專利名稱：玫瑰海棠試管花的培養方法
技術領域：
本發明涉及一種觀賞花卉玫瑰海棠試管花的培養方法，屬于生物技術領域，具體地說是屬于植物組織培養及試管成花技術范疇。
背景技術：
玫瑰海棠(Begonia mannii),別名麗格海棠，為秋海棠屬的一種多年生常綠草本花卉，是近年從國外引進的新品種，為上世紀50年代荷蘭育種家Peigen利用球根秋海棠 (Begonia tuberhybrida)與索科特拉海棠(Begonia socotrana)雜交育成的新品系。其株形極像球莖秋海棠，但無明顯的球莖；其花色嬌艷，花大色麗，具有玫瑰般的姿、色、香，因而被稱為玫瑰海棠。其具有以下幾大特點①花色嬌嫩柔美、艷麗多彩(有紫紅、大紅、粉紅、 黃、橙黃、白復色等)；②花朵繁密、花型多樣(花瓣有單瓣、半重瓣、重瓣以及花瓣皺邊等多種)、花姿優美；③其枝葉強壯，葉形美麗(心形)，葉色多樣(綠色、棕色等)；④花期長達4-6 個月；⑤較耐蔭，抗逆性強，適于室內觀賞栽培，盆栽可用來點綴會議室、客廳、會客室、臥室、書房、陽臺、櫥窗等，小巧玲瓏，雅致美觀，窈窕嫵媚，風姿卓越，也可裝入藝術吊籃懸掛于室內觀賞，艷麗華貴，別具一格。因此，其高價值的觀賞性，使其經濟價值提高，目前已成為世界著名的球根盆栽花卉之一。玫瑰海棠的研究主要集中于栽培、育種及組織培養方面。玫瑰海棠播種繁殖所需時間長，主要采用扦插或分株繁殖，但莖段扦插成活率低，分株繁殖速度慢，且易產生變異、品種退化，難以滿足市場大量需求。而組織培養技術具有繁殖速度快，增殖倍數高，周期短，品種復狀等特點，玫瑰海棠為草本花卉，且組織的再生能力很強，利用組培技術可以在短期內培育大量小植株，為生產上提供大量種苗，加快繁殖速度，提高經濟效益。因此近年來，玫瑰海棠的組培快繁技術研究在國內外報道較多。這為玫瑰海棠種苗的規模化快速繁殖提供了一條可靠而有效的途徑，克服了傳統繁殖方法的不足。玫瑰海棠自引入我國后，很受歡迎，市場銷量很好。但按照傳統的栽培模式，玫瑰海棠的開花時間及花期仍然不夠理想。玫瑰海棠性喜冷涼，生長適溫在15°C 48°C，適合秋季扦插，春天即可開花。但春季的氣溫已漸升高，花不耐久放，市場接受度不大。若改為5-6 月份扦插，則花期剛好在冬末春初的元旦、春節開放，且花期大大延長。但5-6月，我國大部分地區氣溫已升高，怎樣在自然條件下度過炎熱夏季是栽培上的重點和難點。建空調溫室要花費大量的財力或能源，也不理想。因此，如在傳統的秋季栽培模式下，能利用簡單的技術，對花期進行調控，使其提前開花，這無疑是一種很好的途徑。而試管花的研究，剛好可以解決這一問題。試管成花，即在培養瓶內直接誘導開花，對于研究傳統栽培模式下植物的開花機制、花期調控、試管育種等具有重要的指導意義，還可節約通過改變栽培環境如增建溫室等來延長花期所耗費的能源。這是目前植物成花研究的一個新的領域及熱點。試管成花，具有大田栽培無可比似的優點，如成花時間、花期可隨意調控，不受季節影響，且實驗周期短，而成熟的技術又可以直接用于大田生產。另外，如能培育出觀賞價值很高的試管花，并能在室內進行大規模化的生產，它對于美化生活和工作環境、調節花期淡季、增加觀賞花的新品種、新形式等將具有重要實踐意義。試管花的研究在國外幾年前就有報道，在我國近年才起步。但主要集中于蘭花，如法國的Julien Costantin于1999年進行了蘭科植物的試管開花研究，鄭立明等于2005年對中國蘭的試管開花進行了研究。玫瑰海棠試管內開花目前在國內外報道極少。玫瑰海棠在花色、花姿、花型及花期等上占有突出優勢，很適合開發試管花。本發明旨在培育小型、精巧且具有高觀賞價值的離體試管花，提高玫瑰海棠的觀賞特性，創造更高的經濟價值。為今后進行玫瑰海棠試管花的規?；a提供技術依據，為其它高檔花卉的觀賞性精品試管花的生產提供借鑒，也為玫瑰海棠大田栽培條件下的花期調控提供理論依據。

