專利名稱：水稻雄性不育株系種子的制備方法、繁種方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的種子的制備方法、繁種方法及其應(yīng)用，具體涉及的是一種水稻雄性不育株系種子的制備方法、繁種方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻雄性不育系，是指一種雄性生殖器官發(fā)育異常或退化(主要是花藥或花粉退化)但雌蕊生殖器官發(fā)育正常的母本水稻材料，由于花藥或花粉早期發(fā)育異常造成無花粉型或無生活力花粉，不能自花授粉結(jié)實，只有依靠外來花粉才能受精結(jié)實，因此借助這種母水稻作為遺傳工具，通過人工輔助授粉的方法，就能產(chǎn)生大量雜交種子。
從育種戰(zhàn)略上看，雜交水稻的發(fā)展可以分為三系法、兩系法和一系法三個發(fā)展階段。每進入一個新階段，都是育種上的一次突破，從而會把水稻的產(chǎn)量提高到一個新臺階。三系雜交水稻的研究成功及其在生產(chǎn)上的廣泛應(yīng)用，為我國的糧食生產(chǎn)做出了巨大貢獻。但由于受到細胞質(zhì)生物遺傳方面的制約，三系雜交水稻的研究近年來并沒有取得很大突破性的進展。自從兩用核不育系發(fā)現(xiàn)以后，雜交水稻的產(chǎn)量水平又產(chǎn)生了一個新的飛躍。超級雜交水稻的研究成功并在生產(chǎn)上大面積試種，表明兩系法比三系法具有更高的生長優(yōu)勢和增產(chǎn)潛力。迄今，其中已獲成功的是以利用光、溫敏核不育系作為遺傳工具的兩系法雜交水稻。光溫敏兩系雜交水稻不需要保持系，種子生產(chǎn)簡單，生產(chǎn)成本低，而且兩系雜交稻親本間無恢復(fù)系與保持系的限制，可以自由組合，降低了選育的時間、調(diào)高了選育優(yōu)質(zhì)組合的幾率。我國的兩系法雜交水稻現(xiàn)已開始進入生產(chǎn)應(yīng)用，大量的試驗和生產(chǎn)示范證明，它一般要比同熟期的三系雜交稻增產(chǎn)5-10 %，因此，兩系雜交水稻大有發(fā)展前途。兩系法具有配組自由、種子生產(chǎn)成本低、無不育細胞質(zhì)負效應(yīng)、易轉(zhuǎn)育新不育系等優(yōu)點；但光溫敏核不育系一系兩用，其育性受光溫條件所左右，育性不穩(wěn)定，易產(chǎn)生波動，制種和繁殖都存在一定的風險。如何有效地防止夏季異常低溫對光溫敏核不育系育性的影響已成為我國兩系雜交稻生產(chǎn)必須解決的一個重要課題。選育實用的光、溫敏核不育系是發(fā)展兩系雜交水稻的前提。所謂實用，有兩點要求，一是在制種時其不育性很穩(wěn)定，不出現(xiàn)育性波動而發(fā)生自交結(jié)實現(xiàn)象；二是在繁殖時，育性恢復(fù)正常，有較高的自交結(jié)實產(chǎn)量。目前國內(nèi)外育成的光溫敏雄性不育系，其核不育基因來源于粳型農(nóng)墾58S、秈型安農(nóng)S-1、5460S、衡農(nóng)S-1、新光S、株IS等；這些材料遺傳背景較復(fù)雜，不育起點溫度“漂變”即育性遺傳不穩(wěn)定；在自然條件下按常規(guī)方法繁殖時，隨著世代數(shù)的增加溫敏核不育系的起點溫度整體水平逐步提高。其原因主要是溫敏型核不育系，群體內(nèi)個體間的起點溫度存在差異，如果不采取有效措施加以防止，不育系將很快因為連續(xù)多年自交繁殖導(dǎo)致起點溫度的升高，而喪失使用價值。在進行雜種種子生產(chǎn)時，易受不穩(wěn)定的氣溫影響，使育性發(fā)生波動不穩(wěn)，導(dǎo)致種子純度下降，甚至于報廢。因此這類材料幾乎無使用價值。這一問題的出現(xiàn)嚴重影響了兩系雜交水稻的應(yīng)用前景，是兩系雜交水稻進一步推廣和應(yīng)用的一大障礙。另一方面，不育起點溫度低的溫敏不育系，在夏季制種時雖無育性波動，但其自身繁殖的產(chǎn)量則低而不穩(wěn)，有時甚至失敗，因為它們恢復(fù)可育的溫度范圍很狹窄，一般僅:TC左右，因此這類材料的應(yīng)用亦受到很大的限制。因此新型兩系不育系的育種目標是育成光照、溫度雙因子共同控制育性以光照為主的新型光溫敏核不育系，即在不育期間單因子低溫不能影響育性轉(zhuǎn)變，哪怕氣溫再低，持續(xù)時間再長，也能保持穩(wěn)定不育。只有在光照和溫度兩個條件同時滿足時，控制花粉發(fā)育的啟動子才被啟動，育性逐漸平穩(wěn)地由不育轉(zhuǎn)化為可育。由于不育性受兩個氣候因子共同控制，起到了雙保險作用，可確保制種的絕對安全。對該發(fā)育過程中關(guān)鍵調(diào)控基因的研究和利用將大大加速這一目標的實現(xiàn)
