專利名稱：龍腦樟樹工廠化育苗方法
技術領域：
本發明涉及龍腦樟樹工廠化育苗方法，具體是通過調整培養基和培養條件來提高育苗效率。
背景技術：
龍腦樟樹葉是冰片的天然植物資源。樟樹喜光，喜溫暖濕潤氣候，對土壤要求不嚴，較耐水濕，但不耐干旱、瘠薄和鹽堿土。由于早期對樟的開發利用多以提取精油為主，過度砍伐，對資源嚴重破壞，導致一些優良資源開始枯竭，加之市場需求不斷擴增，因此，尋找一種有效的樟樹繁殖方法具重要意義。目前樟樹以種子繁殖為主，生產上出現種子發芽率低，成苗參差不齊且后代苗木變異較大等問題。利用組織培養，選取優良材料進行擴繁，不僅能快速繁殖生產苗木，且能保持母本的優良遺傳性狀。目前國內對于樟樹組織培養的研究主要集中在無性快繁體系建立(鄒暉，2009)、試管苗離體保存(吳金壽，2005)、以及玻璃化苗解決方法探索(魏琴， 2006)等方面，但各學者間的觀點存在一定分歧，且全方面探討指導樟工廠化生產的體系有待進一步完善；同時，現有龍腦樟組培技術中普遍存在增殖系數低，苗木易褐化且移栽存活率低等問題，長期制約著龍腦樟組培快繁的發展，因此因而需要進一步篩選優化配方，提高分化率和移苗成活率。

發明內容
本發明提供一種龍腦樟樹工廠化育苗方法，可以解決現有龍腦樟組培技術中普遍存在增殖系數低，苗木易褐化且移栽存活率低等問題。為了實現上述目的，本發明的解決方案如下 龍腦樟樹工廠化育苗方法，通過以下步驟實現
(1)外植體的采集采取前三天先噴灑多菌靈溶液進行預處理；選取龍腦含量高的優良單株，取主干下部幼嫩萌枝條作為外植體；
(2)無菌材料的獲得枝條取下后用重量比0.1%的高錳酸鉀溶液浸泡處理，飽和洗滌液浸泡處理，再用流水沖洗；再剪成帶1-2個節間的莖段，用體積比75%乙醇溶液處理 ’然后用重量比0. 1%的升汞溶液浸泡處理，最后枝條經無菌水清洗后接種于芽誘導培養基上；
(3)無菌培養將獲得的無菌材料在合適條件的光、溫、培養基的管理下進行初代培養、 增殖培養和生根培養，促使樹苗最大化生長；
(4)移栽將生根后的樹苗轉移至移栽大棚進行煉苗，5-10天后取出樹苗，洗凈根部培養基，用重量比0. 1%的高錳酸鉀溶液浸泡處理，再清洗，沾取ABT生根粉，移栽入基質中，移栽后做好田間溫濕度管理，達到符合生產用苗的標準。步驟(3)中初代培養是MS、6_BA (6_芐胺基嘌呤)和NAA (a-萘乙酸)的混合物， 其中6-BA和NAA按質量體積比計分別為2. 0 mg/L和0. 1 mg/L,其余成分為MS。增殖培養中采用兩種不同的培養基交替使用。生根培養的培養基采用1/2改良MS、IBA(吲哚-3- 丁
3酸)和IAA (3-吲哚乙酸)的混合物，IBA和IAA按質量體積比計分別為0. 5 mg/L和0. 4 mg/L，其余成分為1/2改良MS，培養基中蔗糖濃度為20 g/L。改良MS培養基是將MS基本培養基中NH4NO3 (硝酸銨)濃度調為825 mg/L，其余組分濃度不變；1/2改良MS是將改良MS 中大量元素的含量降低一倍，其余組分含量不變。初代培養和增殖培養采用的培養基中含有卡拉膠6. 7 8/1，蔗糖3(^/1;生根培養采用的培養基中含有卡拉膠6.7 g/L，蔗糖20g/L; 初代培養、增殖培養和生根培養的培養基PH值均為5. 8-6. 0。上述培養條件采用光照時間12士2小時，光照強度2000-3500 lx，溫度 25 士 2°C。