本發明涉及一種玉米花粉發育調控基因Ms33及其編碼蛋白序列，屬于基因工程領域。
背景技術：
：植物的生殖生長是一個非常復雜的過程，從造孢細胞到成熟的生殖細胞要經歷數十個發育階段，任何一個發育階段出現異常都會造成生殖生長的停滯并導致植物育性的喪失。配子體發育是植物生殖生長中的重要階段，植物雄配子體的非正常發育會導致無法形成花粉或花粉生育力喪失，這一現象稱為雄性不育（MaleSterile）。因此對雄性不育的研究有助于理解復雜的植物生殖生長過程。玉米（ZeamaysL.）是我國重要的禾本科糧食作物，因為其雌雄同株異花的特點而被視作植物生殖生長的理想研究對象。此外，具有雄性不育性的玉米自交系應用于雜交育種和商業化種子生產中，具有不需要人工去雄、種子純度高等優點，能夠大幅降低科研育種和商業化種子生產的成本，提高育種效率。本發明提供了一種控制玉米花粉發育基因的DNA序列、啟動子序列及該基因所編碼蛋白質的氨基酸序列，該基因的功能缺失會造成玉米的雄花敗育，由此可以產生新的雄性不育材料，在科研和農業生產中具有重要的應用價值。技術實現要素：本發明提供一種新的調控玉米花粉發育基因Ms33的DNA序列、cDNA序列、啟動子序列和該基因所編碼功能蛋白的氨基酸序列，所述基因是一種植物雄穗特異性表達基因，所述基因功能的缺失會特異性導致玉米雄花不育。本發明的第一個發明目的是：提供一種調控玉米花粉發育的新基因Ms33，其特征在于，是選自如下1）或2）或3）的DNA分子。1）SEQIDNO.1所示DNA分子（克隆自玉米自交系B73的基因組DNA）：該DNA分子由2198個核苷酸組成，-119至-1為核苷酸為5’端非翻譯區（5’-UTR），第+1至+705位核苷酸為第一外顯子，+706至+836位核苷酸為內含子，+837至+1709位核苷酸為第二外顯子，+1710至+2079位核苷酸為3’端非翻譯區（3’-UTR）。2）SEQIDNO.2所示的DNA分子（克隆自玉米自交系B73的cDNA）。3）在SEQIDNO.1基礎之上經過一至數個堿基替換和\或一至數個堿基的插入和\或缺失以及大片段的核苷酸序列插入\缺失\移位\倒位所形成能夠影響植物花粉生育能力的DNA分子。本發明的第二個發明目的是：提供上述基因所編碼的調控植物花粉發育的相關蛋白質。在一個實施方案中，所述基因編碼如下1）或2）所述的蛋白質。1）序列表的SEQIDNO.3所示的氨基酸序列組成的蛋白質。2）將序列表的SEQIDNO.3經過一個或數個氨基酸殘基的取代、和/或缺失、和/或添加且具有影響植物花粉發育功能相關活性的蛋白質。本發明的第三個發明目的是：提供在植物雄花器官中調節所述基因序列轉錄表達的啟動子。在一個實施方案中，所述啟動子序列如SEQIDNO.4所示DNA序列，該序列具有在植物雄花器官中特異啟動如SEQIDNO.1所述基因序列轉錄的功能。序列表的SEQIDNO.4為所述基因的啟動子序列，總長1429個核苷酸對應圖6.A所示基因結構-1至-1429位，所述啟動子含有第1368bp-1371bp核苷酸的CAAT框（CAATbox）對應圖6.A所示基因結構-61至-58，第1371bp-1375bp核苷酸的TATA框（TATAbox）對應圖6.A所示基因結構-58至-54，啟動子的必要區域包括TATA框和CCAAT框的-54位至-61位，-1至-82區域是特別必要區域。本發明的第四個發明目的是：提供含有所述基因和/或啟動子的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。本發明的第五個發明目的是：提供上述基因用于轉基因改良作物的用途。在一個具體實施方案中，所述基因用于誘導作物植株雄性不育，以便導入外源基因以獲得優質的轉基因作物。在另一具體實施方案中，所述作物是自花授粉或異花授粉作物。在一個更加具體的實施方案中，所述作物包括但不限于玉米、大麥、高粱、谷子、水稻。本發明的第六個發明目的是：提供了一種在其它植物中獲取Ms33基因的直系同源基因的方法，以及利用該方法獲高粱（Sorghumbicolor）、谷子（Setariaitalica）、大麥（Hordeumvulgare）、水稻（Oryzasativa）的氨基酸序列（圖10）。