專利名稱：一種利用秋水仙堿選育楊樹四倍體植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物四倍體植株的誘導(dǎo)方法，尤其涉及一種利用秋水仙堿誘導(dǎo)楊樹合子染色體加倍選育四倍體的方法，屬于植物遺傳育種領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物四倍體植株可采取異倍體雜交或者理化處理誘導(dǎo)種子、芽、幼胚或合子等體細(xì)胞染色體加倍途徑獲得。
與傳統(tǒng)利用種子、芽、幼胚、愈傷組織等體細(xì)胞染色體加倍獲得植物四倍體相比， 合子染色體加倍是植物四倍體選育最為理想的途徑。主要表現(xiàn)在(1)合子作為一個單一細(xì)胞，合子染色體加倍后形成純合四倍體，而不易形成混倍體或嵌合體植株；( 植物合子的形成基于有性雜交過程，配子形成過程中所經(jīng)歷的染色體重組使得雌雄配子融合后產(chǎn)生的每個合子均具有不同的基因型，進(jìn)而由合子染色體加倍所獲得的每株四倍體都具有不同基因型，從而通過一次加倍試驗即可完成多基因型四倍體選育，為品種選育提供豐富的候選種質(zhì)。
秋水仙堿被公認(rèn)為誘導(dǎo)植物多倍體最好的誘變劑。目前，利用秋水仙堿處理誘導(dǎo)楊樹合子染色體加倍已經(jīng)在銀白楊(Populus alba)和青楊派樹種中成功獲得四倍體植株 (Mashkina OS, Burdaeva LM, N，yunova LN. Experimental mutagenesis and polyploidy in breeding forest trees. Lesnaya Genetika，1989，136-137 ；王君，康向陽，石樂，等·理化處理誘導(dǎo)合子染色體加倍選育青楊派雜種四倍體.北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，32 (5) 63-66)。然而，這些研究均是通過秋水仙堿浸泡處理，由于楊樹授粉后的雌花序較為巨大， 需要將其置于一個較大的容器類實施浸泡，導(dǎo)致秋水仙堿溶液耗費巨大，并且造成大量浪費，加重了生產(chǎn)成本。此外，包被合子的胚珠位于子房內(nèi)，施加秋水仙堿進(jìn)行浸泡處理，需要等待秋水仙堿滲透子房壁的過程，往往導(dǎo)致處理時機(jī)延遲，不能準(zhǔn)確地楊樹受精后合子的第一次有絲分裂時期進(jìn)行誘導(dǎo)處理，使得誘導(dǎo)處理的時機(jī)不精確、誘導(dǎo)處理時間延長，導(dǎo)致誘導(dǎo)效率低，四倍體誘導(dǎo)效果不穩(wěn)定。因此，解決秋水仙堿誘導(dǎo)楊樹合子染色體加倍，選育四倍體的第一次有絲分裂處理時期以及相關(guān)技術(shù)問題，形成合子染色體加倍選育四倍體誘導(dǎo)技術(shù)的重點，對于實現(xiàn)秋水仙堿誘導(dǎo)楊樹合子染色體加倍選育四倍體的穩(wěn)定性和高效率，以及將該方法引入其它植物的四倍體誘導(dǎo)等具有重要的實際價值。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是確定秋水仙堿誘導(dǎo)楊樹合子染色體加倍選育四倍體植株的有效處理時期以及處理條件，并且提供一種系統(tǒng)而高效的秋水仙堿誘導(dǎo)楊樹合子染色體加倍選育楊樹四倍體植株的方法，該方法處理誘導(dǎo)楊樹四倍體方法具有相對準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性、高效性，顯著減少秋水仙堿使用量，降低實驗成本，并且克服藥劑作用延遲問題，提高四倍體誘導(dǎo)效果。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的
一種選育楊樹四倍體植株的方法，包括用楊樹父本的花粉對楊樹母本的雌花序進(jìn)行授粉，形成果序；用秋水仙堿溶液處理授粉后雌花序的果序，誘導(dǎo)合子染色體加倍；待種子成熟后，收集種子，播種育苗，檢測子代倍性水平，獲得四倍體植株；其中，用秋水仙堿溶液處理果序誘導(dǎo)合子染色體加倍的方式是將秋水仙堿溶液注射到果序的子房中。
所述的楊樹母本優(yōu)選為小葉楊(Populus simonii)、小青楊(P. pseudo-simonii)、 歐洲黑楊(P. nigra)、美洲黑楊(P. deltoides)或哲引 3 號楊(P. pseudo-simonii XP. nigra ‘Zheyin3#’)等子房較大的楊屬樹種，更優(yōu)選為哲引3號楊；所述的父本優(yōu)選為小青楊、小葉楊、歐洲黑楊、美洲黑楊或北京楊(P. Xbeijingensis)等與相應(yīng)母本雜交親和的樹種，更優(yōu)選是北京楊。
優(yōu)選地，所述的注射處理方式為采用秋水仙堿溶液注射楊樹子房3-5次，相鄰兩次注射間隔時間為3-4小時；每子房注射30-40微升，以溶液滲出子房為限。