步驟(4)中基質采用草炭珍珠巖為3:1。上述增殖培養采用的兩種培養基均是改良MS、BA和NAA的混合物，其中改良MS是將MS中的NH4NO3濃度調為825 mg/L,其余組分濃度不變，兩種增殖培養的不同在于BA和 NAA的質量體積比不同，其中一種培養基在以改良MS為基本培養基的前提下，每升添加BA 和NAA分別為2.0 mg和0.05 mg，另一培養基則是在以改良MS為基本培養基的前提下，每升添加BA禾口 NAA分別為1.0 mg禾口 0. 05 mg
本發明旨在選取龍腦含量高的優良單株，取其主干下部幼嫩萌枝作為外植體，建立組織培養技術體系，并運用于工廠化育苗生產。可運用本發明中的步驟建立一套完整的龍腦樟苗木工廠化生產規程，從而提高工廠化效率。本發明提出兩種不同的增殖培養基交替使用，提高龍腦樟的增殖系數，同時不斷不斷篩選和完善龍腦樟組培的組織培養基、栽培基質和相應的培養和栽培參數解決龍腦樟組培過程中普遍存在的褐化問題，同時提高移栽存活率。
具體實施例方式1.外植體的采集
選取龍腦含量高的優良單株，取主干下部幼嫩萌枝作為外植體。采取前三天先噴灑800 倍多菌靈溶液進行預處理。2.無菌材料的獲得
枝條取回室內用0. 1%高錳酸鉀浸泡處理5 min，飽和洗滌液浸泡處理15 min，用流水沖洗30 min，置于操作臺上，剪成帶1-2個節間的莖段，75%乙醇處理15 s,0. 1%升汞浸泡處理10 min，無菌水清洗6遍，接種于芽誘導培養基上。3.無菌培養
初代培養:MS+BA2. 0 mg/L +NAAO. 1 mg/L，誘導率為 67% ；
增殖培養用改良 MS+BA2. 0 mg/L +NAAO. 05 mg/L 和改良 MS+BA1. 0 mg/L +NAAO. 05 mg/L交替使用，提高苗的增值率，苗長勢好，增殖系數為5. 57 ；
生根培養最佳生根培養基為1/2改良MS+IBA0. 5 mg/L +ΙΑΑ0. 4 mg/L +蔗糖20 g/ L，生根率可達97. 33%，平均生根條數為5-6條，生根時間為12 d；
其中改良MS是將MS中的NH4NO3濃度降為825 mg/L ； 1/2改良MS是將改良MS中大量元素的含量減半，其余組分含量不變；初代培養和增殖培養采用的培養基中含有卡拉膠6. 7 g/L，蔗糖30g/L ；生根培養采用的培養基中含有卡拉膠6. 7 g/L，蔗糖20g/L ；初代培養、增殖培養和生根培養的培養基PH值均為5. 8-6. 0。
4
培養條件光照時間12士2小時，光照強度2000-3500 lx，溫度25士2°C。4.移栽
將生根瓶苗轉至移栽大棚進行煉苗，7d后將其從瓶中小心取出，洗凈根部培養基，用 0. 1%高錳酸鉀浸泡處理5 min，清洗，沾取25 mg/L ABT生根粉，移栽入基質中(草炭珍珠巖為3:1)，移栽后做好田間溫濕度管理，30天后統計成活率。以草炭+珍珠巖(3:1)為移栽基質，成活率可達86. 11本發明開發出選出一套組培快繁技術體系的方法，可應用于龍腦樟組培苗工廠化生產。實施例1