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中水稻育種存在的不足，提供一種水稻雄性不育株系的生產(chǎn)、繁種方法、及其雜交育種中的用途。本發(fā)明的種子能夠?qū)崿F(xiàn)一系兩用，即0Sms4在長光照條件下為正常可育繁殖種子，在短光照條件下作為不育系，用于雜交稻生產(chǎn)，因而簡化了雜交水稻種子生產(chǎn)程序。解決溫敏為主水稻不育系雜交制種過程中由于溫度變化產(chǎn)生的“漂移現(xiàn)象”。本發(fā)明是通過以下的技術(shù)方案實現(xiàn)的，第一方面，本發(fā)明提供了一種水稻雄性不育株系種子的制備方法，包括如下步驟采用常規(guī)方法將水稻種子中的0SMS4基因序列發(fā)生突變，使得0sMS4基因的表達量下降或不表達，進而獲得隱性純合0sMS4基因突變的水稻雄性不育株系種子。優(yōu)選地，所述常規(guī)方法包括物理、化學(xué)或者生物學(xué)上常規(guī)的基因突變方法。進一步優(yōu)選地，所述常規(guī)方法為生物學(xué)上常規(guī)的基因突變方法。進一步優(yōu)選地，所述0sMS4基因序列發(fā)生改變?yōu)樗?sMS4基因序列突變?yōu)槿鏢EQID NO. 2所示的序列。第二方面，本發(fā)明提供了一種水稻雄性不育株系的繁種方法，包括如下步驟培育第一方面所述方法獲得的種子，在水稻雄性不育株系的幼穗發(fā)育期，保持平均溫度為26 32°C，光照條件為每天光照時間彡13. 5小時，光照天數(shù)彡2天，所述水稻雄性不育株系表現(xiàn)為可育，進而能夠進行繁種，獲得水稻種子。優(yōu)選地，所述包括如下步驟培育前述方法獲得的種子，在水稻雄性不育株系的幼穗發(fā)育期，保持平均溫度為25 35°C，每天光照時間> 14小時，所述水稻雄性不育株系表現(xiàn)為可育，進而能夠進行繁種，獲得水稻種子。優(yōu)選地，所述幼穗的發(fā)育期為4 6期，保持溫度為30 32°C，光照條件為每天光照時間為14小時，光照天數(shù)為15天。優(yōu)選地，所述幼穗的發(fā)育期為4 5期，保持平均氣溫彡30°C，每天光照時間彡14小時。第三方面，本發(fā)明提供了一種如前面所述方法獲得的水稻雄性不育株系種子在水稻雜交育種的用途。優(yōu)選地，所述用途包括如下步驟培育前述方法獲得的種子，在所述水稻雄性不育株系的幼穗發(fā)育期，常規(guī)溫度下保持每日光照條件< 13小時，所述水稻雄性不育株系表現(xiàn)為不育，之后采用常規(guī)方法實施水稻雜交育種。優(yōu)選地，所述用途包括如下步驟培育前述方法獲得的種子，在所述水稻雄性不育株系的幼穗發(fā)育期的4 5期，平均氣溫< 28°C，光照時間< 13小時，所述水稻雄性不育株系表現(xiàn)為不育，之后采用常規(guī)方法實施水稻雜交育種。
第四方面，本發(fā)明還提供了一種能夠轉(zhuǎn)移不育性的水稻雄性不育株系種子的生產(chǎn)方法，包括如下步驟將前述方法獲得的種子進行培育，之后與常規(guī)水稻材料進行雜交，將0sMS4基因的突變序列引入常規(guī)水稻材料中，繁種，進而得到常規(guī)水稻材料的雄性不育株系種子。