專利名稱：一種香石竹的超低溫保存方法以及再培養方法
技術領域：
本發明涉及植物超低溫的保存方法，具體涉及一種香石竹的超低溫保存方法以及再培養方法。
背景技術：
香石竹(Diarahus caryophfllus L.)為石竹科石竹屬常綠亞灌木宿根花卉，是世界著名的四大切花之一，其栽培種及野生種的資源有效保存對香石竹的國產化至關重要。 通常通過品種圃扦插及組織培養定期繼代保存香石竹資源，但香石竹若侵染病毒，長期的無性繁殖易導致病毒體內不斷積累，難以有效長期保存種質，需尋找最適的保存方法。種質資源的保存廣義上有現地保存和異地保存兩種。香石竹作為一種營養繁殖的宿根花卉，一般通過繁種圃或保存圃的田間種植方式來保存。這種保存方式需要通過年復一年的扦插來維持，不僅占用耕地，而且栽培管理中又耗時費力，還存在受干旱、洪澇、低溫、熱害、病蟲害等自然災害的影響而導致種質毀滅的危險性，不適應于長期保存(Withers L A. and Engels J. Μ. Μ. 1990.The test tube genebank—a safe alternative to field conservation, IBPGR Newsletter for Asia and the Pacific 3，1-2·)。在此背景下， 超低溫保存被認為是這類植物目前安全、有效、成本效益比合算的基因資源長期保存的最有希望的保存方法。超低溫條件下，植物的生理生化活性近乎停止，貯藏過程中的生理和遺傳變化能夠控制在最低限度內(Engelmann F. 1997. In vitro conservation methods. In Callow JA, Ford-Lloyd BV, Newbury HJ(eds)Biotechnology and plant genetic resources. CAB International, Oxford,pp 119—161·)?，F已證明，植物離體材料經超低溫保存后，仍能在適宜的條件下迅速大量繁殖，再生出新的植株，并保持原來的遺傳特性。它避免了田間保存易受自然災害影響而導致種質變異或毀滅，以及組織培養保存中因多次繼代引起遺傳性狀變異或污染的危險。關于植物超低溫保存的研究，在進入到上世紀的90年代后，保存技術的多樣化與簡易化方面不斷取得進步，能夠保存的植物物種數也在不斷地增長，但多數集中在蘋果、櫻桃、柑桔、香蕉、木薯等木本植物以及馬鈴薯、紅薯、草莓等薯類植物為主的植物遺傳資源的超低溫保存(Sakai A and Nishiyama Y. 1978. Cryopreservation of winter vegetative buds of hardy fruit trees in liquid nitrogen. Hortic Sci 13:225-227·)。超低溫保存有多種方法，近來經常運用的以PVS2作為冷凍保存液的玻璃化法，即植物材料經高濃度的保護液中處理后，迅速投入液氮中，水分形成玻璃化狀態從而避免形成冰晶造成機械損傷，有效保護植物的保存方法，被運用于100多種植物不同組織的超低溫保存(Akira Sakai and Florent Engelmann，2007)。近年來在常規玻璃化法上發展出來的小液滴法，將植物材料經玻璃化處理后，在鋁箔上滴成小液滴，然后直接投入液氮進行迅速冷凍。由于凍存及解凍速度快，組織不易形成冰晶，易成活再生，是一有發展前景的方法。國外關于香石竹的超低溫研究始于20世紀70年代，其成活率僅為2% (Seibert, 1976)。Sakai將4-8°C馴化處理的香石竹莖尖通過慢凍法^emura and Sakai, 1980)進行
