專利名稱：用于柑桔黃龍病菌(亞洲種)檢測的lamp引物組的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物保護領域，提供了利用常溫擴增技術對柑桔黃龍病菌(亞洲種)的檢測，適用于ロ岸檢驗檢疫等機構應用。
背景技術：
柑桔黃龍病是柑桔生產上的重要病害，被多個國家列入名單的重大檢疫性病害。 柑桔黃龍病菌(亞洲種)是柑桔黃龍病菌的ー個菌系，在我國主要分布于廣東、廣西、福建、 臺灣、海南、云南、貴州、四川、浙江、湖南、江西等省，該病對柑桔危害極大，感染后顯現綠樹冠、中枝梢發黃癥狀，甚至樹亡林毀，幼齡樹發病后一般在2 3年死亡，老年樹發病則在 3 5年內枯死或喪失結果能力，因而也被稱為“桔癌”，一直是國際柑桔學界的研究重點。 近年來，隨著柑桔生產的發展，柑桔黃龍病的發病區域日益擴大，已成為柑桔產業發展的瓶頸。2002年11月，浙江省黃巖桔區首次發現柑桔黃龍病疫情，當年全區只有2鎮的36個行政村發生，病樹8510株。2003年有7個鄉(鎮、街道)共99個行政村發病，病樹增加到 113115株。到2004年，整個黃巖桔區17個鄉(鎮、街道)都已發生柑桔黃龍病，發病村數為 225個，病樹達312105株，病株率為1. 47% 44. 61%。廣西柑桔黃龍病年均發病率超過5%， 毎年造成的直接經濟損失超過8. 05億 9. 62億元。近年來，位居世界柑桔產量第一和第三的巴西和美國也正面臨柑桔黃龍病的威脅，其柑桔產業大幅度萎縮。柑桔黃龍病傳統的檢測技術主要有癥狀鑒別、顯微鏡觀測、血清學檢測和PCR檢測等，但這些檢測方法均有其不足之處。癥狀鑒別法僅對發病明顯的病株有效，對發病初期的病株往往造成漏檢；顯微鏡觀察大多應用電子顯微鏡觀察，由于電鏡本身檢測技術上的缺點和黃龍病菌在植物體內的菌量低、分布不均等原因，電鏡檢測技術檢測效率只有 60% 70%，容易造成漏檢；雖然血清學檢測已在其它病害的檢測上獲得了巨大的成功，但對黃龍病病原來講，至今仍沒有得到較好的抗體，在檢測的時候容易造成漏檢或假陽性； PCR方法雖然特異性高，檢測周期短，但其昂貴的儀器設備和較高的假陽性率，也限制了其推廣。本發明應用法LAMP引物將恒溫擴增技術運用于柑桔黃龍病菌的快速檢測，特異性、靈敏度比普通通變溫PCR方法更高，同時可以免除高昂的儀器投入，便于基層推廣使
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發明內容
本發明的第一目的是提供一組檢測柑桔黃龍病菌(亞洲種)LAMP引物組；本發明的第二目的是提供ー種利用上述引物組檢測柑桔黃龍病菌(亞洲種)的方法。ー種用于柑桔黃龍病菌(亞洲種)檢測的LAMP引物組，包括一對外引物和一對內引物，其DNA序列分別為
SEQ ID NOl :ACGATGAAGATACCGTCAA SEQ ID N02 CCGATGTTCTTATAGAAATAACTCTSEQ ID N03 :GTGTTGTACTTTCACCATGACATTTCTGATGTGCATAACATCAAGC SEQ ID N04 :ACTTATGTGATTGAAGAAGGTGTCAGCGAATAATTTTTATTACCCACG。ー種利用上述引物組檢測柑桔黃龍病菌(亞洲種)的方法，步驟如下 DDNA模板的提取用市售DNA提取試劑盒，按照說明書步驟提取DNA模板。2) LAMP 10 μ mol/mL SEQ ID N01、10 μ mol/mL SEQ ID N02 UOymol/ mL SEQ ID N03 禾ロ 10 μ mol/mL SEQ ID N04 各 1 μ L ;2*reaction mix 12. 5μ L ；Bst DNA 聚合酶1 μ L ；步驟1)中獲得的DNA模板2 μ L ；滅菌去離子水5. 5 μし3) LAMP擴增條件將配制好反應體系的PCR管于62°C水浴鍋中恒溫反應60min ； 然后80°C，5min終止反應。4)檢測結果電泳步驟3)中的LAMP擴增產物，若產生特異梯狀條帶，則待測樣品中含有柑桔黃龍病菌(亞洲種)；若未產生特異梯狀條帶，則待測樣品中不含有柑桔黃龍病菌(亞洲種)。與現有技術相比，本發明的進步在于檢測時間短，效率高，假陽性率低；檢測儀器簡單，只需要簡單的水浴鍋，無需昂貴的PCR儀，降低了實驗室投入，適合口岸檢驗檢疫機構和基層實驗室推廣。


