專利名稱：膀胱灌注大腸埃希氏菌構建慢性腎盂腎炎大鼠模型的方法
技術領域：
本發明涉及一種建立大鼠慢性腎盂腎炎模型的方法，用于模擬、研究和防止人類的慢性腎盂腎炎等醫學領域。
背景技術：
泌尿道感染時臨床常見病和多發病，其發病率根據我國普查統計，占到人口 0.91%，在婦女、兒童和老年人、HIV感染者、糖尿病及腫瘤等患者中均有很高的發病率。盡管當今抗病藥物研究迅速發展，品種不斷更新換代，泌尿道感染的發病率仍居高不下，且不斷面臨新的挑戰，抗病毒的濫用、免疫抑制劑的應用等導致一些原來非致病病毒引起的感染不斷增加。泌尿道感染按照解剖部位的不同，分為尿道炎、膀胱炎和腎盂腎炎。反復不斷感染，病情遷延，可發展為慢性腎盂腎炎，是一種較嚴重的形式，出尿道刺激癥狀外，還出現全身癥狀，而且常常由于用藥不規則，細菌極易產生多重耐藥性，晚期出現腎功能不全，可危及患者生命。據歐洲透析中心統計資料表明，慢性腎盂腎炎占整個慢性尿毒癥的 19. 8% 21. 2%，制作與人類泌尿道感染相似的動物模型，對探討慢性腎盂腎炎的發病機制和研究的治療方法十分必要，國外研究證實，有很多方法能夠造成慢性甚于腎炎動物模型，但是有些方法周期長，或者為豬、兔比較昂貴。目前，用大鼠為模型，制造慢性甚于腎炎的報道有，王俊生等(大鼠慢性甚于腎炎模型的建立及L-型菌的分離鑒定[J].中華腎臟病雜質，1990，6 17)在國內首先利用尿道直接接種細菌的方法，報道了 CPN大鼠模型，該方法并不能誘導腎臟外觀出現癲痕和固縮， 嚴格講并不成功。龔學忠等(慢性腎盂腎炎模型的建立[J]. 2004,26(4)391-393)按照Bitz 等的方法，延長觀察時間創建一種慢性腎盂腎炎大鼠模型，用不同濃度的致病性大腸桿菌株膀胱內注射，并短暫結扎左側輸尿管，觀察90天內腎臟形態學動態變化，結果發現隨著感染性炎癥的修復，左腎外觀有皮質癲痕及相關腎乳頭收縮和腎盞的擴張，鏡下慢性腎間質性腎炎改變和纖維化；細胞培養陽性結果主要在左腎和尿。因此，這些模型都不夠成熟。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種大鼠慢性腎盂腎炎模型，該模型的構建方法是通過給大鼠的膀胱灌注大腸埃希氏菌。為實現本發明的目的，本發明的技術方案為一種膀胱灌注大腸埃希氏菌構建慢性腎盂腎炎大鼠模型的方法，其特征在于，包括以下步驟將麻醉后的大鼠的尿道口用新潔爾滅酊消毒，取24G靜脈留置針，內置入鋼絲，形成15° -30°角，用石蠟油潤滑后，插入大鼠尿道口，成功置入導尿管于膀胱內3cm， 取出鋼絲，抽吸尿液，棄尿液后，換用Iml OT針筒注入大腸埃希氏菌懸液，然后退出導管，將大鼠放入鼠籠等待自然蘇醒。所述大腸埃希氏菌懸液的濃度為108-109CFU/100ul，每次注入量為 0.093-0. lml/100g。
3
所述大腸埃希氏菌溶液的由以下方法制備所得在無菌條件下，從-70°C冰箱取出Dffia大腸埃希氏菌菌種，挑起菌種接種在裝有LB培養基的無菌離心試管中，置于37cc 恒溫搖床，轉速150轉/分，IOh后，用分光光度儀測定大腸桿菌的濃度，保持濃度在IO8 IO9CFU/IOOul 濃度。
所述大鼠是正常清潔級SD雌性大鼠。
在本發明的一具體實施例中，給大鼠連續6周灌注大腸埃希氏菌溶液，一周2次。
在本發明的一具體實施例中，用腹腔內注射5%水合氯醛麻醉大鼠，其用量為 0.7ml/100g。
本發明通過給膀胱灌注大腸埃希氏菌構建的慢性腎盂腎炎大鼠模型，腎臟組織HE 染色后，其腎間質可見明顯漿細胞及淋巴細胞浸潤，并見少量中性粒白細胞浸潤，伴毛細血管充血擴張水腫。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發明。
實施例1
1、實驗動物
13月齡正常清潔級SD雌性大鼠20只，體重為200g_215g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院清潔級動物實驗中心常溫飼養，預養7天。
2、實驗試劑
大腸埃希氏菌0111B4(ATCC四522，中國藥品生物制品檢定所，批號44155)。
3、實驗分組
13月齡SD雌性SD大鼠，隨機分為2組，①對照組，η = 10只；②模型組，η = 10 只，各組體重無統計學差異。
4、模型方法
4. 1膀胱內灌注大腸埃希氏菌方法