3超低溫保存，成活率提高到70-80%。后通過兩步冷凍法及程序降溫法可使香石竹的成活率達 90%。(Dereuddre et al.，1987 ;Fukai，1989)。隨著玻璃化試劑發明，Langis 于 1990 采用玻璃化法成功保存了香石竹莖尖。此后，在常規玻璃化方法基礎上的小液滴玻璃化法， 保存香石竹莖尖的做法目前沒有看到報道。Halmagyi將香石竹3個品種的莖尖用海藻酸鈉包埋玻璃化處理后進行凍存，成活率可達60 % 73 %。

發明內容
本發明的目的是在現有超低溫保存研究的基礎上，提供一種香石竹的超低溫保存方法。上述保存方法包括以下步驟(1)切取香石竹組培苗的莖尖進行預培養；(2)預培養后的莖尖用含有1 3mol化―1甘油和0. 2 0. 6mol化―1蔗糖的MS液體培養基預處理20 40min ；(3)預處理后的莖尖轉入玻璃化保護劑中處理60 SOmin ；(4)步驟C3)處理后的莖尖投入液氮中保存。上述方法中，所述步驟(2)為預培養后的莖尖用含有2mol -L"1甘油和0. 4mol -L"1 蔗糖的MS液體培養基預處理30min ；所述步驟(；3)為預處理后的莖尖轉入玻璃化保護劑中處理80min。所述步驟(1)為將香石竹組培苗逐層剝去外層葉片，至剩余1 2片護葉包圍莖尖，切取1 3mm莖尖進行預培養，切取時選擇健壯的無菌苗。所述預培養可以減少莖尖組織細胞自由水含量，并增加可溶性糖等保護性物質含量，從而提高莖尖抗凍力，減少或避免冷凍傷害，達到提高存活率的目的。預培養培養基可以是含蔗糖、甘露醇、山梨醇等滲透調節劑的培養基。步驟(1)所述的預培養方法是將所述莖尖在含有0. 3 0. 5mol · Γ1蔗糖的MS固體培養基中，0 10°C暗培養1 5天。由于玻璃化保護劑濃度較高，將莖尖轉入玻璃化保護劑中時會使莖尖快速脫水， 容易對莖尖造成傷害，因而，所述莖尖在玻璃化保護之前需要進行預處理。步驟(3)所述的玻璃化保護劑為1 5mol · L—1甘油、1 5mol · Γ1乙二醇、1 5mol · Γ1 二甲基亞砜和0. 1 0. 5mol · Γ1蔗糖組成的混合溶液。所述步驟(4)為將所述莖尖轉移到裝有預冷至0 5°C的玻璃化保護劑冷凍管中，每管裝有5 15個莖尖，再將所述冷凍管投入液氮中保存。所述步驟(4)還可以為小液滴法先將所述莖尖與3 8 μ 1玻璃化保護劑在無菌鋁箔條上形成小液滴，然后將所述鋁箔條投入充滿液氮的安瓿管中，最后再將所述安瓿管投入液氮中保存。本發明還提供了一種超低溫保存后的香石竹的再培養方法，采用上述保存方法進行超低溫保存，先將超低溫保存的香石竹莖尖進行解凍和洗滌，再經過培養即可得到香石竹植株。 所述解凍和洗滌的過程為將所述莖尖放入35 50°C的水浴解凍1 3分鐘，然后在室溫下用含有1 2mol -Γ1蔗糖的MS培養液洗滌1 3次，每次5 IOmin ；或將所述莖尖直接放入含有1 2mol · L—1蔗糖的MS培養液解凍和洗滌5 lOmin。
所述培養的方法是在含有0. 3 0. 6mg · L—1 ΒΑ、0. 05 0. 15mg · L^1NAA和0. 3 0. 6mg · Γ1 GA3的MS半固體培養基中暗培養或弱光培養2 5天，至莖尖返綠并有萌動跡象時再轉入MS固體培養基中常光培養。若無特別指出，本發明中所涉及的溶液均為水溶液；本發明中涉及到的預冷或冰浴的溫度是指4°C左右。本發明提供的技術方案實現了香石竹的超低溫保存，該方法簡便易行，穩定可靠， 保存后香石竹恢復生長狀況良好，植株再生率可高達90%以上。


圖1是用于剝取莖尖的香石竹組培苗及剝取的莖尖；圖2是小液滴法處理后的香石竹莖尖；圖3是不同的玻璃化處理時間對香石竹超低溫保存成活率的影響，其中，橫坐標為玻璃化保護試劑處理的時間(min)，縱坐標為成活率(％)；圖4是不同凍存方式下恢復培養7天后的香石竹莖尖。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