圖1為LAMP引物等溫擴增結果；
圖中1-柑桔黃龍病菌(亞洲種)ic. Liberobacter asiaticum) ；2-黃單胞菌(Janthornonas sp.) ；3_ 短小桿菌{Curtobacterium sp.) ;4_ 鞘胺醇單胞菌 i^phmgomonassp.) ；5- 柑桔黃龍病菌(亞洲種)(C Liberobacter asiaticum).β- 單胞桿菌iBrevundimonas sp.) ；7-嗜冷桿菌0 ァcAroみacier sp. ) ；8-柑桔黃龍病菌(亞洲 ^KC. Liberobacter asiaticum)。-潘玉\\猿、場敘鎮、Cmvimcter mickiganensis subsp. michiganensis) ； 白米軟腐炳菌 iBrwinia carotovora var . Carotovora ハ11_ 相桔黃龍病菌(亞洲種)(C Liberobacter asiaiic腫)；12-柑桔饋蕩病菌CfefliAoffloaas axonopodis ρν· CY iri); 13-枯草芽孢桿菌(feci バ狀 subtil is) ； 14-陰性對照；M-DL2000 DNA分子量標記。
具體實施例方式下面提供具體實施例進ー步闡述本發明的技術方案，但本發明技術的應用不限于實施例。實施例1，引物的設計與合成
參照GeneBank中柑桔黃龍病菌(亞洲種)基因序列，挑選特異性高的序列(序列號 HQ267229. 1)，采用 LAMP 引物設計軟件 Primer Explorer V4. 0 設計 LAMP 引物，利用 LAMP Real Time Turbidimeter LA-320儀對反應進程中的濁度進行實時監控，對不同引物組擴增的起始時間、進入最大擴增速率的時間、最大擴增速率及達到平臺期所需時間等參數進行分析，篩選出擴增速率最高、特異性好的一組LAMP引物。引物由上海生エ公司合成，其序列分別為
外引物 1 SEQ ID NOl :ACGATGAAGATACCGTCAA ；外引物 2 SEQ ID N02 CCGATGTTCTTATAGAAATAACTCT ； 內引物 1 SEQ ID N03
GTGTTGTACTTTCACCATGACATTTCTGATGTGCATAACATCAAGC ； 內引物 2 SEQ ID N04
ACTTATGTGATTGAAGAAGGTGTCAGCGAATAATTTTTATTACCCACG。實施例2，樣品DNA模板的提取
以1-柑桔黃龍病菌(亞洲種)(C Liberobacter asiaticum) ；2-黃單胞菌(Janthornonas sp.) ；3_ 短小桿菌{Curtobacterium sp.) ;4_ 鞘胺醇單胞菌 i^phmgomonassp.) ；5- 柑桔黃龍病菌(亞洲種)(C Liberobacter asiaticum).β- 單胞桿菌iBrevundimonas sp.) ；7-嗜冷桿菌0 ァcAroみacier sp. ) ；8-柑桔黃龍病菌(亞洲 ^KC. Liberobacter asiaticum)。-潘玉\\猿、場敘鎮、Cmvimcter mickiganensis subsp. michiganensis) ； 白米軟腐炳菌 iBrwinia carotovora var . Carotovora ハ11_ 相桔黃龍病菌(亞洲種)(C Liberobacter asiaiic腫)；12-柑桔饋蕩病菌CfefliAoffloaas axonopodis pv. CYtrz ノ； 13_ ネ古草芽 包ホ干 1 (Bacillus subtil is)為供 ι式樣品。