷酸(IPP)。催化導致IPP的步驟的大部分的酶已經進行了克隆和表征。IPP生物合成的兩個截然不同的途徑在植物中共存。甲羥戊酸途徑在細胞溶膠和內質網中發現，而非-甲羥戊酸途徑(或脫氧-5-磷酸木酮糖(DXP)途徑)在質體中發現。在下一個步驟中，IPP通過異戊烯轉移酶進行重復地濃縮形成倍半萜的無環異戊二烯基焦磷酸萜烯前體、法尼焦磷酸(FPP)。這些前體作為倍半萜合成酶的底物，所述酶可以催化復雜的多步環化。因此，β-石竹烯生物合成的第一個關鍵步驟是通過倍半萜合成酶的環化通用的倍半萜前體FPP。編碼β-石竹烯合成酶的一組基因已經由植物克隆。這些合成酶常常涉及不同倍半萜的產生。例如，由擬南芥的β_石竹烯合成酶基因編碼的單個蛋白質能夠轉化FPP成為倍半萜產物(-)-α-可巴烯、-蛇麻烯、和(-)-(Ε)-β-石竹烯(Chen 等人，Biosynthesis and emission ofterpenoid volatiles from Arabidopsis flowers, Plant Cell 15:481-494(2003);Tholl等人，Twosesquiterpene synthases are responsible for the complex mixture ofsesquiterpenes emitted from Arabidopsis flowers, The Plant J. 42:757-771 (2005))。玉蜀黍的β -石竹烯合成酶產生-欖香烯、-蛇麻烯、和(-)-(Ε) —石竹烯(Kollner等人，A maize (E) —caryophyllene synthase implicated in indirect defense responsesagainst herbivores is not expressed in most American maize varieties, The PlantCell20:482-494 (2008)) □ β -石竹烯合成酶已經從青蒿素(Cai等人，A cDNA clone forβ -caryophyllene synthase from Artemisia annua, Phytochem 61:523-529(2002))、黃瓜(Mercke 等人，Combined transcript and metabolite analysis reveals genesinvolved in spider mite induced volatile formation in cucumber plants, PlantPhys. 135:2012-2024)、稻(Cheng 等人，The rice (E)—caryophyllene synthase (0sTPS3)accounts for the major inducible volatile sesquiterpenes,Phytochem68:1632-1641 (2007))和牛至(Degenhardt 等人，Restoring a maize root signalthat attracts insect-kiIling nematodes to control a major pest, PNAS106:13213-218(2009))中分離。編碼倍半萜合成酶的嵌合基因已經被用于遺傳轉化植物，目的是吸引/驅除傳粉者(Kessler 等人，Field experiments with transformed plants reveal thesense of floral scents, Science 321:1200-1202 (2008))、吸引害蟲殺死昆蟲(Kappers等人,Genetic engineering of terpenoid metabolism attracts bodyguards toArabidopsis, Science 309:2070-2072 (2005) ; Schnee 等人，The products of