專利名稱：加快粳稻成熟種胚愈傷組織出愈速度提高出愈率和質量的方法
技術領域：
本發明涉及一種水稻基因工程中種胚愈傷組織的形成，尤其是一種加快粳稻成熟種胚愈傷組織出愈速度提高出愈率和質量的方法，屬于生物工程育種領域。
背景技術：
水稻是我國乃至全世界的主要糧食作物之一，世界一半以上人口以大米為主食， 因此，水稻在世界糧食生產和安全中起重要的作用。提高水稻產量和改善水稻品質一直是育種學家極其關注的問題。采用轉基因技術，將外源基因導入水稻，豐富水稻的基因型， 培養優質、高產、多抗新品種是現代水稻育種的發展方向，而建立高效而穩定的組織培養再生體系是進行轉基因育種的前提。幼穗、幼胚、花粉粒、花藥愈傷組織誘導率高，愈傷組織質量好而受到青睞被廣泛用于水稻的遺傳轉化、品種培育中。但上述材料多受季節限制，取材不便，阻礙了水稻組織培養的進一步發展。利用水稻成熟胚進行愈傷組織誘導后，進而具有材料來源廣、取材不受季節和地理環境限制、操作方便、不易污染等優點，因而被很多水稻生物技術工作者使用。有關粳稻成熟胚組織培養，多采用再生率較高的品種，如中花系列等。實際生產中真正推廣的一些主要品種植株再生成功報道不多，這些品種往往出愈率不高，可利用的基因型有限(李霞，閻麗娜，周月蘭.不同理化因子對蘇滬香粳成熟胚愈傷組織誘導的影響.江蘇農業學報，2008J4(增刊)40-44)。因此，研究對生產有重要價值和影響的粳稻品種的成熟胚組織的誘導技術，具有實際應用價值。通過不同培養基、不同激素類型及濃度對水稻成熟種胚愈傷組織誘導、分化進行了相關研究的報道很多(李玉靜，陳彥龍，王玲玲，趙頌民，朱正歌.2，4-D和6-BA對水稻愈傷組織培養力的影響.河北師范大學學報，2005，4 =395-398+403 ；王萍，李杰，王恩旭，王罡，季靜，徐大勇.水稻成熟胚愈傷組織的誘導與增殖研究.種子，2008，5 17-19 ；危曉薇，王冬梅，祖木熱木·吐爾遜， 水稻成熟胚愈傷組織誘導及其植株再生.新疆農業科學，2007,6:889-891)。由于不同品種的水稻遺傳背景差異很大，因此其成熟胚愈傷組織誘導培養基的激素比例有著較大的差異，對新品種的愈傷組織誘導更換新的激素比例。大量的研究發現，外界環境應力(如聲、光、電、磁和機械等)對作物的生長發育具有明顯的影響(李雪琦，申廣浩，漆家學，劉娟，王楠，超聲波的生物效應及其應用，2010， 6:32-36)。超聲波(頻率大于20 kHz彈性機械波)具有穿透力強、功率大和方向性好的特點，是一種重要的環境應力。超聲波對不同作物(植物組織)的刺激效應不同，在一種作物上表現為正向效應，而在另一種作物上可能表現為負向效應。頻率超過能聽到的聲波范圍 (5(Γ 2X104/秒)的聲波被稱為超聲波，其波長短于普通電波，可以在固體內部傳播。超聲波包括縱波和橫波兩種振動方式，質點振動方向與波的傳播方向一致的稱為縱波，垂直的稱為橫波，它們同時對物體產生影響，并很容易相互交換。產生超聲波的原理是當電壓加至具有伸縮特征的材料上時，材料就會按照電壓的正負和大小進行振動，產生超聲波。在儀器中超聲波產生的原理是一個短而持續時間的脈沖電壓去激勵換能器，從而產生短的超聲脈沖。通常用來作脈沖激勵源的電路是電容放電回路，并由換能器把電能轉變成超聲脈沖。 超聲波是一種彈性機械波，其生物性效應非常復雜，一般認為超聲波的生物學效應主要有機械作用、熱化作用以及空化作用。