(1)大腸埃希氏菌溶液的制備在無菌條件下，從_70°C冰箱取出Dffia大腸埃希氏菌菌種，挑起菌種接種在裝有5ml LB培養基的無菌離心試管中，置于37cc恒溫搖床，轉速 150轉/分。IOh后，用分光光度儀測定大腸桿菌的濃度，保持濃度在IO8 109CFU/100ul 濃度。
(2)膀胱內灌注細菌懸液予SD大鼠每周灌注大腸埃希氏菌溶液，一周2次，連續 6周。予5%水合氯醛(0.7ml/100g)腹腔內注射麻醉10只大鼠，新潔爾滅酊消毒大鼠尿道口，取24G靜脈留置針，內置入鋼絲，形成15° -30°角，用石蠟油潤滑后，插入大鼠尿道口， 成功置入導尿管于膀胱內3cm，取出鋼絲，抽吸尿液，棄尿液后，換用Iml OT針筒注入0. 2ml 108-109CFU/100ul大腸埃希氏菌懸液，然后退出導管，將大鼠放入鼠籠等待自然蘇醒。
4. 2標本獲取
灌注大腸埃希氏菌共計6周后，每只雌性SD大鼠腹腔內注射0. 7ml/100g 5%水合氯醛，將之置于解剖臺上，新潔爾滅酊消毒腹部，用手術剪逐層打開腹腔，游離腎臟，將腎臟置入10%福爾馬林溶液中。最后大鼠被引頸椎處死。
4. 3腎臟組織HE染色腎臟用10%福爾馬林固定Mh，常規梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，超薄切片，常規脫蠟，蘇木精染色，鹽酸乙醇分化，伊紅復染，梯度乙醇脫水，中性樹脂封片。光鏡下觀察腎臟病理變化。5、實驗結果光鏡下觀察大鼠腎臟病理切片HE染色情況(見表1)，對照組正常，無炎癥細胞浸潤。而模型組大鼠的腎間質可見明顯漿細胞及淋巴細胞浸潤，并見少量中性粒白細胞浸潤， 伴毛細血管充血擴張水腫。表1:腎臟HE染色表現
分組_η_炎癥情況_對照組10-
模型組_10_++ ~ +++_注-陰性。+腎間質少量淋巴細胞及單核細胞浸潤，毛細血管輕度充血水腫。++腎間質中量淋巴細胞及單核細胞浸潤，毛細血管充血水腫。+++腎間質大量淋巴細胞及單核細胞浸潤，毛細血管重度充血水腫。
權利要求
1.一種膀胱灌注大腸埃希氏菌構建慢性腎盂腎炎大鼠模型的方法，其特征在于，包括以下步驟將麻醉后的大鼠的尿道口用新潔爾滅酊消毒，取24G靜脈留置針，內置入鋼絲， 形成15° -30°角，用石蠟油潤滑后，插入大鼠尿道口，成功置入導尿管于膀胱內3cm，取出鋼絲，抽吸尿液，棄尿液后，換用Iml OT針筒注入大腸埃希氏菌懸液，然后退出導管，將大鼠放入鼠籠等待自然蘇醒。
2.根據權利要求1所述的膀胱灌注大腸埃希氏菌構建慢性腎盂腎炎大鼠模型的方法，其特征在于，所述大腸埃希氏菌懸液的濃度為108-109CFU/100ul，每次注入量為 0.093-0. lml/100g。
3.根據權利要求1所述的膀胱灌注大腸埃希氏菌構建慢性腎盂腎炎大鼠模型的方法， 其特征在于，用腹腔內注射5%水合氯醛麻醉大鼠，其用量為0. 7ml/100g。
4.根據權利要求1所述的膀胱灌注大腸埃希氏菌構建慢性腎盂腎炎大鼠模型的方法， 其特征在于，給大鼠連續6周灌注大腸埃希氏菌溶液，一周2次。
5.根據權利要求1所述的膀胱灌注大腸埃希氏菌構建慢性腎盂腎炎大鼠模型的方法， 其特征在于，所述大腸埃希氏菌溶液的由以下方法制備所得在無菌條件下，從-70°C冰箱取出Dffia大腸埃希氏菌菌種，挑起菌種接種在裝有LB培養基的無菌離心試管中，置于37cc 恒溫搖床，轉速150轉/分，IOh后，用分光光度儀測定大腸桿菌的濃度，保持濃度在IO8 IO9CFU/IOOul 濃度。
6.根據權利要求1所述的膀胱灌注大腸埃希氏菌構建慢性腎盂腎炎大鼠模型的方法， 其特征在于，所述大鼠是正常清潔級SD雌性大鼠。
全文摘要
一種膀胱灌注大腸埃希氏菌構建慢性腎盂腎炎大鼠模型的方法，包括以下步驟連續6周，一周2次，將麻醉后的大鼠的尿道口用新潔爾滅酊消毒，取24G靜脈留置針，內置入鋼絲，形成15°-30°角，用石蠟油潤滑后，插入大鼠尿道口，成功置入導尿管于膀胱內3cm，取出鋼絲，抽吸尿液，棄尿液后，換用1ml OT針筒注入濃度為108～109CFU/100ul的大腸埃希氏菌懸液，然后退出導管，將大鼠放入鼠籠等待自然蘇醒；本方法建構的慢性腎盂腎炎大鼠模型，其腎臟病理切片HE染色后，腎間質可見明顯漿細胞及淋巴細胞浸潤，并見少量中性粒白細胞浸潤，伴毛細血管充血擴張水腫。
文檔編號A61D7/00GK102499786SQ20111036168
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月15日 優先權日2011年11月15日
發明者王怡, 陳敏, 顧向晨 申請人:王怡