與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果：本發明提供的玉米花粉發育調控基因Ms33直接參與小孢子時期的發育調控，該基因的表達受到抑制后，小孢子細胞壁發育受到抑制，同時花藥表皮細胞發生降解，并最終導致在小孢子發育末期的凋亡和花器官的雄性不育現象。通過植物生物技術途徑，本發明在農作物的雜種優勢利用和不育化雜交種制種生產中都將發揮重要作用。術語定義術語“調控植物花粉發育的基因”指一段具有編碼蛋白能力的核苷酸序列，該序列特異編碼具有調控植物花粉發育功能的蛋白活性多肽，如SEQIDNO.2的第83-1660位核苷酸序列及其簡并序列。術語“簡并序列”是指，位于SEQIDNO.2的編碼框第83-1660位核苷酸序列中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQIDNO.2的第83-1660位核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列也能編碼出SEQIDNO.2所編碼的氨基酸序列。所述“調控植物花粉發育的基因”，還包括在中度嚴格條件下，更佳的在高度嚴格條件下可以與SEQIDNO.2的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。其中，中度嚴格條件可以是0.1×SSPE（或0.1×SSC）、0.1％SDS（w/v）的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜的條件。所述“調控植物花粉發育的基因”，還包括與SEQIDNO.2中從第83-1660位核苷酸序列的同源性至少70%，較佳地具有至少80%、82%、85%、86%、88%、89%同源性，更佳地具有至少90%、91%、92%、93%、94%同源性，最佳地具有至少95%、96%、97%、98%、99%同源性的核苷酸序列。所述“調控植物花粉發育的基因”，還包括能編碼具有與天然的調控玉米花粉發育基因Ms33基因相同功能蛋白的、SEQIDNO.2開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括（但并不限于）：1個或幾個核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’-UTR或3’-UTR端添加1至數個核苷酸。所述“調控植物花粉發育的基因”，還包括能夠翻譯一類具備調控玉米花粉發育功能的氨基酸序列，如SEQIDNO.3的氨基酸序列。該類氨基酸序列還包括具有與天然調控玉米花粉發育蛋白相同功能的SEQIDNO.3的變異形式。這些變異形式包括（但并不限于）：1個或幾個氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或幾個氨基酸。在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能；在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。另外，所述的“調控植物花粉發育的基因”的核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本實施例公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員己知的常規方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增得到有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關的序列，可以用重組法來大批量地獲得有關序列。通常是將其克隆入載體，然后細胞轉化等常規方法從增殖的宿主細胞中分離得到有關序列。此外，還可通過化學合成將突變引入實施例蛋白序列中。除了用重組法產生之外，實施例蛋白的片段還可用固相技術，通過直接合成多肽而加以生產。在體外合成蛋白質可以用人工或自動進行，可以分別化學合成實施例蛋白的各片段，然后用化學方法加以連接以產生全長的蛋白質分子。