a singlemaize sesquiterpene synthase form a volatile defense signal that attractsnatural enemies of maize herbivores, PNAS 103:1129-1134(2006))和線蟲類(Degenhardt 等人，Restoring a maize root signal that attracts insect-killingnematodes to control a major pest, PNAS 106:13213-218 (2009))，且直接殺死害蟲(Wu 等人，Redirection of cytosolic or plastidic isoprenoid precursors elevates
6terpene production in plants, Nature Biotechnology, 24:1441-1447 (2006)),表明針對增加這種倍半萜、包括β_石竹烯的積累的轉基因策略可以是生態上合理選擇，其單獨或者與殺蟲劑的減少使用進行組合，將預防由害蟲傳播的破壞性疾病引起的損壞。本發明的一個實施方式涉及編碼柑橘類類物、屬于蕓香科植物的柑橘類相關植物、番石榴、桃金娘科的番石榴相關的植物、或任何其它生物體的倍半萜合成酶的核酸的分離。如本文使用，倍半萜合成酶是催化倍半萜合成的任何酶。一個人可以確定由本發明的核酸編碼的多肽是否具有倍半萜合成酶活性，通過在本文實施例中描述的酶表征試驗。在本發明的合適的實施方式中，核酸選自(a)包含基本如在SEQ ID NO: I中說明的核苷酸序列的核酸；或(b)編碼基本如在SEQ ID N0:2中說明的多肽的核酸，其中由所述核酸編碼的多肽具有倍半萜合成酶活性。在本發明的核酸的另一個實施方式中，核酸選自(a)包含基本如在SEQ ID N0:3中說明的核苷酸序列的核酸；或(b)編碼基本如在SEQ ID N0:4中說明的多肽的核酸，其中由所述核酸編碼的多肽具有倍半萜合成酶活性。優選地，本發明的核酸和/或多肽從柑橘類植物中分離。在一個實施方式中，核酸從番石榴植物中分離。優選地，根據本發明的核酸包括SEQ ID NO: I。在具體實施方式
中，本發明涉及某些分離的核苷酸序列，其包括基本沒有污染內源性材料的那些。術語“核酸”或“核酸分子”指以單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核酸或核糖核酸聚合物，除了另外限定，其將包含天然核苷酸的已知類似物，所述類似物可以以類似于天然存在的核苷酸方式起作用。“核苷酸序列”也指多聚核苷酸分子或寡核苷酸分子，以分離片段的形式或者作為較大核酸的成分。本發明的一些核酸分子來源于DNA或RNA，從前至少以基本純的形式和以實現通過標準生物化學方法進行其組成核苷酸序列的鑒定、操作和回收的量或濃度。這些方法的實例，包括如在本文可以使用的PCR方案的方法，所述方法在以下公開Sambrook 等人·，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd ed. , ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989),由 F. A. Ausubel 等人編輯的 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1987)，，和Innis, M.等人編輯，PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications, AcademicPress (1990)。如本文描述，本發明的核酸分子包括以單鏈和雙鏈形式的DNA，以及RNA其補體。DNA包括，例如，cDNA、基因組DNA、化學合成DNA、通過PCR擴增的DNA、和其組合。