實施例1香石竹的超低溫保存材料香石竹品種紅花品種，從上?；ɑ苁袌鲑徺I。切取花莖繁殖試管苗，獲得花莖無性繁殖系。預培養培養基含0. 4mol · Γ1蔗糖的MS固體培養基；預處理溶液含2mol · L—1甘油和0. 4mol · L—1蔗糖的MS液體培養基；玻璃化保護劑含有3. 26mol ·廠1 甘油、2. 42mol · Γ1 乙二醇、1. 9mol · L^lDMSO 和 0. 4mol · L—1蔗糖的溶液。方法選取上述香石竹品種的健壯組培苗，切取莖尖O 3mm)，于預培養培養基中4°C 下暗培養5天，將莖尖在預處理液中室溫下浸泡30min，然后轉入玻璃化保護劑中在4°C下處理60 80min，然后A 將莖尖轉移至裝有冰浴預冷的新鮮玻璃化保護劑的冷凍管中，每管裝10個莖尖，投入液氮中保存；B 含有1個莖尖的液滴(約5μ 1)滴在5mmX20mm的無菌鋁箔條上(圖幻，直接投入裝滿液氮的安瓿管中，再投入液氮中保存即可。再培養及存活率考察A 取冷凍管，立即放入40°C水浴中解凍2分鐘，莖尖在室溫下用含1. 2mol 蔗糖的MS培養液洗滌3次，每次5 IOmin ；B 直接將含液滴的鋁箔條投入含1 2mol · Γ1 蔗糖的MS培養液洗滌液中進行解凍及洗滌5 lOmin。洗滌后的莖尖用濾紙吸干，移至含 0. 5mg · Γ1 ΒΑ、0· Img · L-1 NAA和0. 5mg · L-1 GA3的MS半固體培養基中，暗培養3天，等莖尖返綠并有萌動跡象時再轉入MS固體培養基中，常規光照培養。結果表明，莖尖保存后香石竹新植株恢復生長狀況良好，植株再生率為95%。實施例2香石竹的超低溫保存預培養培養基中蔗糖濃度及預處理時間對保存效果的影響實驗材料的生理狀態對凍后存活率有著顯著影響。莖尖通過短期高濃度蔗糖預培養，使組織較緩和地脫去部分水分，同時促使細胞分泌保護物質，有利于凍后存活。通常的操作方法是切取較大莖尖組織預培養后，再切取適當大小莖尖進行超低溫保存。香石竹莖尖組織經切割后易褐化，再經高濃度的蔗糖預培養后，就會造成莖尖組織變軟，水漬化，給后面的剝取操作造成很大不便，莖尖也極易受損，并在其后的恢復培養中出現分化困難。故本發明技術方案改為先在解剖鏡下將莖尖仔細逐層剝去外層葉片，直至有1-2片護葉包圍莖尖，并切成適當大小(l-3mm，優選2-3mm)，經預培養后直接進行玻璃化處理。材料香石竹品種石竹科石竹屬紅花香石竹品種，從上海市花卉市場購買。切取花莖繁殖試管苗，獲得花托無性繁殖系。切取花托繁殖試管苗，獲得花莖無性繁殖系。預培養培養基蔗糖濃度富集的MS固體培養基，暗培養；預處理溶液含2mol · L—1甘油和0. 4mol · L—1蔗糖的MS液體培養基；玻璃化保護劑(PVS2)含有3. 26mol · Γ1 甘油、2. 42mol · L-1 乙二醇、1. 9mol · Γ1 DMSO 禾口 0. 4mol · L-1 蔗糖。方法選取上述香石竹品種的健壯組培苗，切取莖尖O 3mm)，在蔗糖濃度分別為 0. Imol · lAO. 3mol · Λθ· 5mol · Λθ· 7mol · L-1 的 MS 培養基中預培養 l、3、5、7d，用預處理液處理30min，再經PVS2冰浴處理80min，再轉移至裝有冰浴預冷的新鮮玻璃化保護劑的冷凍管中，每管裝10個莖尖，投入液氮中保存，同實施例1的方法A，凍存一周后進行恢復培養。再培養及存活率考察取冷凍管，立即放入40°C水浴中解凍2分鐘，莖尖在室溫下用含1. 2mol · L—1蔗糖的MS培養液洗滌3次，每次5 lOmin，洗滌后的莖尖用濾紙吸干，移至含0. 5mg · Γ1 ΒΑ、 0. Img · Γ1 NAA和0. 5mg · L—1 GA3的MS半固體培養基中，暗培養3天，等莖尖返綠并有萌動跡象時再轉入MS固體培養基中，常規光照培養。結果表明，莖尖保存后香石竹新植株恢復生長狀況隨預培養基中附加的蔗糖濃度而異出現顯著差異。結果顯示用添加0. 5mol -Γ1蔗糖的MS培養基預培養5天，成活率最高達88. 3% ；0. 3mol · Γ1的蔗糖預培養5天次之，0. 1 0. 5mol · Γ1蔗糖濃度下預培養3 天以上，成活率隨蔗糖濃度增加而增加，但蔗糖濃度高于0. 7mol · L—1，預培養時莖尖易褐變及水漬化，成活率均明顯下降。預培養時間大于7d時，成活率下降。表1蔗糖預培養濃度及預培養天數對成活率的影響