由于生物組織大多數屬于軟組織，因而在超聲波的機械力作用下，其細微結構發生形變。這種形變將隨著超聲波強度的增強而增大，當增加到一定強度時，細胞就會被擊穿。生物組織在超聲波機械能的作用下由于黏滯吸收，將一部分超聲轉化為熱能，使生物組織的溫度上升，稱為超聲波的熱化作用。在超聲波作用下，還會產生空化作用，表現出空泡湮滅過程。小泡內部產生高溫高壓，甚至產生電離效應及放電，推測這可能是導致空泡周圍細胞壁和質膜破損或可逆的質膜透性改變的主要機理，從而使細胞內外發生物質交換。超聲波的生物學效應根據不同的條件而會產生不同的結果。它即可以引起生物大分子甚至細胞的破壞，也可以促進生物大分子的合成和生物體的生長。這些條件包括超聲波處理的頻率、強度、作用時間和生物體的結構功能狀態。植物細胞經超聲波處理，出現了一致現象，即低劑量、短時間的溫和處理能明顯加速和誘導植物細胞的分裂， 刺激細胞生長，加速原生質體的蛋白合成；而處理時間延長，處理劑量加大則會造成負面的不可恢復的影響。目前，超聲波已經在提取此生代謝物，促進種子發芽率，提高轉基因效率等生物領域中得到廣泛的應用。目前在有關粳稻成熟胚組織培養，多采用再生率較高的品種，如中花系列等，而實際生產中真正推廣的一些主要品種成熟種胚愈傷組織往往出愈率不高，在水稻的遺傳轉化、品種培育中可利用的基因型有限，導致植株再生成功報道不多中。因此，研究對生產有重要價值和影響的粳稻品種的成熟胚組織和植株再生技術，具有實際應用價值。

發明內容
本發明的目的在于針對粳稻品種成熟種胚的愈傷組織出愈往往出愈率不高，在水稻的遺傳轉化、品種培育中可利用的基因型有限的實際問題，提供一種加快水稻成熟種胚愈傷組織出愈速度提高出愈率和質量的方法。本發明的目的是這樣實現的一種加快粳稻成熟種胚愈傷組織出愈速度提高出愈率和質量的方法，其特征在于在成熟種幼胚置于愈傷組織誘導培養基前，以頻率 27 29KHz，功率50W的超聲波對粳稻成熟種胚進行5 30分鐘的處理。在本發明中，所述的以頻率27 29KHz，功率50W的超聲波對粳稻成熟種胚進行 5 30分鐘的處理包括取表面潔凈的種子，剝去穎殼，用5%次氯酸鈉浸泡20min，無菌水沖洗5次，在超凈工作臺上晾干后，將粳稻種胚置于三角瓶并浸泡于植物組織培養液中，在超聲波振蕩器的內槽中振蕩5 30分鐘，浙干后用清水清洗5次，于滅菌的吸水紙上吸干后再置于愈傷組織誘導培養基上培養。本發明的優點在于由于在成熟種幼胚置于愈傷組織誘導培養基前，以超聲波對粳稻成熟種胚進行處理，可以快捷穩定的加快粳稻成熟種胚形成的時間，提高粳稻成熟種胚的質量，提高粳稻成熟種胚的出愈率。


圖1用超聲波對南粳44成熟種胚采用不同處理時間，其在愈傷組織誘導培養期間的出愈率；圖2用超聲波對南粳44成熟種胚采用不同處理時間，其在愈傷組織誘導培養12天的愈傷組織質量。圖3用超聲波對武育粳18成熟種胚采用不同處理時間，其在愈傷組織誘導培養期間的出愈率；
圖4用超聲波對武育粳18成熟種胚采用不同處理時間，其在愈傷組織誘導培養9天的愈傷組織質量。
具體實施例方式實施例1
1材料與方法試驗材料