發明內容
本發明的目的在于，提供一種操作簡單，周期短，生產成本低，具有高觀賞價值的玫瑰海棠離體試管花的生產方法。本發明的技術方案，其步驟為
1.材料的選擇選取無病蟲害、生長健壯的玫瑰海棠葉片或芽(頂芽或側芽)。2.外植體滅菌處理先從供試的玫瑰海棠植株上用剪刀剪下幼嫩的葉片，用自來水洗去泥沙后，水中加入洗潔精，再反復沖洗干凈，于無菌條件下用75%的酒精浸泡 50-80s，然后置于0. 1%升汞溶液中消毒8-15min，最后用無菌水反復漂洗6_8次，用滅過菌的濾紙吸干表面水分；
3.叢芽的誘導
(1)葉片外植體將消毒后的葉片切成約l_2cm2的小方塊，輕輕嵌入誘導培養基表面， 培養基為MS培養基，補充6-芐基氨基嘌呤(6-BA) 0. 5 1. Omg/L,吲哚乙酸(IAA) 1. 5 2. Omg/L, PH值為5. 8 6. 0，10 12天時，葉表面細胞漸膨大，但不長愈傷組織，19 22 天時在葉表面上零星地冒出幾個綠色小芽點，至33 36天開始長出許多叢芽，培養條件為溫度20-23°C，光照強度1500-2500Lux，光照時間5 8h/天。(2)芽外植體將消毒后的頂芽或側芽，接種于誘導培養基，培養基為MS培養基， 補充 6-BA1. O 1. 5mg/L, IBA0. 1 0. 3mg/L, PH 值為 5. 8 6. 0，10 12 天芽開始生長， 約1個月形成34cm的叢生小苗。4.增殖培養將從外植體得到的叢芽或小苗在無菌操作的條件下進行繼代增殖， 培養基為MS培養基，補充6-BA1.0 1.51^/1，吲哚丁酸(仍4)0.2 0. 5mg/L, PH值為 5. 8 6. 0，23 沈天，已長成3-km的小苗，并從苗基部又長出許多的小苗來，苗葉片濃綠、生長健壯，增殖倍數為9-12倍，培養條件為溫度20-23°C，光照強度2000-2500LUX，光照時間10 12h/天。5.試管內成花培養待增殖培養基中的小苗，長至3-4 cm高，帶4-5片小葉時， 輕輕取出，將其從基部剪切，置于成花誘導培養基中，培養基為MS培養基，補充6-BA0. 01 0. 03mg/L, IAAO. 1 0. 2mg/L,多效唑(MET)O. 1 0. 3mg/L, PH值為 5. 8 6. 0，培養 2 周時更換一次新鮮培養基，M 27天，頂芽分化出花蕾，33 36天花芽開放，側芽陸續分化出花蕾，每苗出花1-3朵，花朵外觀、色澤正常，成花率為65 75%，培養條件為溫度20-23°C， 光照強度2000-2500LUX，光照時間10 12h/天。
本發明的有益效果是直接利用玫瑰海棠葉片，增育出了小型精巧、花色豐富、形態多樣，具有特殊觀賞價值的玫瑰海棠試管花，其特點如下
(1)操作簡單。利用幾種成分簡單的培養基，即可將葉子培養成豐富多彩的小花。本發明也試驗了利用芽直接誘導叢生小芽的途徑(芽一芽)，但是在生產上，如果大量取芽，會導致田間植株生長不良，或者要犧牲整個植株。取葉相對比較理想，不會太多影響植株。而且本發明利用葉片，采用附加6-BA及IAA的簡單MS培養基，不需產生愈傷組織，直接從葉表面誘導出了小芽，這是非常理想的。因為如果先通過產生愈傷組織，再從組織塊上分生小芽，通過了器官一細胞一器官的過程，在這個過程中可能會發生變異，難免保證原品種的優良特性。而且通過這條途徑，愈傷組織往往需要經過繼代培養，歷時較長，不是最佳快速繁殖途徑。這點也是本發明的創新點之一，目前尚未有資料報道通過這種葉一芽(器官一器官)的途徑來獲得新生芽的。(2)周期短。本發明從采摘田間葉片外植體，到獲得無菌的叢生芽，通過增殖的健狀無根小苗，直接誘導小型開花植株，整個過程大約需要100天左右，與田間的自然生長過程(從扦插小苗一大植株一開花，約需16-18個月)相比，明顯縮短了生長周期。