附圖說明圖1為野生型和玉米突變體ms33-6029的小花在抽雄期的形態觀察示意圖：圖A，正常可育植株（WT）的小花和不育突變體（ms33-6029）的雄穗形態比較；圖B，正常可育植株（WT）的小花和不育突變體（ms33-6029）的小花形態比較；圖C和D，可育株（WT，C）和突變體（ms33-6029，D）的花粉經1%KI-I2染色結果比較。圖2為Ms33基因的遺傳定位結果：基因被定位在玉米2號染色體（標記EP97和bnlg1893之間）。圖3為Ms33基因的物理定位結果：基因被精細定位在一個349Kb的物理區間內（標記EP603和EP605之間），矩形所示為區間內的功能基因，黑色框代表候選基因GRMZM2G070304。圖4為分子標記苗期鑒定可育株和純合不育株的電泳圖：利用EP198引物擴增目的條帶大小為500bp，隱性純合體為上帶，顯性純合體為下帶，雜合體為雙帶；利用EP605引物擴增目的條帶大小為750bp，隱性純合體為下帶，顯性純合體為上帶，雜合體為雙帶。圖5為利用引物1和引物2在基因組DNA中擴增的PCR產物，經濃度2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定不育突變特異的分子量條帶（黑色箭頭標注為可育基因型和不育基因型的特異擴增條帶）：M，DNALadder；1-2，ms33-6029突變體（基因型ms33-6029/ms33-6029）；3-4，野生型（基因型Ms33/Ms33）。圖6為野生型與突變體中Ms33的基因結構示意圖：A，Ms33基因在野生型B73中的基因結構，由2198個核苷酸組成，-119至-1為核苷酸為5’端非翻譯區（5’-UTR），第+1至+705位核苷酸為第一外顯子，+706至+836位核苷酸為內含子，+837至+1709位核苷酸為第二外顯子，+1710至+2079位核苷酸為3’端非翻譯區（3’-UTR）；B，Ms33基因在突變體ms33-6029中的基因結構示意圖，在第一外顯子+223與+224位之間插入了一個長度為1368bp的轉座子（DTA_ZM00216），使得該突變基因翻譯提前終止。圖7為Ms33基因預測編碼的蛋白質氨基酸序列在野生型B73和突變體ms33-6029的比較結果，紅色下劃線注為Lysophospholipidacyltransferases(LPLAT)結構域。圖8為Ms33基因在B73中的半定量反轉錄PCR的表達譜分析：EV，早期大液泡小孢子時期雄穗；MV，中期大液泡小孢子時期雄穗；LV，后期大液泡小孢子時期雄穗；Root，根；Stem，莖；Leaf，葉片；Tassel（雄穗）標注的三個泳道代表檢測樣品來自不同時期雄穗總RNA轉錄的cDNA。圖9為利用半定量RT-PCR對Ms33基因在純合不育突變體ms33-6029/ms33-6029和純合可育Ms33/Ms33（WT）植株在不同發育時期雄穗中表達量差異的分析結果：Q，小孢子母細胞減數分裂四分體時期雄穗；EV，早期大液泡小孢子時期雄穗。圖10為玉米Ms33基因翻譯的氨基酸序列與其在大麥、高粱、谷子、水稻中直系同源基因翻譯產物的比較結果，紅色下劃線標注為保守的Lysophospholipidacyltransferases(LPLAT)結構域。具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明的應用范圍。下述實施例中的所有技術和科學術語，如無特殊說明，均為本發明所屬領域普通技術人員通常所理解的相同含義。除非有相反指明，本發明所使用或提及的技術均為本領域普通技術人員公認的標準技術。所述試驗材料，如無特別注明，均為本發明領域通用的試驗材料。下述實施例中所用的試驗試劑，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。材料、方法和實施例謹作闡述用，而非加以限制。本發明所述的雄性不育，特指由植物細胞核基因發生功能變化導致植物雄花發育出現異常（無法產生雄花、花藥或者正常的雄性配子體）并出現育性的喪失，即通常所說的雄性核不育（Genicmalesterility）而非細胞質核不育（Cytoplasmicmalesterility）。