所述的秋水仙堿溶液的重量百分比濃度優(yōu)選為0. 3-0. 5%，更優(yōu)選為0. 3%。
本發(fā)明人結(jié)合石蠟切片等技術(shù)手段最終發(fā)現(xiàn)，當(dāng)楊樹授粉后第7-8天，此時楊樹果序子房內(nèi)合子進(jìn)入第一次有絲分裂過程，此時為注射秋水仙堿誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)合子染色體加倍的最佳時機(jī)，秋水仙堿溶液直接注射入楊樹授粉后的子房內(nèi)，使藥劑直接進(jìn)入到子房內(nèi)與胚珠接觸，而無需經(jīng)過滲透子房壁的緩慢過程，提高了誘導(dǎo)處理的時效性和四倍體誘導(dǎo)效果；同時顯著減少秋水仙堿使用量，降低生產(chǎn)成本。尤其是授粉后第8天時進(jìn)行注射處理獲得了較高的四倍體得率，有效擴(kuò)展了獲得四倍體的處理材料范圍，延長了可施加處理的時間范圍，使得施加處理效果更加穩(wěn)定，易于掌握。
至于確定子房內(nèi)部絮狀纖維發(fā)育至何種狀況或形態(tài)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過肉眼觀察進(jìn)行確定，也可借助放大鏡等工具進(jìn)行觀察并確認(rèn)，這些方式均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟練掌握。
所述的以子房內(nèi)絮狀纖維發(fā)育狀態(tài)作為參照判別合子發(fā)育時期，按照中國發(fā)明專利(專利號ZL 200910086773. 5 ；發(fā)明名稱一種楊樹四倍體植株的誘導(dǎo)方法；授權(quán)公告號:CN101595841B ；授權(quán)公告日2010. 09. 29)中公開的方法進(jìn)行判別。
所述的收集種子、播種育苗主要包括土壤滅菌、種子點播、苗木管理與移栽等環(huán)節(jié)，這些技術(shù)手段都為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
所述的子代倍性水平檢測可以采用體細(xì)胞染色體鏡檢、流式細(xì)胞分析等技術(shù)，這些技術(shù)手段都為本領(lǐng)域技術(shù)人員所通曉。
本發(fā)明在楊樹合子染色體加倍有效處理時期內(nèi)，將秋水仙堿注射到果序子房內(nèi)誘導(dǎo)合子染色體加倍，與傳統(tǒng)秋水仙堿浸泡處理相比，本發(fā)明方法可顯著提高楊樹四倍體誘導(dǎo)效率，提高四倍體誘導(dǎo)穩(wěn)定性，增強(qiáng)施加誘導(dǎo)劑的時效性，同時減少秋水仙堿使用量，降低生產(chǎn)成本，能有效克服藥劑作用延遲問題，四倍體誘導(dǎo)效果好。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
實施例1
本發(fā)明方法中楊樹合子染色體加倍處理時期按照中國發(fā)明專利(專利號ZL 200910086773. 5 ；發(fā)明名稱一種楊樹四倍體植株的誘導(dǎo)方法；授權(quán)公告號 CN101595841B ；授權(quán)公告日=2010. 09. 29)中公開的方法進(jìn)行判別。具體如下
以‘哲引3號楊’ X ‘北京楊’為例，采用‘北京楊’花粉對‘哲引3號楊’授粉，對授粉后一定時期的果序用FAA (V (70%乙醇)V (乙酸)V (38%甲醛)=90 5 5) 進(jìn)行固定，并觀察子房內(nèi)部絮狀纖維發(fā)育狀態(tài)，通過常規(guī)石蠟切片觀察合子發(fā)育進(jìn)程，由于其發(fā)育存在一定的不同步性，對大量胚珠內(nèi)合子發(fā)育進(jìn)行統(tǒng)計，表明‘哲引3號’楊子房內(nèi)絮狀纖維的發(fā)生、發(fā)育與其雙受精及合子發(fā)育進(jìn)程存在密切關(guān)系。當(dāng)子房內(nèi)絮狀纖維開始包裹胚珠，但尚未充滿整個子房室時，多數(shù)合子進(jìn)入第一有絲分裂過程。
以子房內(nèi)絮狀纖維發(fā)育狀態(tài)為參照，‘哲引3號楊’ X ‘北京楊’合子處于有效處理時期，即當(dāng)授粉后‘哲引3號楊’雌花序子房內(nèi)的絮狀纖維開始包裹胚珠基部(此時為授粉后的第7天)和子房內(nèi)的絮狀纖維進(jìn)一步包裹胚珠的中部但尚未完全覆蓋胚珠(此時為授粉后的第8天)時，對雌花序上各子房施加秋水仙堿進(jìn)行注射處理，具體的處理方法是 利用微量注射器向雌花序上各子房注射重量百分比濃度為0. 3%的秋水仙堿溶液，共注射 3次，每次注射間隔3-4小時，每子房注射30-40微升，以溶液滲出子房為限，平均每處理1 個花序耗費秋水仙堿溶液約2mL ；處理結(jié)果在上述時期對雌花序上子房進(jìn)行秋水仙堿溶液注射處理，總共誘導(dǎo)獲得了 6株楊樹四倍體植株(表1)。