選取龍腦含量高的優良單株，于3-4月、9-10月取主干下部幼嫩萌枝作為外植體。采取前三天先噴灑800倍多菌靈溶液進行預處理，枝條取回室內用0. 1%高錳酸鉀浸泡處理 5 min，飽和洗滌液浸泡處理15 min，用流水沖洗30 min，置于操作臺上，剪成帶1_2個節間的莖段，75%乙醇處理15 s，0.1%升汞浸泡處理10 min，無菌水清洗6遍，接種于芽誘導培養基MS+BA2. 0 mg/L +NAAO· 1 mg/L上，培養條件光照時間12士2 h，光照強度2000-3500 lx，溫度25士2°C，誘導率為67%，約30天后，待芽長至2cm左右，將其切下，再次轉入芽誘導培養基(MS+BA2.0 mg/L +ΝΑΑ0. 1 mg/L)中繼續誘導，培養條件光照時間12士2小時，光照強度2000-3500 lx，溫度25士2°C，30天后誘導產生了不定叢芽，誘導率約97%。培養基添加卡拉膠6. 7 g/L，蔗糖30g/L，pH值5. 8-6. 0。實施例2:
增殖培養階段，以改良MS附加激素BA 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L，作預實驗， 每處理10瓶，35天觀察統計結果；在此基礎上以改良MS附加BA(1.0、2.0、3.0 mg/L)、 NAA (0. 00,0. 05,0. 1 mg/L)，開展L9 (34)正交試驗，每處理10瓶，35天統計增殖系數及生長狀況，重復3次。通過預實驗得出在未添加激素的培養基上不定芽幾乎不增殖，而激素BA能有效誘導不定芽增殖；在一定范圍內(0-3.0 mg/L)隨BA濃度增加，其增殖系數越高，隨濃度繼續增加0-5.0 mg/L)，增殖系數反而下降，且不同程度的出現畸形芽及玻璃化芽，說明高濃度BA在一定程度上抑制不定芽分化。將初代培養誘導產生的不定叢芽轉入增殖培養基(改良MS+BA2. 0 mg/L +ΝΑΑ0. 05 mg/L)，培養條件光照時間12士2 h，光照強度2000-3500 lx，溫度25士2°C。30天后觀察 葉片顏色正常，苗木品質優良，增殖系數為5. 57。增殖的不定叢芽轉入增殖培養基(改良 MS+BA1. 0 mg/L +ΝΑΑ0. 05 mg/L)，培養條件光照時間 12士2 h，光照強度 2000-3500 lx，溫度25 士 2°C。30天后觀察葉片顏色正常，苗木品質優良，增殖系數為4. 92。其中改良MS是將MS中的NH4NO3濃度降為825 mg/L,培養基添加卡拉膠6. 7 g/ L，蔗糖 30g/L，pH 值 5. 8-6.0。實施例3
不定芽增殖階段試驗篩選最佳培養條件，光照時間8、11、14 h，光照強度3000 lx，溫度 25士2°C，篩選最佳光照時間；光照強度1500、20001x、3000 lx、35001x，光照時間11 h，溫度 25士2°C，篩選最佳光照強度；溫度20、25、觀°C，光照時間11 h，光照強度3000 lx，篩選最
佳培養溫度。每處理100瓶，重復3次，30 d后觀察瓶苗生長狀況。試驗篩選得出最佳培養
5條件作為瓶苗生產階段培養條件。實施例4