本發(fā)明的有益效果如下I、在水稻種植季節(jié)的氣候條件下(平均溫度25°C以上)，通過控制水稻栽培時間來調(diào)節(jié)水稻生殖生長(開花、產(chǎn)生花粉過程)的光照時間，可以控制本發(fā)明水稻雄性不育株系，即0sms4植株的可育和不育，實現(xiàn)一系兩用，即0sms4在長光照條件下為正常可育繁殖種子，在短光照條件下作為不育系，用于雜交稻生產(chǎn)，因而簡化了雜交水稻種子生產(chǎn)程序，解決溫敏為主水稻不育系雜交制種過程中由于溫度變化產(chǎn)生的“漂移現(xiàn)象”；2、本發(fā)明的水稻0sms4不育系配組自由，選到優(yōu)良組合的機率極大的超過了三系法。避免了不育細胞質(zhì)對雜種優(yōu)勢的負效應(yīng)和細胞質(zhì)的單一化；3、本發(fā)明水稻雄性不育株系和其它水稻材料雜交后，能夠?qū)?sms4基因突變引入其它水稻材料，這些含有0sms4純合突變的材料也會出現(xiàn)長光照可育，短光照不育的表型，能夠用來進行兩系雜交水稻育種。


圖I為本發(fā)明效果示意圖。其中圖IA為粳稻9522去內(nèi)外稃花表型圖；圖IB為osms4不育株去內(nèi)外稃花表型圖；圖IC為0sMS4基因組DNA表達載體轉(zhuǎn)化osms4不育株去內(nèi)外稃花表型圖；圖ID為0sMS4RNAi表達載體轉(zhuǎn)化粳稻9522植株去內(nèi)外稃花表型圖；圖IE為光溫敏不育株osms4去內(nèi)外稃花表型圖；圖IF為粳稻9522花粉粒I2-IK染色圖；圖IG為0sms4不育株花粉粒I2-IK染色圖；圖IH為0sMS4基因組DNA表達載體轉(zhuǎn)化osms4不育株花粉粒I2-IK染色圖；圖II為0sMS4RNAi表達載體轉(zhuǎn)化粳稻9522植株花粉粒I2-IK染色圖；圖IJ為光溫敏不育株osms4花粉粒I2_IK染色圖；圖IA到圖IE的圖標等于2暈米；圖IF到圖IJ的圖標等于100微米。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook 等分子克隆實驗室手冊(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例I、水稻雄性不育株系的生產(chǎn)方法
I、水稻雄性不育株系的獲得取常規(guī)的水稻材料，即粳稻9522種子。采用6tlCo Y射線進行照射，處理劑量為280Gy，獲取誘變材料。對誘變材料的F2代中的一株雄性不育突變體進行三代回交，獲得隱性單基因調(diào)控的穩(wěn)定遺傳的水稻突變體osms4。之后將水稻突變體0sms4與粳稻9522回交，F(xiàn)l代全部為可育。自交F2代中出現(xiàn)分離，其中正常植株為419，突變株為126，正常植株與突變植株比例接近3 Kx2 = 1.028,P > 0. 05)，表明該雄性不育突變體表型由一個單核基因突變造成。2、確定水稻雄性不育株系的突變位點
2. I、定位群體將第I步獲得的水稻0sms4突變體與秈稻品系龍?zhí)馗雜交，自交獲得F2代，選擇其中為雄性不育植株為定位群體。2. 2、水稻 DNA 提取采用改進的CTAB法進行雄性不育植株的DNA提取。步驟如下取雄性不育植株葉片0. 1-0. 2克(約半片)放到小研缽中，加入適量的液氮，立刻研磨至粉狀，裝入2ml離心管，加入700ul 100°C預(yù)熱的I. 5xCTAB溶液于離心管中，小心混勻后放入56°C水浴，20分鐘后取出離心管，加入等體積氯仿/異戊醇，猛烈混勻，離心(13000rpm) 10分鐘，取上清于新管中，加入900ul無水乙醇混勻后_20°C放半小時以上。將析出的DNA離心，14000rpm(10分鐘)。去掉上清，將沉淀用lml70%乙醇清洗一次，離心干燥，溶于200ul 1/10TE或水中，4°C冰箱保存。2. 3、InDel分子標記分析InDel分子標記設(shè)計，根據(jù)比較粳稻日本晴秈稻9311兩品系的已公布的核苷酸序列(參見http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi),對差異的部分設(shè)計引物,驗證2個親本粳稻9522和秈稻龍?zhí)馗之間的多態(tài)性；PCR 擴增程序為IOul 體系中，Iul 模板，Iul 10pmol/ul Primerl, Iul IOpmoI/ulPrimer2, Iul IOXBuffer (Mg2+), Iul 2mM dNTP,0. Iul Taq，3.9ul 水。