以南粳44成熟種胚為材料，以昆山超聲波儀器廠出品的QB-50B型超聲波清洗器(超聲波頻率^KHz,超聲波功率50W)為儀器，進行試驗。植物組織培養液NB培養基(青島海博生物技術有限公司，貨號HB8681)， pH=5. 8。愈傷組織誘導培養基NB(青島海博生物技術有限公司，貨號HB8681)+2，4_D 2mg. L^+6-BA 0. 5mg mg. L^+CH (水解酪蛋白)0. 3g L-1+ 脯氨酸 2. 8g. L-1+ 蔗糖 30g. L_1+gelrite 2 g. L-1 ρΗ=5· 8。培養條件』8°C，光照16h/d，RH 70%。取表面潔凈的種子，剝去穎殼，5%次氯酸鈉浸泡20min，無菌水沖洗5次，超凈工作臺上晾干后，將水稻種胚置于含有NB液體培養液的三角瓶中，在超聲波振蕩器的內槽中振蕩，振蕩時間分為0分鐘、5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘5個處理，以0分鐘為對照組，其余均為實驗組。處理后用清水清洗5次，于滅菌的吸水紙上吸干后置于誘導培養基上培養， 分別于3天、6天、9天、12天記錄出愈率和出愈質量。每個處理18顆水稻成熟種胚，每個處理8次重復。2結果與分析統計方法與數據處理
出愈指數以愈傷塊的直徑衡量，分為若干等級直徑>10mm，為 ΠΙ級；5mm<直徑<10mm，為Π級；直徑<5mm為I級。愈傷組織指數=Σ (出愈數X愈傷級數)/(調查愈傷數X最高級數)X 100。2. 1超聲波處理對愈傷組織出愈時間的影響。由圖1可見，經過超聲波處理的成熟種胚的愈傷組織的出愈速度要快于對照。 對照9天所能達到的出愈率，超聲波處理在6天即可以達到。每個處理均在12d達到最大的出愈率，每個實驗組的出愈率均高于對照組，其中以超聲波處理20min所獲得的出愈率最高，可達90. 9%，對照組的出愈率僅為50. 7%。可見超聲波處理可以顯著提高南粳44成熟種胚的出愈率。由圖2可見，每個實驗組的愈傷組織指數均高于對照組，其中超聲波處理20分鐘SHI級愈傷的比例也達到10%，Π級愈傷比例為33% I級愈傷比例為47% ；而對照處理組中沒有ΠΙ級愈傷，Π級愈傷的比例僅為9%，I級愈傷42%，通過愈傷組織指數計算顯示，對照組的愈傷組織指數為19. 9%，各實驗組根據處理時間的不同，依次分別為27. 8%,36. 3%、 48. 3%和28. 2%，超聲波處理20分鐘的實驗組，愈傷組織指數由對照組的19. 9%提高到 48. 3%。由此表明超聲波處理在提高出愈率的同時，也可以加強愈傷組織的質量。實施例2 1材料與方法試驗材料
以武育粳18成熟種胚為材料，以昆山超聲波儀器廠出品的QB-50B型超聲波清洗器(超聲波頻率^KHz,超聲波功率50W)為儀器，進行試驗。植物組織培養液MS (青島海博生物技術有限公司，貨號HB8469)，pH=5. 8。愈傷組織誘導培養基:MS培養基(青島海博生物技術有限公司，貨號 HB8469)+2，4-D 2. 5mg. L_1+6-BA 0. 5mg mg. Γ1+ CH (水解酪蛋白)0. 3g Γ1+脯氨酸 2. 8g. L-1+ 蔗糖 30g. L^+gelrite 2 g. L-1 pH=5. 8。培養條件』8°C，光照16h/d，RH 70%
取表面潔凈的種子，剝去穎殼，5%次氯酸鈉浸泡20min，無菌水沖洗5次，超凈工作臺上晾干后，將水稻種胚置于含有MS培養基的三角瓶中，在超聲波振蕩器的內槽中振蕩，振蕩時間分為0分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、25分鐘和30分鐘7個處理，以0分鐘為對照組，其余均為實驗組。處理后用清水清洗5次，于滅菌的吸水紙上吸干后置于誘導培養基上培養，分別于3天、6天、9天記錄出愈率和出愈質量。每個處理15顆水稻成熟種胚，每個處理6次重復。2結果與分析統計方法與數據處理