權利要求
1.一種香石竹的超低溫保存方法，其特征在于，包括以下步驟(1)切取香石竹組培苗的莖尖進行預培養；(2)預培養后的莖尖用含有1 3mol· L—1甘油和0. 2 0. 6mol · L—1蔗糖的MS液體培養基預處理20 40min ；(3)預處理后的莖尖轉入玻璃化保護劑中處理60 SOmin；(4)步驟C3)處理后的莖尖投入液氮中保存。
2.根據權利要求1所述的保存方法，其特征在于，所述步驟( 為預培養后的莖尖用含有2mol · L—1甘油和0. 4mol · L—1蔗糖的MS液體培養基預處理30min ；所述步驟(3)為預處理后的莖尖轉入玻璃化保護劑中處理SOmin。
3.根據權利要求1或2所述的保存方法，其特征在于，所述步驟(1)為將香石竹組培苗逐層剝去外層葉片，至剩余1 2片護葉包圍莖尖，切取1 3mm莖尖進行預培養。
4.根據權利要求1或2所述的保存方法，其特征在于，步驟(1)所述的預培養方法是將所述莖尖在含有0. 3 0. 5mol · Γ1蔗糖的MS固體培養基中，0 10°C暗培養1 5天。
5.根據權利要求1或2所述的保存方法，其特征在于，步驟C3)所述的玻璃化保護劑為 1 5mol Γ1 甘油、1 5mol · L-1 乙二醇、1 5mol · L-1 二甲基亞砜禾口 0. 1 0. 5mol · L-1 蔗糖組成的混合溶液。
6.根據權利要求5所述的保存方法，其特征在于，所述步驟(4)為將所述莖尖轉移到裝有預冷至0 5°C的玻璃化保護劑冷凍管中，每管裝有5 15個莖尖，再將所述冷凍管投入液氮中保存。
7.根據權利要求5所述的保存方法，其特征在于，所述步驟(4)為先將所述莖尖與 3 8μ 1玻璃化保護劑在無菌鋁箔條上形成小液滴，然后將所述鋁箔條投入充滿液氮的安瓿管中，最后再將所述安瓿管投入液氮中保存。
8.權利要求1-7任一項所述超低溫保存方法保存后的香石竹的再培養方法，其特征在于，先將超低溫保存的香石竹莖尖進行解凍和洗滌，再經過培養即可得到香石竹植株。
9.根據權利要求8所述的再培養方法，其特征在于，所述解凍和洗滌的過程為將所述莖尖放入35 50°C的水浴解凍1 3分鐘，然后在室溫下用含有1 2mol -L"1蔗糖的MS 培養液洗滌1 3次，每次5 IOmin ；或將所述莖尖直接放入含有1 2mol · Γ1蔗糖的 MS培養液解凍和洗滌5 IOmin。
10.根據權利要求8或9所述的再培養方法，其特征在于，所述培養的方法是在含有 0. 3 0. 6mg · L-1 ΒΑ、0· 05 0. 15mg · L-1 NAA 和 0· 3 0. 6mg · L-1 GA3 的 MS 半固體培養基中暗培養或弱光培養2 5天，至莖尖返綠并有萌動跡象時再轉入MS固體培養基中常光培養。
全文摘要
本發明涉及一種利用小液滴玻璃化法進行香石竹的超低溫保存方法，將香石竹莖尖進行預培養、預處理、玻璃化保護處理，最后投入液氮中超低溫保存。本發明還提供了一種超低溫保存后的香石竹的恢復培養方法。本發明提供的香石竹超低溫保存方法簡便易行，穩定可靠，保存后香石竹恢復生長狀況良好，植株再生率可高達90％以上。
文檔編號A01N3/00GK102379281SQ20111023512
公開日2012年3月21日 申請日期2011年8月16日 優先權日2011年8月16日
發明者劉灶長, 李天菲, 楊華, 林田, 羅利軍, 陳海榮 申請人:上海市農業生物基因中心