通過 6%的 PAGE膠電泳，銀染方法檢測。2. 4、群體分離分析(bulked segregant analysis)初定位方法用從F2代得到的不育突變體132株(遺傳重組子132)對標記進行擴增反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)I號染色體上的標記ZH104與0sMS4座位相聯(lián)鎖，選取附近的標記ZH106，在F2代分離群體進行進一步驗證，都與0smS4有連鎖關(guān)系，并且初步將0sMS4定在ZH104和ZH106之間。為進一步定位0sMS4座位，擴大F2代群體到3000株，從中得到用于定為突變體750株，在ZH104和ZH106之間發(fā)展了 8個InDel標記(表I)，最終將0sMS4座位定位在ZH134和ZH138之間。通過在網(wǎng)上(http://www.tigr.org)下載的粳稻日本晴第I號染色體拼接的序列(參見 http: //blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)，分析 ZH134 和 ZH138 兩標記別位于克隆AP00837上，物理距離為23kb。用分子標記對定位群體中的雄性不育單株進行基因型分析，利用MapDraw V2. I構(gòu)建目標基因區(qū)域的分子標記的連鎖圖譜。2. 5、0sMS4基因的克隆
對23kb范圍內(nèi)的預(yù)測的MYB家族的基因測序，測序結(jié)果表明，突變體中在這個基因的第一個外顯子上發(fā)生了一個核苷酸的缺失和一個G到A的顛換，最終確定發(fā)生突變的基因為0sMS4基因(SEQ ID NO. I所示)，突變后的基因為0sMS4，其堿基序列如SEQ ID NO. 2所示，進而確定水稻osms4突變體的突變位點為0sMS4基因。3、水稻雄性不育株系恢復(fù)育性驗證以粳稻9522 的基因組 DNA 為模板，以 MYBF (SEQ ID NO. 3) ,MYBR (SEQ ID NO. 4)為引物，擴增一個4318bp的片斷，其中包括0sMS4基因全長、啟動子和終止子。PCR反應(yīng)體系的總體積為50 u L，水稻基因組DNA模板I y L (約50ng)、1*K0D酶反應(yīng)緩沖液、25mM MgCl2 3u L/,2Mm dNTP 4 y L、10 y M 引物 0. 5 y L、50%甘油 5 y L、0. 5 單位KOD 酶(Takara 公司)，加 ddH20 M 50 u L0反應(yīng)程序94°C變性10min，94°C 40s,55°C 40s,68°C 4min，35 個循環(huán)；68°C延伸5min。產(chǎn)物在I %瓊脂糖膠上檢測，割膠純化。 將這個片斷直接用PmaCI和BamHI雙酶切后回收片斷，連入相同酶切的PCAMBIA1301載體,測序驗證正確。把構(gòu)建好的載體電轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌EHA105，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(Hiei等，Efficient transformation of rice (Oryza sativa L. ) mediated by Agrobacteriumandsequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant Journal 1994,6:271-282)，轉(zhuǎn)到正常的粳稻9522水稻品種中。如圖I所示，互補載體轉(zhuǎn)入osms4突變體后，花藥變成黃色，I2-IK染色花粉粒也恢復(fù)染色，可以得到正常的結(jié)實。結(jié)果表明，0sMS4基因可以恢復(fù)突變體育性。4、RNAi (RNA interference)轉(zhuǎn)化驗證基因功能在0sMS4基因的最后一個外顯子和3_UTR(非翻譯區(qū))設(shè)計RNAi片段。設(shè)計引物 0sMS4i-lF(SEQ ID NO. 5)，0sMS4i_lR(SEQ ID NO. 6)，0sMS4i_2F (SEQ ID NO. 7)和0sMS4i-2R(SEQ ID NO. 8)。PCR反應(yīng)體系的總體積為20 u L，水稻基因組DNA模板I U L(約50ng)、l*Taq酶反應(yīng)緩沖液、25mM MgC121. L/、2Mm dNTP I. 5 y L、10 y M 引物 0. 2 y L、50 % 甘油 2 y L、