雄花育性的異常和恢復均由細胞核內的基因加以控制。因此，本發明也包括利用序列表所述序列調控植株的雄配子生育能力，即利用本發明提供的基因序列在基因組、和/或轉錄組、和/或蛋白質組水平影響其它植物中相同或同源基因的功能來達到控制雄花育性的目的。例如，下述方法但不限于下述方法：通過天然序列的變異導致基因表達抑制或蛋白質功能的喪失、通過向植物中轉入所述基因的反義序列或引入發卡結構、或將所述基因與其它序列（DNA或RNA）相結合產生新的具有功能活性的DNA或RNA鏈，來影響或改變植物基因的功能。或其它本領域技術人員已知的可用于影響植物雄花育性的技術方法中的任何一種技術方法。本發明包括玉米Ms33基因，其顯性等位基因對植物雄花育性具有關鍵作用，功能缺失性的隱性等位基因會導致雄性不育。該基因位于玉米2號染色體，其基因具體位置如圖2、圖3所示。該基因序列及其同源序列可從任何顯花植物中獲得，包括但不限于玉米（Zeamays）、普通小麥（Triticumaestivum）、高粱（Sorghumbicolor）、水稻（Oryzasativa）、短柄草（Brachypodiumdistachyon）、谷子（Setariaitalica）、大麥（Hordeumvulgare）、黑麥（Secalecereale）、粗山羊草（Aegilopstauschii）、擬南芥（Arabidopsisthaliana）、甘藍（Brassicaoleracea）、大豆（Glycinemax）、番茄（Lycopersiconesculintum）等。獲得方法包括但不限于：通過玉米Ms33基因序列利用blastx、blastn或通過氨基酸序列利用blastp從其它植物的基因組序列數據庫、和/或cDNA序列數據庫、和/或蛋白質序列數據庫中調取；以Ms33基因的DNA或cDNA或RNA序列為參考序列設計引物，直接從其它植物的基因組DNA或cDNA或RNA中利用PCR的方法直接獲得；以玉米Ms33的基因序列設計探針，利用核酸雜交的方法從基因組文庫中分離含有同源基因序列的DNA或cDNA或RNA片段。“Ms33基因同源序列”指在與SEQIDNO.3的氨基酸進行blastx比較分析后，Identities大于或等于35%、Positives大于或等于50%，且識別區域位于SEQIDNO.3的314至482位氨基酸即Lysophospholipidacyltransferases(LPLAT)結構域內的植物基因的DNA序列。進行blastx時，所有參數均遵照http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/所示的默認設置進行。下文通過說明和闡述提供了更為詳細的描述，但這并非意欲對本發明的范圍加以限制。實施例1.Ms33基因突變體的鑒定和基因精細定位雄性不育是由于控制雄花發育的基因發生變異導致雄花敗育，通常表現為沒有雄花或雄花花藥干癟、花藥中沒有花粉或只有有少量非正常發育的花粉。與育性正常的植株的雄花相比，ms33-6029突變植株（天然突變體，選自專利權人單位北京首佳利華科技有限公司收集的玉米育種材料）的雄花花藥不外露（圖1.A），花藥嚴重退化（圖1.B），經過1%KI-I2花粉染色，野生型花粉可以正常染色（圖1.C），突變體無花粉不能染色（圖1.D），從而表明ms33-6029突變體是一個無花粉型雄性不育突變體。以昌7-2為父本、隱性不育突變體ms33-6029為母本，構建了F2分離群體。2013年夏季種植于北京通州育種基地。按上述性狀特征對其進行育性調查，選取了228株表現雄性不育表型的單株作為不育基因池，采用集團分離分析法（Bulk-segregantanalysis，BSA）對突變位點進行遺傳分析。已有研究表明，ms33位點位于2號染色體長臂（參考文獻1-4）。基于maizeGDB（http://www.maizegdb.org/）中標記數據庫信息，從40對SSR標記中篩選出5個在ms33-6029與昌7-2間有多態性的SSR分子標記（表1，第1-5行），通過對228株不育單株進行PCR擴增和凝膠電泳分析，檢測不育基因與標記的連鎖關系。