生根培養階段，以1/2改良MS附加單一激素IBA(0. 2,0. 6,1. 0 mg/L)、NAA(0. 2、0· 6、 1.0 mg/L)、IAA(0. 2、0.6、1.0 mg/L)，作預實驗，每處理100株，30 d統計生根率及根系生長情況；在此基礎上以 1/2 改良 MS 附加 IBA(0. 5,0. 6,0. 7 mg/L)、IAA(0. 2、0· 4、0· 6 mg/L)作交互試驗，每處理100株，30天統計生根率及根系生長情況，重復3次。通過預實驗得出三種生長素NAA、IBA、IAA均能不同程度地誘導其生根，其中以激素IBA誘導效果最好，且濃度以0.6 mg/L為佳，約12天即可見基部出現白色根原基，濃度過低則生根率低，過高則會產生愈傷組織，不定根從愈傷組織長出，大大降低根質量；激素NAA使其產生愈傷組織，通過愈傷組織生根，生根率和不定根質量低；激素IAA處理生根所需時間偏長，約16 d可產生根原基，生根率亦較低。應用單一激素IBA誘導具較高生根率，但無次級根系產生，為了得到高質量根系，采取不同激素互作誘導，但激素NAA的使用會不同程度的誘導產生愈傷組織， 降低根系質量，故棄用。選取IBA、IAA進一步試驗，根據生根率及有無愈傷組織形成，確定 IBA (0.5-0. 7)、IAA (0. 2-0. 4)激素使用濃度范圍，篩選最佳誘導生根培養基。將2-3cm長的不定芽長，轉接入生根誘導培養基(1/2改良MS+IBA0. 5 mg/L +IAA0.4 mg/L + 蔗糖20 g/L)，光照時間 12士2 h，光照強度20001x_3500 lx，溫度25士2°C， 12天后觀察到根系較粗壯，有少量側根，5-6條，基部未出現愈傷，生根率可達97. 33%。改良MS是將MS中的NH4NO3濃度降為825 mg/L, 1/2改良MS是將改良MS中大量元素減半，其余組分濃度不變；培養基添加卡拉膠6. 7 g/L，蔗糖20g/L，pH值5. 8-6. 0。實施例5
將生根瓶苗轉至移栽大棚進行煉苗，7天后將其從瓶中小心取出，洗凈根部培養基，用 0. 1%高錳酸鉀浸泡處理5 min，清洗，沾取25 mg/L ABT生根粉，移栽入基質中(草炭珍珠巖為3:1)，移栽后做好田間溫濕度管理，30天后統計成活率。以草炭+珍珠巖(3:1)為移栽基質，成活率可達86. 11本發明旨在選取龍腦含量高的優良單株，取其主干下部幼嫩萌枝作為外植體，建立組織培養技術體系。可運用本發明中的步驟建立一套完整的龍腦樟苗木工廠化生產規程，從而提高工廠化效率。本發明提出兩種不同的增殖培養基交替使用，提高龍腦樟的增殖系數，同時不斷不斷篩選和完善龍腦樟組培的組織培養基、栽培基質和相應的培養和栽培參數解決龍腦樟組培過程中普遍存在的褐化問題，同時提高移栽存活率。可以理解，很多細節的變化是可能的，但這并不因此違背本發明的范圍和精神，任何所屬技術領域的普通技術人員對其所做的適當變化，皆應視為不脫離本發明專利的范
權利要求
1.龍腦樟樹工廠化育苗方法，其特征是通過以下步驟實現(1)外植體的采集選取龍腦含量高的優良單株，取主干下部幼嫩萌枝條作為外植體；(2)無菌材料的獲得枝條取下后用重量比0.1%的高錳酸鉀溶液浸泡處理，飽和洗滌液浸泡處理，再用流水沖洗；再剪成帶1-2個節間的莖段，用體積比75%乙醇溶液處理；然后用重量比0. 1%的升汞溶液浸泡處理，最后枝條經無菌水清洗后接種于芽誘導培養基上；(3)無菌培養將獲得的無菌材料在合適條件的光、溫、培養基的管理下進行初代培養、 增殖培養和生根培養，促使樹苗最大化生長；(4)移栽將生根后的樹苗轉移至移栽大棚進行煉苗，5-10天后取出樹苗，洗凈根部培養基，用重量比0. 1%的高錳酸鉀溶液浸泡處理，再清洗，沾取ABT生根粉，移栽入基質中，移栽后做好田間溫濕度管理，達到符合生產用苗的標準。