用 Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit試劑盒提取樣品DNA模板，具體操作步驟參照試劑盒說明書。其中1、5，8，11號分別為從柑桔園采集的柑桔黃龍病病葉，然后直接提取總DNA (經普通PCR方法和熒光定量PCR方法檢測確定含有柑桔黃龍病菌(亞洲種)DNA)，其余菌株均可在國內市場購得。實施例3，陰性對照的制備
將去離子水高溫高壓滅菌，作為陰性對照。實施例4，LAMP擴增液的配制
LAMP具體擴增體糸如下。
2氺reaction mix12. 5μ L
lOymol/mL SEQ ID NOl1 μ L
lOymol/mL SEQ ID N021 μ L
10 μ mo/mL 1 SEQ ID N031 μ L
lOymol/mL SEQ ID N041 μ L Bst DNA聚合酶 1 μ L 滅菌水 5· 5 μ L DNA模板 2 μし其中，2氺reaction mix 與 Bst DNA 聚合均為 Loopamp DNA Amplification Kit
試劑盒產品。依次將上述試劑加入0. 2mL的PCR管中，配成LAMP擴增液。實施例5，LAMP擴增
將配制好反應體系的PCR管置于62°C水浴鍋恒溫反應60min ；然后80°C，5min終止反應。實施例6，檢測結果
電泳參LAMP擴增產物，結果參見圖1。其中1、5、8和11號樣品為柑桔黃龍病菌(亞洲種)，均能出現梯狀特異性條帶，其他泳道均未出現梯狀特異性條帶，結果表明本發明引物對的特異性強，對其他細菌都沒有特異性條帶出現。
權利要求
1.ー種用于柑桔黃龍病菌(亞洲種)檢測的LAMP引物組，其特征是包括一對外引物和一對內引物，其 DNA 序列為SEQ ID NOU SEQ ID N02、SEQ ID N03 和 SEQ ID N04。
2.利用權利要求1所述的引物組檢測柑桔黃龍病菌(亞洲種)的方法，步驟如下DDNA模板的提取用市售DNA提取試劑盒，按照說明書步驟提取DNA模板；2)LAMP 擴增體系ΙΟμπιοΙ/mL SEQ ID N01、10 μ mol/mL SEQ ID N02 U0ymol/mL SEQ ID N03 禾ロ ΙΟμπιοΙ/mL SEQ ID N04 各 1 μ L ;2*reaction mix 12. 5μ L ；Bst DNA 聚合酶1 μ L ；步驟1)中獲得的DNA模板2 μ L ；滅菌去離子水5. 5 μ L ；3)LAMP擴增條件將配制好反應體系的PCR管于62°C水浴鍋中恒溫反應60min ；然后 80°C，5min終止反應；4)檢測結果對步驟3)中的LAMP擴增產物進行電泳，若產生特異梯狀條帶，則待測樣品中含有柑桔黃龍病菌(亞洲種)；若未產生特異梯狀條帶，則待測樣品中不含有柑桔黃龍病菌(亞洲種)。
全文摘要
本發明公開了一套用于柑桔黃龍病菌(亞洲種)LAMP檢測的引物組，所述引物組由一對外引物和一對內引物組成。本發明還公開了一種利用該引物組檢測柑桔黃龍病菌的方法。以本發明所設計的引物采用LAMP方法檢測柑桔黃龍病，具有良好的特異性、靈敏度，能快速、方便、高效的檢測柑桔黃龍病菌(亞洲種)，能滿足對柑桔黃龍病菌(亞洲種)快速準確檢測的需要。
文檔編號C12Q1/68GK102534015SQ20121001833
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月20日 優先權日2012年1月20日
發明者吳瑜佳, 孔德英, 孫濤, 滕少娜, 趙文軍, 鄧朝暉, 陸麗華 申請人:重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心