結果顯示這5個分子標記在不育基因池中超過60%的單株表現出與不育基因供體ms33-6029一致的基因型（表2），表明這5個標記與ms33位點緊密連鎖。表1.基因定位引物序列表。序號引物名稱正向序列反向序列1mmc0381GTGGCCCTGTTGATGAGCGACGAGTACCAGGCAT2bnlg1940CCTTTTGTTTCAGGCCGTTACAGCAGCCTGATGATGAACA3umc1230GTACGACCGTTGAAACTGTTGTTTTGCGATTTCAACTATTTGTGGTAAAGG4umc1551CACCGGAACACCTTCTTACAGTTTCGAAACCTTCTCGTGATGAGC5umc2214CTGGATGAGGAGGAAGAATACGAGACCCCCTGATTCTCTCTTACGTTT6umc1252GCGTCGGAGAAGTACATCAAGTTTCTTCTGCATCATCATCATCGTCTT7bnlg1893AATCCTGTAGCGTGTGTCCCTAACTGAGTTGTTGAAGGAAATTG8EP95AACCTAGCAGTGGTCGTTGGGACGTAGTTCTGTCCAGCCC9EP97CGAGATGACGTTGAAACACGTGTGAAAGTTGGCATTGACC10EP198AGCCTCGATTCCTTCATCCGGCAGTAAAGCCACTACAACAGG11EP603GAAGCACTCAATCGAGCCGCATAGAAGCCCTTACACAC12EP605GGCACTCATGGTCAACAACTCGAAATTCAGATTGCAGG13EP480CAACAAAGCTAGGATTCCTCGATACAGCCCCTTGAGGTCCA表2.多態性標記與ms33不育位點的連鎖關系分析。標記名稱：mmc0381bnlg1940umc1230umc1551umc2214不育基因池ms33-6029基因型比例64.47%66.23%70.18%77.63%60.96%2013年冬季在海南南繁基地種植了F2群體（916株），對其進行育性調查，可育表型和不育表型單株比例為681:235，符合3:1的單基因分離比（χ2=0.087，P=0.7681）。基于表1信息從maizeGDB中調取了mmc0381至umc2214之間的9對多態標記（含umc0381和umc2214，表1第1-9行）對該F2群體單株進行了基因型鑒定，構建了ms33區間的遺傳連鎖圖譜，并根據單株的育性數據初步將ms33定位于EP97與bnlg1893之間11.5cM的區間內（圖2）。進一步調取B73基因組序列設計了4對多態標記EP198、EP603、EP605和EP480（表1第10-13行），最終將ms33定位在EP603和EP605之間約349Kb的物理區間內。從MaizeGDB調取B73的基因組序列，在去除假基因和轉座子序列后，在該249Kb區間共有15個功能基因（圖3），其中一個預測為GPAT家族基因GRMZM2G070304具有與花器官發育相關的功能。有文獻報道GPAT基因家族參與花器官的發育和形態建成，因此選取該基因作為Ms33的候選基因進行后續分析。實施例2.Ms33基因在野生型和突變體中的克隆首先，利用Ms33的緊密連鎖分子標記EP198和EP605,通過PCR和電泳分析，可以在苗期區分野生型和突變體的基因型（圖4）。其次，利用引物1（5’-GGGATAACCTAAAGCAAGGC-3’）和引物2（5’-GCACCGCAGAGATACAATAAAG-3’）可在B73和Ms33位點的隱性突變體ms33-6029中特異克隆GRMZM2G070304基因（圖5）。同時用引物3（5’-AGTAGACACCGCCCAATCTC-3’）和引物2在B73的花器官cDNA中擴增全長編碼區對上述基因組中的擴增片段進行驗證。所有PCR擴增均使用KODFXDNAPolymerase（TOYOBOCO.，LTD.LifeScienceDepartment，Osaka，Japan），并按照產品說明的反應體系和條件，在Bio-radMyCyclerPCR儀進行PCR擴增。PCR產物送往上海生工生物工程公司進行測序。經過測序，并且與玉米B73基因組序列信息比對后，發現該基因全長2198bp（SEQIDNO.1），其在玉米基因組內為單拷貝基因。