如果不經過外植體的誘導階段，有現成的無菌小苗，只需1個月左右的時間即可生產出瓶花。而且本發明選用的增殖培養基配方，增殖倍數能達到9-12倍，也能明顯地提高生產效率。(3)生產成本低。本發明的培養基配方中，只利用了四種簡單的生長激素(6-BA、 IAA、IBA、MET)，就可以完成整個生產過程。而且這幾種激素成本比較低，是組培中常規使用的試劑。這一點非常重要，否則關系到以后的生產規模及推廣使用等問題。本發明所用的成花培養基，激素組合比較簡單，而且首次在玫瑰海棠中創新地使用了 MET (多效唑)，而且成花效果還比較好。外植體是否能分化出花芽與植物的發育、營養及激素的種類和用量有著密切的關系，激素的種類和用量又起著決定性的作用。多效唑 (Paclobutrazol，又名 Multiple-Effect Triazole, MET)是 20 世紀 80 年代初發現的新型植物生長調節劑，對于提高植物抗逆性、促進成花和坐果、壯苗生根等具有重要作用，現已廣泛應用于大田生產。多效唑在玫瑰海棠開花調節中的作用機理，還值得探討。
具體實施例方式以下的實施例子是對本發明的進一步說明，不是對本發明的限制。實例一
從供試的玫瑰海棠植株上，選取無病蟲害、生長健壯的玫瑰海棠葉片；用剪刀剪下幼嫩的葉片，用自來水洗去泥沙后，水中加入洗潔精，再反復沖洗干凈，于無菌條件下用75%的酒精浸泡50s，然后置于0. 1%升汞溶液中消毒8min，最后用無菌水反復漂洗6次，用滅過菌的濾紙吸干表面水分。將消毒后的葉片切成約l-2cm2的小方塊，輕輕嵌入誘導培養基表面，培養基為MS 培養基，補充6-BAO. 5mg/L, IAA1. 5mg/L，PH值為5. 8，10天時，葉表面細胞漸膨大，但不長愈傷組織，19天時在葉表面上零星地冒出幾個綠色小芽點，至35天開始長出許多叢芽，培養條件為溫度22°C，光照強度2000LUX，光照時間6h/天。將從葉外植體得到的叢芽在無菌操作的條件下進行繼代增殖，培養基為MS培養基，補充6-BA1.0mg/L，IBA0.;3mg/L，PH值為6. 0，23天，已長成3_4cm的小苗，并從苗基部又長出許多的小苗來，苗葉片濃綠、生長健壯，增殖倍數為9倍，培養條件為溫度23°C，光照強度2500LUX，光照時間12h/天；
待增殖培養基中的小苗，長至3-4 c m高，帶4-5片小葉時，輕輕取出，將其從基部剪切，置于成花誘導培養基中，培養基為MS培養基，補充6-BA0. 0lmg/L, IAAO. 2mg/L, METO. lmg/L, PH值為5. 8，培養2周時更換一次新鮮培養基，25天，頂芽分化出花蕾，35天花芽開放，側芽陸續分化出花蕾，每苗出花2朵，花朵外觀、色澤正常，成花率為75%，培養條件為溫度23°C，光照強度2000LUX，光照時間Ilh/天。實例二
從供試的玫瑰海棠植株上，選取無病蟲害、生長健壯的玫瑰海棠葉片；用剪刀剪下幼嫩的葉片，用自來水洗去泥沙后，水中加入洗潔精，再反復沖洗干凈，于無菌條件下用75%的酒精浸泡80s，然后置于0. 1%升汞溶液中消毒15min，最后用無菌水反復漂洗8次，用滅過菌的濾紙吸干表面水分。將消毒后的葉片切成約l-2cm2的小方塊，輕輕嵌入誘導培養基表面，培養基為MS 培養基，補充6-BA1. Omg/L, IAA2. Omg/L, PH值為6. 0，12天時，葉表面細胞漸膨大，但不長愈傷組織，20天時在葉表面上零星地冒出幾個綠色小芽點，至33天開始長出許多叢芽，培養條件為溫度21°C，光照強度1500LUX，光照時間8h/天。將從葉外植體得到的叢芽在無菌操作的條件下進行繼代增殖，培養基為MS培養基，補充6-BA1.5mg/L，IBA0.5mg/L，PH值為5. 8，洸天，已長成3_4cm的小苗，并從苗基部又生出許多的小苗來，苗葉片濃綠、生長健壯，增殖倍數為12倍，培養條件為溫度22°C，光照強度2000LUX，光照時間IOh/天；