基因組DNA，包括翻譯、非翻譯和控制區，可以通過常規技術分離，例如，使用本發明的任一的cDNAs、或其合適片段，作為探針，以鑒定一塊基因組DNA，其然后可以使用本領域公知的方法進行克隆。一般而言，在本發明的范圍內的核酸分子包括與本發明的序列在本發明的序列的雙鏈DNA解鏈溫度以下5° CUO0 C、15° C、20° C、25° C、或30° C的溫度進行雜交的序列，包括在這些范圍內包含的任何范圍的條件。在另一個實施方式中，本發明的核酸包括基本如在SEQ ID NO: I活SEQ ID NO: 3中說明的序列。在一個實施方式中，核酸是與SEQ ID NO: I活SEQ ID N0:3的核苷酸至少是70%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%是相同的，并且每個核酸編碼具有倍半萜合成酶活性的蛋白質，例如，如所證明，在實施例中描述的酶測定中，與由SEQ ID N0:1活SEQID N0:3編碼的多肽相比，具有增加的穩定性和功效。在一個實施方式中，核酸包括核苷酸序列SEQ ID N0:1。在另一個實施方式中，核酸包括核苷酸序列SEQ ID N0:3。在還另一個實施方式中，核酸包括SEQ ID N0:1或SEQ ID NO:3的至少50、100、250、500、或750鄰接核酸的連續一段序列。這些核苷酸的連續片段也可以包含至少一個突變，只要突變體序列保持源序列的功能性以及低或高嚴謹條件下與這些核苷酸雜交的能力，諸如，例如，在中等或高嚴謹條件下。例如，這些片段可以來源于SEQ ID N0:1或SEQ IDNO: 3 的(nt)200 至 nt 1700、nt 800 至 nt 1700、nt 1000 至 nt 1700、nt 200 至 nt 1000的核苷酸。如上描述，通過本發明的核酸編碼的多肽被本發明所包含。本發明的分離的核酸可以選自編碼基本如在SEQ ID N0:2或SEQ ID NO:4中說明的多肽的核酸。在一個實施方式中，多肽與SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4至少40%、至少55%、至少70%、至少85%、至少90%、或至少95%同一的，且所述多肽具有倍半萜合成酶活性，例如，如在以下描述酶測定中證明的。由于遺傳密碼的簡并性，其中多于一個密碼子可以編碼相同氨基酸，多個DNA序列可以編碼相同多肽。這種變體DNA序列可以產生于遺傳漂變或人工操作(例如，在PCR擴增期間出現或者作為天然序列的故意突變發生的產物)。因此，本發明包括衍生自SEQ IDNO: I或SEQ ID NO: 3的任何核酸，能夠編碼基本如在SEQ IDN0:2活SEQ ID NO: 4中說明的多肽。天然序列的故意突變發生可以使用本領域熟知技術多個技術實現。例如，可以應用寡核苷酸定向特定的突變發生步驟，特別是當期望突變基因，使得預定的限制核苷酸或密碼子通過替代、缺失或插入進行變更。做這種變更的示例性方法在以下公開=Walder等人(Gene 42:133，1986);Bauer 等人(Gene 37:73, 1985);Craik(BioTechniques, Jaη. 12-19, 1985);Smith 等人(Genetic Engineering!Principles and Methods, PlenumPress, 1981) ; Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488，1985) ; Kunkel 等人(Methods inEnzymoI. 154:367，1987);以及美國專利號 4，518，584 和 4，737，462。在一個實施方式中，本發明提供分離的多肽。如本文使用，術語“多肽”指包含一類在本文鑒定的氨基酸序列的多肽或肽片段以及較小片段。可選地，多肽可以根據對于本發明的核酸序列編碼的任何多肽的其抗原相關性進行定義。因此，在一個實施方式中，在本發明的范圍內的多肽被定義為含有與本發明的核酸序列的編碼的任何多肽具有共同的線性或3-維表位的氨基酸序列。