0.3 單位 Taq 酶(Takara 公司)，加 ddH20 至 20y L。反應(yīng)程序94°C變性 5min，94°C 40s、55°C 40s lmin，72°C 40s，35個循環(huán)；72°C延伸5min。產(chǎn)物在I. 5%瓊脂糖膠上檢測，割膠純化。把2 個純化的 DNA 片段分別連接到 RNAi 載體pTCK303 (Plant Molecular Biology,2004,22 :409-417)上。把構(gòu)建好的載體電轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌EHA105，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(Hiei 等，Efficient transformation of rice (Oryza sativa L. ) mediated byAgrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. PlantJournal1994，6 :271-282),轉(zhuǎn)到正常的粳稻9522水稻品種中。RNAi轉(zhuǎn)基因植株中花藥為白色，花粉粒不著色(見附圖I)，進而證明0sMS4基因具有控制水稻育性的功能。實施例2、水稻雄性不育株系育性轉(zhuǎn)換及繁種方法實施例I獲得的水稻osms4突變體的育性轉(zhuǎn)換能夠通過溫光環(huán)境的控制實現(xiàn)。自然條件下，幼穗分化進期至花粉母細胞形成期，當每日光照< 13小時時，不育系育性穩(wěn)定，花藥為白色，花粉染色為典敗；
當每日光照時間彡13. 5小時時，光照天數(shù)彡2天時，溫度為26 30°C條件下，由不育轉(zhuǎn)換成可育。當每日光照時間彡14小時時，溫度為25 35°C條件下，由不育轉(zhuǎn)換成可育。花粉染色正常花粉粒在45-80%，結(jié)實率在60-80%之間。水稻osms4突變體的育性轉(zhuǎn)換對光照時間、光照強度和光譜范圍都較敏感。光照時間沒有達到育性轉(zhuǎn)換條件時，對溫度的波動表現(xiàn)出鈍感。當水稻osms4突變體為可育時，可實現(xiàn)繁種。在水稻0sms4突變體的幼穗發(fā)育至4 6期時，保持平均溫度為30 32°C，光照條件為每天光照時間為14小時，光照天數(shù)為15天，水稻的0sms4突變體可育，進而得到水稻0sms4突變體的種子，產(chǎn)量為150-400公斤/畝。實施例3、水稻雄性不育株系在水稻雜交育種的用途2008年上海秋季制種，面積I. 0 H ;父本為上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院選育的梗稻恢復(fù)系湘晴(JP50)，父本5月30日播種，6月25日插秧，9月5日抽穗；
母本(即實施例I中的水稻的osms4突變體)于6月23日播種，7月12日插秧，9月8日抽穗；父母本行比2 8。母本開花第一天即取樣花粉鏡檢，經(jīng)I2-IK染色80%花粉為典敗，20%為圓敗；套袋自交結(jié)實為O。母本開花早，花時較集中，父母本花時相遇良好；收獲雜交種子140kg ；2008年冬海南純度鑒定不育株率為0.5%，純度為97.8%。2008年海南冬季制種I. 5畝，父本為上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院選育的粳稻恢復(fù)系湘晴(JP69)。