通過野生型B73中的基因組序列（SEQIDNO.1）、cDNA序列（SEQIDNO.2）的比對分析，發現該基因的基因組序列結構特征如下（圖6A）：含有2個外顯子（Exon）和1個內含子（Intron），-119至-1為核苷酸為5’端非翻譯區（5’-UTR），第+1至+705位核苷酸為第一外顯子，+706至+837位核苷酸為內含子，+837至+1709位核苷酸為第二外顯子，+1710至+2079位核苷酸為3’端非翻譯區（3’-UTR）。此外，對純合突變體ms33-6029中的Ms33基因測序后，發現Ms33突變基因ms33-6029全長3566bp，通過與MazieTransposableElementDatabase（maizetedb.org/~maize/）進行blastn分析發現，在第一個外顯子+223處插入了一個長為1368bp的轉座子（DTA_ZM00216），基因翻譯在+288處即已經停止（圖6B）。實施例3.Ms33基因在野生型B73和突變體ms33-6029中編碼蛋白的序列差異在野生型B73中，Ms33基因的蛋白質編碼序列長1578bp，通過對該基因cDNA序列（SEQIDNO.2）進行模擬翻譯，發現該基因編碼一個525個氨基酸的蛋白，將該蛋白序列與GenBankSwissProt蛋白質數據庫進行blastx分析，顯示該蛋白含有一個Lysophospholipidacyltransferases(LPLAT)保守結構域（第314-482位氨基酸，如圖7所示）；在突變體ms33-6029中，由于在Ms33基因序列223位核苷酸的轉座子插入（圖6B黑色剪頭標注處）導致了第75位氨基酸后發生改變，編碼蛋白僅含有95個氨基酸，并且使突變體編碼的蛋白不再具有任何功能結構域（圖7）。這表明Ms33基因在突變體中的序列變異直接導致了翻譯氨基酸的序列變化和翻譯的提前終止，特別是基因的LPLAT結構域被破壞。Ms33基因的功能缺失型突變體ms33-6029表現雄配子的敗育，這證明了具有SEQIDNO.1所述DNA序列的Ms33基因具有控制玉米雄性生育力的功能，當SEQIDNO.1、2所示序列發生一至數個堿基替換和\或一至數個堿基的插入和\或缺失以及大片段的核苷酸序列插入\缺失\移位\倒位導致SEQIDNO.1的序列結構和功能發生變化時，將導致玉米雄性生育力的喪失。實施例4.Ms33基因在B73及突變體中的轉錄水平分析分別采集B73各個發育時期雄穗，每個完整雄穗取一半經液氮速凍保存，用于提取雄穗小花的總RNA，剩余雄穗的小花在卡諾固定液（酒精：冰乙酸＝3:1）中固定48小時，再經1%醋酸洋紅（1g洋紅溶于100ml45%醋酸）染色進行細胞遺傳學觀察，確定準確的發育時期。選取處于減數分裂四分體時期（Quartets，Q）、早期大液泡小孢子期（Early-vacuolatemicrospore，EV）、中期大液泡小孢子期（Mid-vacuolatemicrospore，MV）、晚期大液泡小孢子期（Late-vacuolatemicrosoire，LV）四個雄穗發育時期的B73雄穗的小花總RNA用于Ms33基因的表達譜分析，另外提取B73減數分裂期植株的葉片、莖、根的總RNA，用于分析基因在不同組織中的表達水平。使用實施例1所述緊密連鎖標記EP198、EP605在苗期鑒定純合隱性ms33-6029位點的不育單株和相同遺傳背景下攜帶雜合Ms33/ms33-6029位點的可育植株（圖4），用相同方法分別提取不育株和可育植株的減數分裂四分體時期、早期大液泡小孢子期、中期大液泡小孢子期、晚期大液泡小孢子期四個雄穗發育時期的雄穗小花總RNA（所有雄穗均提前經細胞遺傳學觀察，確定準確的發育時期）。每一個樣本均采取半定量反轉錄PCR（Semi-quantitativeReverseTranscriptionPCR，qRT-PCR）進行Ms33基因的表達量檢測。qRT-PCR以ZmActin基因作為內參報告基因，引物4（5’-GCAGAGATGGTGAAGAAGGC-3’）和引物5（5’-ACACCATCGGCTTTGGGTA-3’）用于特異檢測Ms33基因和ms33-6029突變基因的表達水平，引物OGF49（5’-GGCCACAAGCTGCTCAACCT-3’）、OGF50（5’-ATGTGGTTGCCCAGGGACTT-3’）用于檢測ZmActin基因的表達。