待增殖培養基中的小苗，長至3-4 c m高，帶4-5片小葉時，，輕輕取出，將其從基部剪切，置于成花誘導培養基中，培養基為MS培養基，補充6-BAO. 03mg/L, I AAO. 2mg/L, METO. 3mg/L, PH值為5. 8，培養2周時更換一次新鮮培養基，27天，頂芽分化出花蕾，36天花芽開放，側芽陸續分化出花蕾，每苗出花3朵，花朵外觀、色澤正常，成花率為70%，培養條件為溫度22°C，光照強度2500LUX，光照時間12h/天。實例三
從供試的玫瑰海棠植株上，選取無病蟲害、生長健壯的玫瑰海棠葉片；用剪刀剪下幼嫩的葉片，用自來水洗去泥沙后，水中加入洗潔精，再反復沖洗干凈，于無菌條件下用75%的酒精浸泡60s，然后置于0. 1%升汞溶液中消毒lOmin，最后用無菌水反復漂洗7次，用滅過菌的濾紙吸干表面水分。將消毒后的葉片切成約l-2cm2的小方塊，輕輕嵌入誘導培養基表面，培養基為MS 培養基，補充6-BAO. 8mg/L, IAA1. 8mg/L，PH值為5. 9，11天時，葉表面細胞漸膨大，但不長愈傷組織，22天時在葉表面上零星地冒出幾個綠色小芽點，至36天開始長出許多叢芽，培養條件為溫度21°C，光照強度2500LUX，光照時間5h/天。將從葉外植體得到的叢芽在無菌操作的條件下進行繼代增殖，培養基為MS培養基，補充6-841.311^/1，1840.&^/1，？!1值為5.8，25天，已長成3_4cm的小苗，并從苗基部又生出許多的小苗來，苗葉片濃綠、生長健壯，增殖倍數為11倍，培養條件為溫度22°C，光照強度2000LUX，光照時間IOh/天。
待增殖培養基中的小苗，長至3-4 c m高，帶4-5片小葉時，，輕輕取出，將其從基部剪切，置于成花誘導培養基中，養基為MS培養基，補充6-BA0.0aiig/L，IAAO. lmg/L, METO. 2mg/L, PH值為5. 8，培養2周時更換一次新鮮培養基，M天，頂芽分化出花蕾，33天花芽開放，側芽陸續分化出花蕾，每苗出花3朵，花朵外觀、色澤正常，成花率為73%，培養條件為溫度22°C，光照強度2500LUX，光照時間12h/天。實例四
從供試的玫瑰海棠植株上，選取無病蟲害、生長健壯的玫瑰海棠幼嫩的芽(頂芽或側芽)；除去葉片，用自來水洗去泥沙后，水中加入洗潔精，再反復沖洗干凈，于無菌條件下用 75%的酒精浸泡70s，然后置于0. 1%升汞溶液中消毒9min，最后用無菌水反復漂洗7次，用滅過菌的濾紙吸干表面水分。將消毒后的頂芽或側芽，輕輕插入誘導培養基，培養基為MS培養基，補充 6-BA1. Omg/L, IBAO. :3mg/L，PH值為5. 8，10天芽開始生長，約1個月形成3_4cm的叢生小苗。 培養條件為溫度22°C，光照強度2000LUX，光照時間12h/天。將從芽外植體得到的無菌小苗在無菌操作的條件下進行繼代增殖，培養基為MS 培養基，補充6-BA1. Omg/L, IBAO. 3mg/L, PH值為5. 8，25天，已長成3_4cm的小苗，并從苗基部又生出許多的小苗來，苗葉片濃綠、生長健壯，增殖倍數為10倍，培養條件為溫度 22°C，光照強度2200LUX，光照時間Ilh/天；
待增殖培養基中的小苗，長至3-4 c m高，帶4-5片小葉時，，輕輕取出，將其從基部剪切，置于成花誘導培養基中，培養基為MS培養基，補充6-BAO. 02mg/L, I AAO. 2mg/L, METO. lmg/L, PH值為5. 8，培養2周時更換一次新鮮培養基，25天，頂芽分化出花蕾，35天花芽開放，側芽陸續分化出花蕾，每苗出花2朵，花朵外觀、色澤正常，成花率為71%，培養條件為溫度22°C，光照強度2500LUX，光照時間12h/天。
權利要求