父本12月10播種，3月I日抽穗，母本(即實施例I中的水稻的osms4突變體)12月31日播種，3月4日抽穗；母本osms4花藥為純白色、短棒狀,套袋自交不結(jié)實。母本在短光低溫、低濕條件下開花較晚，異交結(jié)實降低，制種產(chǎn)量不理想，每畝收獲種子30kg。2009年正季上海雜交一代純度鑒定純度為96. 7%，其中不育株為I %。實施例4、水稻雄件不育株系的自由配組0sms4不育系配組自由，選到優(yōu)良組合的機率極大的超過了三系法。避免了不育細胞質(zhì)對雜種優(yōu)勢的負效應(yīng)和細胞質(zhì)的單一化。從2006年開始廣泛同不同生態(tài)類型的恢復(fù)系、常規(guī)稻測交配組。利用該光溫敏不育系同早熟粳型恢復(fù)性C418配組，雜種一代表現(xiàn)出早熟，大穗、聞抗、生長勢強等特點。同JP69、JP50配組，雜種一代莖桿粗壯、穗型大，著粒密、抗倒性強、結(jié)實率高，具有超級雜交稻的農(nóng)藝性狀和技術(shù)指標。與常規(guī)粳稻秀水123、桂花黃等測交，雜種一代表現(xiàn)株葉形態(tài)好，分蘗力強，熟期適中，結(jié)實率高，穩(wěn)產(chǎn)性好，易于栽培。同時與秈稻親本9311、龍?zhí)仄值扰浣M，雜種一代表現(xiàn)出超強生長勢，株葉形態(tài)理想，結(jié)實率在50-70%，說明該不育系具有一定的廣親和性。實施例5、能夠恢復(fù)可育件的水稻雄件不育株系的牛產(chǎn)方法采用常規(guī)雜交手段將水稻osms4突變體與秈稻珍汕97B、天豐B、豐矮占一號、早熟粳稻“松江早熟香粳”雜交，F(xiàn)2代通過群體分離統(tǒng)計，合乎3 I分離規(guī)律。利用分子標記檢測方式，把具有0sMS4基因的不育株繼續(xù)同雜交親本回交，B1F2代在海南選擇不育性穩(wěn)定，農(nóng)藝性狀好的不育單株帶稻根回上海再生長苗，剝蘗繁殖，在不同光照、溫度條件下觀察其育性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有1/3的株系具有0sms4的育性轉(zhuǎn)換特性，恢復(fù)可育結(jié)實率達60%。將這些株系經(jīng)采樣PCR檢測，確定都具有0sMS4分子標記存在(SEQID NO. 2)。將收獲的種子帶海南分期播種，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同時期抽穗都為不育，花藥鏡檢為典敗，套袋自交不結(jié)實。試驗證明，海南(緯度109. 30，經(jīng)度18. 14三亞)接近赤道，太陽基本屬于直射，光照時間短(1-3月份小于13小時)，光照條件達不到該不育基因轉(zhuǎn)換的要求，因此說明在海南制種是安全可靠的。本實施例證實水稻0sms4突變體和其它水稻材料雜交后，將該突變序列引入其它遺傳背景的水稻時，這些含有0sms4純合突變的材料也會出現(xiàn)長光照可育，短光照不育的表型，也可以用來進行兩系雜交水稻育種。綜上所述，本發(fā)明通過控制水稻栽培時間來調(diào)節(jié)水稻生殖生長，可以控制本發(fā)明水稻雄性不育株系，即0sms4植株的可育和不育，實現(xiàn)一系兩用，簡化了雜交水稻種子生產(chǎn)程序。本發(fā)明的水稻0sms4不育系配組自由，選到優(yōu)良組合的機率極大的超過了三系法，避免了不育細胞質(zhì)對雜種優(yōu)勢的負效應(yīng)和細胞質(zhì)的單一化；本發(fā)明水稻雄性不育株系和其它 水稻材料雜交后，能夠?qū)?sMS4基因突變引入其它水稻材料，這些含有osms4純合突變的材料也會出現(xiàn)長光照可育，短光照不育的表型，能夠用來進行兩系雜交水稻育種。
權(quán)利要求
1.一種0sms4水稻雄性不育株系種子的制備方法，其特征在于，包括如下步驟采用常規(guī)方法將水稻種子中的0sMS4基因序列發(fā)生突變，使得0sMS4基因的表達量下降或不表達，進而獲得隱性純合0sMS4基因突變的水稻雄性不育株系種子。