RT-PCR中每個樣品的Ms33基因和ZmActin基因的PCR反應均設置3個獨立重復實驗。一、Ms33基因在B73中的表達譜分析Ms33基因是一個雄穗特異表達基因，且僅在特定的生理時期（發育期雄穗）行使功能。qRT-PCR結果顯示，除雄穗（主要是早期大液泡小孢子期的雄穗）外，在其它組織中均未檢測到Ms33基因的表達（圖8）。二、Ms33基因在突變體中的差異表達檢測在四分體和早期大液泡小孢子時期，Ms33基因在ms33-6029突變體中的表達明顯被抑制，qRT-PCR的結果如圖9所示：Ms33基因在純合不育的ms33-6029植株中的表達均顯著低于同時期攜帶純合Ms33/Ms33位點的可育植株，ms33-6029突變體中Ms33基因的表達量非常微弱。實施例5.Ms33基因在玉米、高粱、谷子、水稻、大麥中的同源性分析如前文所述，Ms33基因在玉米中特異調控雄穗的配子體發育。當其功能被抑制時將導致玉米雄配子體育性喪失即雄性不育。利用Ms33基因的cDNA序列，通過blastx在genebank獲得了該基因在高粱、谷子、水稻、大麥中的直系同源基因（編號分別為：XM_002449936.1、XM_004979921、Os11g45400、AK376456）。如圖10所示，Ms33基因在玉米、高粱、谷子、水稻、短柄草的314-482位氨基酸表現出高度保守性，而這一區域正是LPLAT結構域的位置，在314位以前和482位以后的氨基酸變異較大。據此可以判斷，Ms33在其它植物中同樣存在，并且在關鍵結構域上保持保守性的特點。即該基因對植物保持正常的雄配子生育力而言具有關鍵作用，是必不可少的，當基因發生序列變異時會極大地影響植物的雄配子育性。實施例6、Ms33基因的啟動子克隆使用引物6（5’-ATACTGTGTGCCTGCTGCCTAC-3’）和引物7（5’-CAAGTTGGTGAGATGGAATAGG-3’）的組合能夠從野生型B73中擴增出Ms33基因的上游基因組序列1429bp，該序列如SEQIDNO.4所示。在該序列的第1368-1371位核苷酸具有CAAT框（CAATbox），第1371-1375位核苷酸具有TATA框（TATAbox），具有啟動下游基因轉錄的功能。此外，通過在線順式調控元件預測工具PlantCARE（網址鏈接為http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對該啟動子序列進行分析，發現除了上述的CAAT框和TATA框外，還具有一系列順式作用元件，如ABRE（+46位）、ARE（+60位）、CAT-Box（+946位）、CRTCA-box（+1117位）、G-box（+48位）、GAG-box（+199、+439位）、GARE-box（+1109、+853位）、GATA-box（+317、+422位）、GATT-box（+674位）、HSE（+211位）、I-box（+317、+347位）、L-box（+1347位）、MRE（+251位）、O2-site（+344位）、skn-1motif（+1219位）、sp1（+536位）和TGACG-motif（+885位）等，分別響應于逆境、激素、光、熱等誘導因素，初步證明該啟動子序列可以調控下游基因的轉錄表達。相關文獻1、Beadle，GW(1932)Genesinmaizeforpollensterility.Genetics，17:413-431。2、Albertsen，MCandPhillips，RL(1981)Developmentalcytologyof13geneticmalesterilelociinmaize.CanJGenetCytol，23:195-208。3、李競雄、周洪生、孫榮錦等（1998）玉米雄性不育生物學，中國農業科學出版社。4、吳鎖偉、方才臣、鄧聯武、萬向元（2012）玉米隱性核雄性不育基因研究進展及其育種應用途徑分析，分子植物育種(網絡版)，10：1001-1011。當前第1頁1 2 3