可選地，在本發明的范圍內的多肽通過抗體進行識別，所述抗體專一地識別由本發明的核酸序列編碼的任何多肽。抗體被定義為專一結合，如果它們以大于或等于大約IO7M4的1^結合本發明的多肽，例如大于或等于IO8M'如本文所指的多肽“變體”指與天然多肽基本同源性的多肽，但是其具有不同于任一本發明的核酸序列編碼的氨基酸序列，由于一個或多個缺失、插入或替代。變體可以包括保守替代的序列，指特定氨基酸序列被具有類似的物理化學特征的殘基替代。保守替代的實例包括一種α殘基替代另一種，例如，lie、Val、Leu、或Ala替代另一個，或者一種極性殘基替代另一種，例如在Lys和Arg之間；Glu和Asp ;或Gln和Asn0 參見，Zubay, Biochemistry, Addison-ffesley Pub. Co. , (1983)。這種替代的作用可以使用替代得分矩陣如PAM-120、PAM-200、和PAM-250進行計算，如在Altschul中(J. Mol.Biol. 219:555-65, 1991)描述。其它這種保守替代，例如，具有類似的疏水特征的整個區域的替代，是熟知的。天然出現多肽變體也被本發明所包含。這種變體的實例是產生于交替的mRNA剪接事件或產生于本文描述的多肽的蛋白酶剪切的蛋白質。可歸因于蛋白酶解的變體，例如，包括在N-或C-端中差別，當在不同類型的宿主細胞中表達時，由于蛋白水解從本發明的序列編碼的多肽中去除一個或多個末端氨基酸。本發明的倍半萜合成酶的變體可以用于達到期望的增強或減小的酶活性，改進區域化學或立體化學，或者更改底物利用或產物分布。而且，可以制備變體以具有至少一種改進的性質，例如，對于底物增加的親和力，對于一種或多種期望化合物的產物的提高的專一性，不同的產物分布，不同的酶活性，酶反應的速度的增加，在特定環境(pH、溶劑等等)中更高的活性或穩定性、在期望的表達系統中提高的表達。位點定向突變的變體可以通過本領域任何方法制備。如以上說明，本發明提供重組和非重組、分離和純化的多肽，諸如來自番石榴或柑橘植物。天然多肽的變體和衍生物可以通過分離其它或相同植物系或種天然存在的變體、或者變體的核苷酸序列得到，或者通過人工編程編碼天然番石榴或柑橘多肽的核苷酸序列的突變。天然氨基酸序列的變更可以通過任一的多種常規方法實現。因此，本發明提供制備變體功能性倍半萜合成酶的方法，所述方法包括以下步驟(a)從SEQ ID NO: I或3中選擇任一核酸，(b)變更核酸序列以得到突變突變體核酸的種群，和(c)用突變體核酸轉化宿主細胞以表達多肽，和(d)篩選具有至少一種改進性能的功能性多肽的多肽。改進的性能可以是任何期望的性能，例如，上述性能。例如，選擇的核酸更改可以通過隨機突變、位點定向突變或DNA改組進行。更改可以是至少一個點突變、缺失或插入。例如，具有通過由改組技術得到的核酸編碼的氨基酸序列的多肽，包括SEQ ID NO: I或3的至少任一個，也被本發明所述所包含。根據本發明的這個實施方式的方法的步驟，諸如篩選功能多肽的多肽，是本領域技術人員熟知的，其將常規地使已知方案適應期望的特定的改進性能。例如，突變可以通過合成含有突變體序列的寡核苷酸在特定的基因座引入，實現與天然序列的片段的連接的限制位點位于側面。在連接后，得到塵垢的序列編碼具有期望的氨基酸插入、替代、或缺失的類似物。可選地，寡核苷酸定向位點專一的突變步驟可以使用以提供更改的基因，其中預定的密碼子可以通過取代、缺失或插入更改。本發明也包括從更改的本發明的核酸得到核酸，例如，為了得到變體多肽。在本領域中有數種用于產生轉基因植物的方法。這些包括，但是不限于植物原生質體的電穿孔、脂質體介導的轉化、土壤桿菌屬介導的轉化(Agrobacterium-mediatedtransformation)、聚乙二醇介導的轉化、植物細胞的顯微注射、和使用病毒的轉化。在一個實施方式中，使用土壤桿菌屬介導的轉化。根癌土壤桿菌屬介導的轉化是用于轉化柑橘類植物的最常用的方法。它使用在其基因組中攜帶感興趣的基因(一個或多個)的解甲的根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens-mediated)菌株作為載體，以通過共培養轉化柑橘細胞或組織幾天。