2.如權(quán)利要求I所述的水稻雄性不育株系種子的制備方法，其特征是，所述常規(guī)方法包括物理、化學(xué)或者生物學(xué)上常規(guī)的基因突變方法。
3.如權(quán)利要求2所述的水稻雄性不育株系種子的制備方法，其特征是，所述常規(guī)方法為生物學(xué)上常規(guī)的基因突變方法。
4.如權(quán)利要求2所述的水稻雄性不育株系種子的制備方法，其特征是，所述0sMS4基因序列發(fā)生改變，如所述0sMS4基因序列突變?yōu)槿鏢EQ ID NO. 2所示的序列。
5.一種水稻雄性不育株系的繁種方法，其特征在于，包括如下步驟培育權(quán)利要求I所述方法獲得的種子，在水稻雄性不育株系的幼穗發(fā)育期，保持平均溫度為26 32°C，每天光照時間> 13. 5小時，光照天數(shù)> 2天，所述水稻雄性不育株系表現(xiàn)為可育，進而能夠進行 繁種，獲得水稻種子。
6.如權(quán)利要求5所述的水稻雄性不育株系的繁種方法，其特征是，包括如下步驟培育權(quán)利要求I所述方法獲得的種子，在水稻雄性不育株系的幼穗發(fā)育期，保持溫度為25 35°C，每天光照時間> 14小時，所述水稻雄性不育株系表現(xiàn)為可育，進而能夠進行繁種，獲得水稻種子。
7.如權(quán)利要求6所述的水稻雄性不育株系的繁種方法，其特征是，所述幼穗的發(fā)育期為4 6期，保持平均溫度為30 32°C，每天光照時間為14小時，光照天數(shù)為15天。
8.如權(quán)利要求5所述的水稻雄性不育株系的繁種方法，其特征是，所述幼穗的發(fā)育期為4 5期，保持平均氣溫彡30°C，每天光照時間彡14小時。
9.一種如權(quán)利要求I所述方法獲得的水稻雄性不育株系種子在水稻雜交育種的用途。
10.如權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，所述用途包括如下步驟培育權(quán)利要求I所述方法獲得的種子，在所述水稻雄性不育株系的幼穗發(fā)育期，常規(guī)溫度下保持每日光照(13小時，所述水稻雄性不育株系表現(xiàn)為不育，之后采用常規(guī)方法實施水稻雜交育種。
11.如權(quán)利要求10所述的用途，其特征在于，所述用途包括如下步驟培育權(quán)利要求I所述方法獲得的種子，在所述水稻雄性不育株系的幼穗發(fā)育期的4 5期，平均氣溫(28°C，光照時間< 13小時，所述水稻雄性不育株系表現(xiàn)為不育，之后采用常規(guī)方法實施水稻雜交育種。
12.一種能夠轉(zhuǎn)移不育性的水稻雄性不育株系種子的生產(chǎn)方法，其特征在于，包括如下步驟將權(quán)利要求I所述方法獲得的種子進行培育，之后與常規(guī)水稻材料進行雜交，將0sMS4基因的突變序列引入常規(guī)水稻材料中，繁種，進而得到常規(guī)水稻材料的雄性不育株系種子。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種水稻雄性不育株系種子的制備方法、繁種方法及其應(yīng)用。所述制備方法包括如下步驟采用常規(guī)方法將水稻種子中的OsMS4基因序列發(fā)生突變，通過傳統(tǒng)的遺傳雜交篩選，獲得一個隱性純合OsMS4基因突變的水稻雄性不育系；該osms4不育系在一定繁種條件下可以恢復(fù)花粉育性，具有繁殖含有純合OsMS4基因突變的種子的能力。該純合隱性O(shè)sMS4基因突變的水稻雄性不育系種子能夠?qū)崿F(xiàn)繁種。本發(fā)明通過控制水稻栽培時間來調(diào)節(jié)水稻生殖生長，可以控制本發(fā)明水稻雄性不育株系，即osms4植株的可育和不育，實現(xiàn)一系兩用，簡化了雜交水稻種子生產(chǎn)程序。
文檔編號A01H1/06GK102726285SQ20111043116
公開日2012年10月17日 申請日期2010年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月27日
發(fā)明者張大兵, 張輝, 梁婉琪, 袁政 申請人:上海交通大學(xué)