2.根據權利要求1所述的龍腦樟樹工廠化育苗方法，其特征是步驟(1)中采取主干下部幼嫩萌枝條三天前，先噴灑多菌靈溶液進行預處理。
3.根據權利要求1所述的龍腦樟樹工廠化育苗方法，其特征是步驟(3)中初代培養是 MS、6_芐胺基嘌呤和a_萘乙酸的混合物；其中6-芐胺基嘌呤和萘乙酸按質量體積比計分別為2. 0 mg/L和0. 1 mg/L，其余成分為MS。
4.根據權利要求1所述的龍腦樟樹工廠化育苗方法，其特征是步驟(3)增殖培養中采用兩種不同的培養基交替使用。
5.根據權利要求1所述的龍腦樟樹工廠化育苗方法，其特征是步驟(3)中生根培養的培養基是1/2改良MS、吲哚-3- 丁酸和3-吲哚乙酸的混合物，吲哚-3- 丁酸和3-吲哚乙酸按質量體積比計分別為0.5 mg/L和0.4 mg/L，其余成分為1/2改良MS培養基，培養基中蔗糖濃度為20 g/L ；改良MS培養基是將MS基本培養基中NH4NO3濃度調為825 mg/L，其余組分濃度不變；1/2改良MS是將改良MS中大量元素減半，其余組分含量不變。
6.根據權利要求1所述的龍腦樟樹工廠化育苗方法，其特征是步驟(3)中，所述初代培養和增殖培養采用的培養基中含有卡拉膠6. 7 g/L，蔗糖30g/L ；所述生根培養采用的培養基中含有卡拉膠6. 7 g/L，蔗糖20g/L ；初代培養、增殖培養和生根培養的培養基pH值均為 5. 8-6. 0。
7.根據權利要求1所述的龍腦樟樹工廠化育苗方法，其特征是步驟(3)中的培養條件采用光照時間12士2小時，光照強度2000-3500 lx，溫度25士2°C。
8.根據權利要求1所述的龍腦樟樹工廠化育苗方法，其特征是步驟(4)中基質采用草炭珍珠巖為3:1。
9.根據權利要求3所述的龍腦樟樹工廠化育苗方法，其特征是所述增殖培養采用的兩種培養基均是改良MS、6-芐胺基嘌呤和a_萘乙酸的混合物，交替使用。
10.其中改良MS是將MS中的NH4NO3濃度調為825mg/L,其余組分濃度不變，兩種增殖培養的不同在于6-芐胺基嘌呤和a_萘乙酸的質量體積比不同，其中一種培養基在以改良 MS為基本培養的前提下，每升添加6-芐胺基嘌呤和a_萘乙酸分別為2. 0 mg和0. 05 mg ； 另一培養基則是在以改良MS為基本培養的前提下，每升添加6-芐胺基嘌呤和a_萘乙酸分別為 1. 0 mg 禾口 0. 05 mg。
全文摘要
本發明公開一種龍腦樟樹工廠化育苗方法，通過以下步驟實現(1)外植體的采集；(2)無菌材料的獲得；(3)無菌培養；(4)移栽。其中在無菌培養的增殖培養中采用兩種不同的培養基交替使用。本發明選取龍腦含量高的優良單株，取其主干下部幼嫩萌枝作為外植體，建立組織培養技術體系，并運用于工廠化育苗生產，本發明提出兩種不同的增殖培養基交替使用，提高龍腦樟的增殖系數，同時不斷不斷篩選和完善龍腦樟組培的組織培養基、栽培基質和相應的培養和栽培參數解決龍腦樟組培過程中普遍存在的褐化問題，同時提高移栽存活率。
文檔編號A01H4/00GK102217548SQ201110147599
公開日2011年10月19日 申請日期2011年6月2日 優先權日2011年6月2日
發明者劉秀芳, 徐進芳, 曹冬萍, 林文革, 陳細萍 申請人:地緣(廈門)生物科技有限公司