此外，為證明注射法處理技術(shù)的優(yōu)越性，同時進(jìn)行了秋水仙堿浸泡處理試驗，具體處理方法是采用重量百分比濃度為0. 3%的秋水仙堿溶液浸泡授粉后7天、8天的果序M 小時，平均每處理1個花序耗費秋水仙堿溶液30-40mL ；處理結(jié)果僅在授粉后7天的進(jìn)行秋水仙堿浸泡處理的獲得2株四倍體；對授粉后8天的雌花序上子房的果序進(jìn)行浸泡誘導(dǎo)， 沒有獲得四倍體植株(表1)。
對試驗結(jié)果采用方差分析，表明注射法處理誘導(dǎo)楊樹四倍體的效果顯著優(yōu)于浸泡法處理(F = 14. 556，P = O. 032)。
當(dāng)果序子房內(nèi)的絮狀纖維完全覆蓋株柄并開始伸長至胚珠時(此時為授粉后的第6天)；或者是當(dāng)子房內(nèi)的絮狀纖維包裹大部分胚珠，但尚未完全覆蓋時(此時為授粉后的第9天)，在上述時期內(nèi)對子房施加秋水仙堿注射處理，處理結(jié)果未獲得一株楊樹四倍體植株。
表1秋水仙堿注射處理授粉后哲引3號楊子房誘導(dǎo)合子染色體加倍
權(quán)利要求
1.一種利用秋水仙堿選育楊樹四倍體植株的方法，包括如下步驟用楊樹父本的花粉對楊樹母本的雌花序進(jìn)行授粉，形成果序；用秋水仙堿溶液處理授粉后雌花序的果序誘導(dǎo)合子染色體加倍；待種子成熟后，收集種子，播種育苗，檢測子代倍性水平，獲得四倍體植株；其特征在于，所述用秋水仙堿溶液處理果序誘導(dǎo)合子染色體加倍的方式是將秋水仙堿溶液注射到果序的子房內(nèi)。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于授粉后第7-8天，將秋水仙堿溶液注射到果序的子房內(nèi)。
3.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于授粉后第8天，將秋水仙堿溶液注射到果序的子房內(nèi)。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的注射是對授粉后的楊樹子房注射秋水仙堿3-5次，相鄰兩次注射間隔時間為3-4小時。
5.按照權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征在于所述的注射為每子房注射30-40微升秋水仙堿溶液。
6.按照權(quán)利要求1-4任何一項所述的方法，其特征在于所述的秋水仙堿溶液的重量百分比濃度為0. 3-0.5%。
7.按照權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述的秋水仙堿溶液的重量百分比濃度為 0. 3%。
8.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的楊樹母本選自小葉楊(Populus simonii)、小青楊(P. pseudo-simonii)、歐洲黑楊(P. nigra)、美洲黑楊(P. deltoides)或哲引3號楊(P. pseudo-simonii XP. nigra ‘Zheyin3#’ )；所述的楊樹父本選自小青楊、小葉楊、歐洲黑楊、美洲黑楊或北京楊(P. Xbeijingensis) 0
9.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的楊樹父本是北京楊 (P. Xbeijingensis)；所述的楊樹母本是哲引 3 號楊(P. pseudo-simonii XP. nigra 'Zheyir^ft，)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種秋水仙堿處理誘導(dǎo)楊樹合子染色體加倍選育四倍體的方法，屬于植物遺傳育種領(lǐng)域。本發(fā)明方法包括用楊樹父本的花粉對楊樹母本的雌花序進(jìn)行授粉，以子房內(nèi)絮狀纖維發(fā)育狀態(tài)作為參照判別合子發(fā)育時期，適時對授粉后雌花序施加重量百分比濃度為0.3-0.5％的秋水仙堿溶液注射處理子房，注射3-5次，每次間隔3-4小時，每子房注射30-40微升秋水仙堿溶液，處理結(jié)束后繼續(xù)水培雌花枝，待種子成熟后，收集種子，播種育苗，檢測子代倍性水平，獲得四倍體植株。該發(fā)明與傳統(tǒng)秋水仙堿浸泡處理相比，可顯著提高楊樹四倍體誘導(dǎo)效率，提高四倍體誘導(dǎo)穩(wěn)定性，增強(qiáng)施加誘導(dǎo)劑的時效性，同時減少秋水仙堿使用量，降低生產(chǎn)成本。
文檔編號A01H1/02GK102524056SQ201110404229
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月7日
發(fā)明者康向陽, 李赟, 王君, 石樂 申請人:北京林業(yè)大學(xué)