1.一種玫瑰海棠試管花培養的方法，其特征在于采用玫瑰海棠葉片形成叢生芽的快速繁殖方法，在此基礎上對其試管苗進行花芽誘導，它包括下列步驟(1)材料的選擇選取無病蟲害、生長健壯的玫瑰海棠葉片；(2)外植體滅菌處理先從供試的玫瑰海棠植株上用剪刀剪下幼嫩的葉片，用自來水洗去泥沙后，水中加入洗潔精，再反復沖洗干凈，于無菌條件下用75%的酒精浸泡50-80s，然后置于0. 1%升汞溶液中消毒8-15min，最后用無菌水反復漂洗6-8次，用滅過菌的濾紙吸干表面水分；(3)叢芽的誘導將消毒后的葉片切成約l-2cm2的小方塊，輕輕嵌入誘導培養基表面， 培養基為MS培養基，補充6-芐基氨基嘌呤(6-BA) 0. 5 1. Omg/L,吲哚乙酸(IAA) 1. 5 2. Omg/L, PH值為5. 8 6. 0，10 12天時，葉表面細胞漸膨大，但不長愈傷組織，19 22 天時在葉表面上零星地冒出幾個綠色小芽點，至33 36天開始長出許多叢芽，培養條件為溫度20-23°C，光照強度1500-2500LUX，光照時間5 8h/天；(4)增殖培養將從葉外植體得到的叢芽在無菌操作的條件下進行繼代增殖，培養基為 MS 培養基，補充 6-BA1. 0 1. 5mg/L,吲哚丁酸(IBA) 0. 2 0. 5mg/L, PH 值為 5. 8 6. 0， 23 沈天，已長成34cm的小苗，并從苗基部又長出許多的小苗來，苗葉片濃綠、生長健壯，增殖倍數為9-12倍，培養條件為溫度20-23°C，光照強度2000-2500LUX，光照時間10 12h/ 天；(5)試管內成花培養待增殖培養基中的小苗，長至3-4c m高，帶4-5片小葉時，輕輕取出，將其從基部剪切，置于成花誘導培養基中，培養基為MS培養基，補充6-BA0. 01 0. 03mg/L, IΑΑ0. 1 0. 2mg/L,多效唑(MET)O. 1 0. 3mg/L, PH值為 5. 8 6. 0，培養 2 周時更換一次新鮮培養基，24 27天，頂芽分化出花蕾，33 36天花芽開放，側芽陸續分化出花蕾，每苗出花1-3朵，花朵外觀、色澤正常，成花率為70 75%，培養條件為溫度20-23°C， 光照強度2000-2500LUX，光照時間10 12h/天。
2.根據權利要求1的玫瑰海棠試管花培養方法，其特征步驟(1)也可選用玫瑰海棠幼嫩的芽(頂芽或側芽)；特征步驟(3)為將消毒后的頂芽或側芽，接種于誘導培養基，培養基為 MS 培養基，補充 6-BA1. 0 1. 5mg/L, ΙΒΑ0. 1 0. 3mg/L, PH 值為 5. 8 6. 0，10 12天芽開始生長，約1個月形成34cm的叢生小苗，培養條件為溫度20-23°C，光照強度 2000-2500LUX，光照時間11 12h/天；特征步驟(4)為將從芽外植體得到的小苗進行繼代增殖，增殖培養基同上，培養條件同上。
全文摘要
本發明涉及一種玫瑰海棠試管花的培養方法，屬于植物組織培養及試管開花技術領域。其特征是，以玫瑰海棠的成熟葉片作主要外植體，通過外植體消毒處理、叢生芽誘導、小苗生長與增殖、試管內成花培養等途徑，成功地增育出了小型精巧、花色豐富、形態多樣，具有特殊觀賞價值的試管花。本發明操作簡單，實驗周期短，生產成本低，所生產的試管花，與傳統栽培模式相比，花期可隨意調控，不受季節影響，且節約了能源及場地，它對于美化生活和工作環境，調節花期淡季，增加觀賞花的新品種、新形式，探索開花機理等將具有重要實踐意義。玫瑰海棠因其在花色、花姿、花型及花期等上占有突出優勢，很適合開發精品試管花，提高其觀賞特性，創造更高的經濟價值。
文檔編號A01H4/00GK102217549SQ201110147710
公開日2011年10月19日 申請日期2011年6月3日 優先權日2011年6月3日
發明者不公告發明人 申請人:張曦予, 李宗菊