自然通過土壤桿菌種作物系統進行基因轉化，以在感染的植物細胞中插入它們的DNA的片段。通過植物中細菌轉化的基因的表達導致植物中冠癭瘤的引出，通常在受傷部位。在根癌土壤桿菌中，轉化的DNA稱為T-DNA和其存在大質粒中，稱為Ti (來自腫瘤誘導)質粒。解甲的Ti質粒可以通過去除參與腫瘤形成的T-DNA基因進行加工。然后，具有合適調節區的異源基因可以插入新的嵌合T-DNA中，一旦在攜帶解甲的Ti質粒土壤桿菌細胞中并入，可以用于在植物細胞中整合和表達外源基因。通過使用標準組織培養系統，從轉化植物細胞再生整個轉基因植物是可能的。通過粒子轟擊的直接基因轉移提供轉化植物組織的另一種實例。在這種技術中，用DNA包被的顆粒、或微粒被射出穿過細胞的物理屏障。粒子轟擊可以用于將DNA引入任何目標組織，所述組織通過DNA包被的顆粒是可穿透的，但是對于穩定的轉化，使用可再生細胞是必要的。典型地，顆粒是由金或鎢制成。使用在本領域熟知的CaCl2或乙醇沉淀法，顆粒用DNA包被。DNA包被的顆粒射出顆粒槍之外。合適的顆粒槍可以從Bio-RadLaboratories (Hercules, Calif.)購買。顆粒穿透通過變化的參數進行控制,諸如爆炸性破裂的強度、顆粒的大小、或者到達目標組織顆粒必須行進的距離。用于包被顆粒的DNA可以包括適合于引發感興趣的基因表達的表達盒，其將包括可操作連接到感興趣基因的啟動子。提供粒子轟擊進行直接基因轉移的方法在Tomes等人的美國專利號5，990，387中公開。在一個實施方式中，轉染的DNA整合入染色體或者非-人生物，諸如穩定的重組系統結果。在本領域已知的任何染色體整合方法可以在本發明的實施中使用，包括但不限于重組酶介導性序列盒交換(RMCE)、病毒位點特異性染色體插入(viral site specificchromosomal insertion)、腺病毒、和前核注射。除了在操作實例中外，或當另外指出外，在本說明書和權利要求書中使用的成分、反應條件等等所有數字表達的數量應該被理解為在所有情況下被術語“大約”所述修飾。因此，除非相反地支持外，在本說明書和權利要求書中說明的數字參數是近似值，并且其可根據本發明尋求得到的期望的參數進行變化。至少，不是作為試圖對于權利要求的范圍的等同物原則的應用的限制，每個數字參數應該根據有效數字的數量和普通四舍五入方法進行解釋。盡管說明本發明的寬范圍的數值范圍和參數是近似值，但是在特定實例中說明的數值是盡可能精確地進行報道。然而，任何數值固有地包含一些誤差，必然產生于它們各自測試測量中發現的標準偏差。以下實施例意欲說明本發明、因此沒有限制發明的。百分比
是基于重量給出。除非另外定義，在本文使用的所有技術和科技術語具有本發明領域的普通技術人員所理解的相同含義。雖然與本文描述類似或等同的任何方法和材料也可以在實施本發明中使用，但是示例性方法和材料為了說明目的進行描述。在本申請中提到的出版物通過引用并入，以公開和描述連同出版物中引用的方法和/或材料。另外，在本文討論的出版物僅提供用于在本申請的申請日之前的它們的公開內容。在本文沒有東西被解釋為承認由于現有的發明，本發明不具有先于這些出版物的權利。進一步地，提供的出版物的日期可能不同于實際出版日期，實際出版日期可能需要獨立地確認。實施例
以下實施例意欲說明本發明的優選的實施方式，因此沒有限制范圍。材料在本實施例中使用柑橘類植物從柑橘種質自然庫(Citrus Germplasm Bank)(Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias(IVIA), Moncada, Valencia, Spain)得到。番石榴種子從越南和巴西的當地種植者得到，并且在IVIA的溫室中進行生長。番石榴成材植物來自于巴倫西亞(西班牙)的理工大學和植物園(PolitechnicalUniversity and Botanical Garden)。