統計方法和數據處理均按照與實施例1相同的標準。由圖3可見，經過超聲波處理的成熟種胚的愈傷組織的出愈速度要快于對照。每個處理均在9d達到最大的出愈率，每個實驗組的出愈率均高于對照組，其中以超聲波處理15min所獲得的出愈率最高，可達94. 4%，對照組的出愈率僅為66. 7%。可見超聲波處理可以顯著提高武育粳18成熟種胚的出愈率。由圖4可見，超聲波處理15分鐘，其ΠΙ級愈傷的出愈率達到47%，Π級愈傷為27%， I級愈傷為21% ；而對照處理組中HI級愈傷的出愈率為17%，Π級愈傷為33%，1級愈傷17%。 通過愈傷組織指數計算顯示，對照組的愈傷組織指數為44. 44%，各實驗組根據處理時間的不同，依次分別為45. 55%,54. 07%,71. 48%,66. 30%,53. 33% 和 45. 55%。超聲波處理 15 分鐘的實驗組，愈傷組織指數由對照組的44. 44%提高到71. 48%。由此表明超聲波處理在提高出愈率的同時，也可以加強愈傷組織的質量。通過以上實施例可以說明，在對粳稻成熟種胚進行組織培養時，不管選擇哪種粳稻品種的成熟種胚和哪種愈傷組織誘導培養基，只要在粳稻成熟種幼胚置于愈傷組織誘導培養基前，以頻率27 29ΚΗζ，功率50W的超聲波對粳稻成熟種胚進行5 30分鐘的處理，都可以不同程度加快成熟種胚愈傷組織的出愈速度，提高愈傷組織的質量和出愈率。以上各實施例不是對本發明的限制，只要根據權利要求的啟示，結合本領域的基本常識，采用與實施例相似的方法加快粳稻成熟種胚愈傷組織出愈速度提高出愈率和質量，均屬于本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種加快粳稻成熟種胚愈傷組織出愈速度提高出愈率和質量的方法，其特征在于 在成熟種幼胚置于愈傷組織誘導培養基前，以頻率27 29KHz，功率50W的超聲波對粳稻成熟種胚進行5 30分鐘的處理。
2.根據權利要求1所述的加快粳稻成熟種胚愈傷組織出愈速度提高出愈率和質量的方法，其特征在于所述的以頻率27 29KHz，功率50W的超聲波對粳稻成熟種胚進行5 30 分鐘的處理包括取表面潔凈的種子，剝去穎殼，用5%次氯酸鈉浸泡20min，無菌水沖洗5 次，在超凈工作臺上晾干后，將粳稻種胚置于三角瓶并浸泡于植物組織培養液中，在超聲波振蕩器的內槽中振蕩5 30分鐘，浙干后用清水清洗5次，于滅菌的吸水紙上吸干后再置于愈傷組織誘導培養基上培養。
全文摘要
本發明涉及一種利用超聲波促進粳稻成熟種胚愈傷組織形成的方法，其特征在于在成熟種幼胚置于愈傷組織誘導培養基前，以頻率27~29kHz，功率50W的超聲波對粳稻成熟種胚進行5~30分鐘的處理，可以不同程度加快成熟種胚愈傷組織的出愈速度，增強愈傷組織的質量，同時提高愈傷組織的出愈率。
文檔編號A01H4/00GK102415336SQ201110259350
公開日2012年4月18日 申請日期2011年9月5日 優先權日2011年9月5日
發明者叢郁, 宋志忠, 楊順瑛, 蘇彥華, 金曼 申請人:中國科學院南京土壤研究所