實施例I柑橘和番石榴植物的葉揮發物含量和放出的分析研究不同基因型(番石槽(Psidium guajava)、柑桔(Citrus sinensis)、來檬(Citrus aurantifolia)和克萊門柚(Citrus Clementina))的葉中揮發物含量和放出。使用在不同發育階段的葉進行分析，所述葉在每天的不同時刻和不同季節中進行收集。每個樣品至少分析四次(兩次生物重復加上兩次技術重復)。為了測定揮發物含量，收集的頁組織立即在液氮中冷凍和在-80° C中貯存，直到提取。凍結材料(200mg)在螺紋閥帽派熱克斯耐熱玻璃管中稱重，隨后立即加入3mL的冷卻的戊烷。樣品在冰上用Yellowline均質器(型號DI25)均質30s。懸浮液渦旋15s，然后加入3mL的Milli-Q水，進一步渦旋30s和在4° C 1800g離心lOmin。有機相用巴斯德吸管回收，而水相用3mL的戊烷重新提取兩次。等分的2L匯集的有機相直接注射入GC-MS用于揮發物分析(參見以下)。當液上氣體分析給出植物放出和對于植物揮發物應答的昆蟲發覺到的揮發物情況的更真實寫照時，進行固相微提取(SPME)設備的靜態液上取樣。頁樣品裝入50mL螺紋閥帽派熱克斯耐熱玻璃管中，在其頂部具有隔膜和含有ImL的milli-Q水用于避免頁氫壓力(leaf hydric stress)。SPME 纖維(100m 聚二甲娃氧燒，Supelco, Bellefonte, PA)暴露，在22°C的控制溫度、在I和4小時之間。隨即，纖維轉移到GC注射器(220° C)和熱解吸延長至4分鐘。結果顯示通過揮發物含量鑒定的主要化合物也是由葉放出的主要揮發物(代表性實例，參見圖2)。如在文獻中描述，柑橘葉含有和放出的超過80%的總的揮發物是單萜烯，在所有分析的基因型和取樣日期中里哪醇是最豐富的一種(圖3)。在這些樣品中，β -石竹烯沒有檢測到或以非常低濃度檢測到且不是在所有重復中。在番石榴葉中，倍半萜是主要的揮發物，且在所有分析的樣品中，β_石竹烯占總化合物至少50%(圖4)。實施例2GC-MS分析使用耦合到Thermo DSQ質譜儀的電子電離模式(EI)，所述質譜儀具有在70eVA。離子源和輸送線分別在200和260°C。揮發物化合物在HP-INNOWax (Agilent J&C Columns)柱(30mx0. 25mm i. d. xO. 25m膜)上分離。柱溫度編程5分鐘40°C上，以5° C mirT1上升到150°C，然后20° C mirT1上升到250°C，并在250°C保持2分鐘。注射器溫度為220°C。氦氣是載氣，在無分流模式中I. 5mL mirT1。電子轟擊質譜在30-400原子質量單位范圍記錄,具有0. 5scans^的掃描速度。化合物通過獲得的質譜與在參考庫(NIST，MAINLIB, REPLIBT)中貯存的那些匹配、或者當可得時來自可信標準化合物的那些進行匹配鑒定。實施例3亞洲柑桔木虱(D. citri)對番石榴揮發物的應答設計一系列試驗，為了研究番石榴葉揮發物對于亞洲柑桔木虱行為的影響。混合性的成蟲亞洲柑桔木虱從檸檬(C. Iimonia)幼苗上的連續培養培養物得到，所述幼苗維持在巴西柑橘生產行業協會(阿拉拉夸拉，巴西)，在25± I ° C、70± 10%相對濕度和L14:D10A光周期。具有一個12. 5cm長的入口臂和兩個21. Ocm長的試驗臂(O. 6cm內徑)的Y-管嗅覺器用于行為測定。碳凈化空氣(顆粒狀4_8mm. Applichem GmbH, Darmstadt, Germany)通過兩個2L的含有揮發物源的玻璃瓶泵入，所述揮發物源由空氣或番石榴幼苗組成。在10分鐘后測定40個木虱，具有已經被傳遞10. Ocm的那些記錄為“應答的”。結果顯示，番石榴揮發物驅除或固定木虱、或者限制柑橘吸引(圖6A)。使用四臂嗅覺器進行進一步研究。碳凈化空氣通過穿過充滿水的玻璃杯(IL)的通路進行加濕和分離成為四個流(0.4L mirT1)，其每一個指向四嗅覺器領域中的一個。流入嗅覺器的測試領域中的空氣穿過含有樣品或凈化空氣的玻璃杯(IL)，在每個試驗中測定40個木虱，且每個試驗至少每個重復三次進行。番石榴對凈化空氣的結果顯示番石榴揮發物具有驅除作用(圖6B)。β -石竹烯(純度 >98. 5%; Sigma-Aldrich, Germany)和 α -可巴烯(純度>90. 0%; Sigma-Aldrich, Germany)對于亞洲柑桔木風的作用使用四臂嗅覺器也進行了評估。在每次觀察中，木虱放置在嗅覺器的中間，所述嗅覺器被來自其四個伸長臂中的每一個的空氣所滲透。在兩個臂中，泵入凈化空氣，同時在剩下的臂中，通過含有IOL的純化合物的玻璃容器泵入空氣。每次觀察持續5分鐘，并且記錄每個單獨木虱的最后選擇。使用至少29個木虱用于研究對于每種化合物的應答。在凈化空氣的初步試驗中，在臂之間沒有得到顯著差別，顯示它們所有都是等同的，并且在選擇試驗中沒有引入任何偏差。用β-石竹烯和α -可巴烯進行的測定顯示較高濃度的木虱進入無氣味的臂，設想這些化合物的驅除作用(表I)。表I
權利要求
1.控制柑橘類植物中HLB的方法，包括在柑橘類植物中表達編碼具有倍半萜合成酶活性多肽的至少一種基因，以驅除柑桔木虱和/或非洲木虱昆蟲來控制HLB，其中過度積累的倍半萜是石竹烯、α-可巴烯、或其組合。
2.根據權利要求I所述的方法，其中由所述至少一種基因編碼的多肽具有石竹烯合成酶和/或α -可巴烯合成酶活性。
3.根據權利要求I所述的方法，其中所述至少一種基因具有一個或多個突變，與其野生型相比，其中由所述至少一種基因編碼的多肽保留倍半萜合成酶活性，且其中由所述至少一種基因編碼的多肽具有增加的穩定性和功效。
4.根據權利要求I所述的方法，其中所述至少一種基因的表達由組成型啟動子和終止子區驅動。
5.根據權利要求I所述的方法，其中所述至少一種基因的表達由異源調節子區驅動，所述異源調節子區提供強的組成型組織專一或誘導型表達。
6.根據權利要求5所述的方法，其中所述異源調節子區提供細胞溶膠、葉綠體或、線粒體中的強的表達。
7.根據權利要求I所述的方法，其進一步包括表達編碼法尼焦磷酸合成酶的基因，以增加由具有倍半萜合成酶活性多肽產生的倍半萜的積累。
8.控制柑橘類植物的黃龍病(HLB)的方法，包括施加至少一種純化的倍半萜，其驅除柑桔木虱和/或非洲木虱昆蟲，以控制柑橘類植物的HLB病，其中所述至少一種倍半萜選自β-石竹烯和α-可巴烯、或其組合。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述至少一種純化的倍半萜由選自植物、細菌和酵母的生物進行純化，或其遺傳改性的負體能夠過量產生這些倍半萜化合物。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述至少一種純化的倍半萜由番石榴植物純化。
11.根據權利要求10所述的方法，其中所述至少一種純化的倍半萜由番石榴植物的葉、果或莖提取物純化。
12.根據權利要求8所述的方法，其中所述至少一種純化的倍半萜通過緩慢遞送系統施加到所述柑橘類植物。
全文摘要
本發明提供通過在柑橘類植物中表達編碼倍半萜合成酶的基因控制柑橘類植物的黃龍病(HLB)的方法，所述倍半萜諸如β-石竹烯、α-可巴烯和其組合。也公開控制HLB的方法，其包括施加至少一種驅除柑桔木虱和/或非洲木虱昆蟲的純化的倍半萜，以控制柑橘類植物的HLB病。
文檔編號A01N65/28GK102933084SQ201080058337
公開日2013年2月13日 申請日期2010年10月26日 優先權日2009年10月28日
發明者貝特拉·阿爾克薩·加西亞, 阿納·羅德里格斯·拜紹利, 何塞普·佩里斯·羅德里戈, 萊安德羅·培尼亞·加里亞, 安德烈婭·恩里克, 馬塞洛·佩德雷拉·德米蘭達, 佩德羅·隆夫·山本, 馬塞爾·貝拉托·斯波西托, 內爾松·阿爾諾·伍爾夫, 迪瓦·多卡爾莫·泰克塞拉, 安東尼奧·茹利亞諾·艾雷斯, 牛頓·卡瓦爾坎蒂·德諾羅尼亞二世, 若澤·毛里西奧·西蒙斯·本托, 若澤·羅伯托·波斯塔利·帕拉 申請人:柑橘病蟲害預防基金會, 瓦倫西亞農業研究所