專利名稱：具有殺蟲活性的小分子肽的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種有殺蟲活性的小分子肽。
背景技術：
隨著科學技術的發展和經濟的不斷進步，人們的生活水平得到明顯提高，環保意識也逐年增強，營養豐富、綠色、污染小的農副產品得到人們的喜愛。長期以來人們一直使用化學農藥控制病蟲害，但是化學農藥的毒性較大且殘留量也較高，長時間使用對環境及人們的健康都會產生嚴重影響，還會嚴重破壞生態平衡。因此，人們逐漸研究并開發出生物農藥。現如今，生物農藥已快速發展，許多新的品種不斷涌現，并已逐步取代化學農藥，成為新農藥發展的有效途徑之一。傳統的生物農藥定義是指利用活體性生物如細菌、病毒來防治病蟲等有害生物的一類制劑。現在生物農藥的定義已不局限于此，范圍逐漸擴大，通常是指利用活體性生物或其發酵產物、轉基因產物來防治病蟲等有害生物的一類制劑，包括生物化學農藥、轉基因農藥、微生物農藥等等。傳統的化學農藥一般是消滅害蟲；而生物農藥則是控制和殺滅害蟲，生物農藥具有長效作用，針對性強，毒性小，殘留量低，殺蟲效果好，抗藥性小，對作物產量影響也小的優點。

發明內容
本發明是提供了一種具有殺蟲活性的小分子肽。本發明具有殺蟲活性的小分子肽的氨基酸序列為SerGluProAlaGlnIIeValIIeVal AspGlyValAspTyrTrp。本發明具有殺蟲活性的小分子肽由15個氨基酸組成，分子量為1691. 3。本發明具有殺蟲活性的小分子肽具有對人畜無毒性和環保性。經試驗測試可知，本發明具有殺蟲活性的小分子肽針對性強，對蚜蟲的防治效果達100%，對紅蜘蛛的防治效果可達90%，對木虱、白粉虱等均有殺滅作用，且常溫下3年內持久有效。本發明具有殺蟲活性的小分子肽化學穩定性強，在pH = 2. 0 11. 0、溫度為20 80°C條件下均具有殺蟲活性。本發明具有殺蟲活性的小分子肽是一種廣譜性的殺蟲劑，不產生藥害，無殘留。成本低，與化學藥劑比較，可節省90%的成本；而且用量少，每畝用量僅為2克。


圖1是具體實施方式
一中所需樣品粗品初步分離的結果圖。圖2是具體實施方式
一中峰IB12-IC1組分進一步分離的結果圖。圖3是具體實施方式
一中具有殺蟲活性的小分子肽的純度結果檢測圖。圖4是具體實施方式
一中本實施方式具有殺蟲活性的小分子肽濃度測定標準蛋白的標準曲線圖。
具體實施例方式本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式具有殺蟲活性的小分子肽的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。本實施方式具有殺蟲活性的小分子肽的獲取方法一、將鏈霉菌(Sti^ptomyces laindensis) YU，2008H008 經 LB 培養基活化后，按 10%接種量將孢子懸液接入種子培養基(種子培養基LB培養基，pH值7. 2士0. 05)，于 28°C搖床培養48h后，按10%接種量將種子液接入IOL發酵培養基(發酵培養基玉米淀粉 5.0%,黃豆餅粉3.0%，酵母粉1. 6 %，α -淀粉酶0.3%，消泡劑0.05%，硫酸鎂0.05%，和余量蒸餾水配制，pH值7. 5士0.05，121°C高壓滅菌30min)的發酵罐中，置于121r/min、培養基中溶解氧含量為60%、起始pH值為8. 0、發酵溫度為28°C條件下攪拌發酵培養96h。二、取 IOOmL 鏈霉菌(Sti^ptomyces laindensis) YU, 2008H008 發酵液用 4 層紗布過濾，加入IOOmL的丙酮溶液，攪拌均勻，30分鐘后2000r/min離心10分鐘，棄沉淀，取上清清液于30°C旋蒸除去丙酮，得所需樣品粗品。三、采用反相高效液相色譜法，C18柱，運用紫外檢測器，以甲醇-水(甲醇與水的體積比10 90)作為流動相，進行樣品的一級制備；C18柱柱高25cm，柱體積4.155mL，柱壓13MP，最大流速1. 5mL/min，初步分離的結果如圖1所示，收集峰IB12-IC1組分。四、將收集到的峰IB12-IC1組分進一步分離純化離子交換分析，C18柱，pH值為 8. 5的TBS緩沖液，214nm反相色譜，柱高:25cm，柱體積4. 155mL,柱壓13MP，最大流速 1. 5mL/min，進一步分離的結果如圖2所示，收集峰2Di_2D2組分，即得到本實施方式具有殺蟲活性的小分子肽。本實施方式所用的鏈霉菌(Sti^ptomyces laindensis) YU，2008H008在中國發明專利“一株具有高效殺蟲作用的菌株”(申請公布日2011年11月23日，申請號 201110179632. 5)中公布，其保藏編號為CCTCC No =M 2011028，保藏日期為2011年01月21曰。取5mL本實施方式具有殺蟲活性的小分子肽進行純度測定，避開疏水差異，電荷差異的分離手段，采用分子量大小差異分離分析，判斷純度。純度結果如圖3所示，本實施方式具有殺蟲活性的小分子肽的純度大于95%。(純度測定方法將本實施方式具有殺蟲活性的小分子肽用高效液相色譜HPLC測定柱體C18柱，流動相體積濃度為35%的甲醇， 柱壓76 78kgf/cm2，波長=A265，保留時間為4分55秒，柱箱溫度:30°C )取5mL本實施方式具有殺蟲活性的小分子肽進行濃度測定。測定的標準蛋白的標準曲線如圖4所示，測定結果為0. 8mg/mL。本實施方式具有殺蟲活性的小分子肽經質譜測定，其分子量為1691. 377。本實施方式具有殺蟲活性的小分子肽用氨基酸測序儀測定氨基酸序列為15個氨基酸組成的小肽，理論分子量為1691. 3與質譜測定的分子量值相符。可采用分子生物學手段合成本實施方式具有殺蟲活性的小分子肽。本實施方式具有殺蟲活性的小分子肽殺蟲活性鑒定(根據中華人民共和國農業部(NY/T1154，14-2008) 2008，07，01起實施的規程進行操作)將新鮮生菜，剪成與平皿(直徑9mm)底部大小一致，平鋪在平皿的底部。在每個鋪有生菜的平皿中加入2mL的本實施方式具有殺蟲活性的小分子肽，浸泡生菜葉子2min 后，將葉子取出，用棉花蘸去表面液體。陰性對照為水。分別在每片經過處理后的葉片上接種20頭蚜蟲，保證每頭蚜蟲的個體大小一致，處理后置于溫度25士0.5°C、光周期L D = 14 10、相對濕度為75% 85%的培養箱中飼養。飼養48h后檢查幼蟲死亡率殺蟲死亡率(％)；校正公式=(實驗組死亡率-對照組死亡率)/(1_對照組死亡率)X 100。本實施方式具有殺蟲活性的小分子肽對蚜蟲的殺蟲率為100%。將新鮮生菜，剪成與平皿(直徑9mm)底部大小一致，平鋪在平皿的底部。在每個鋪有生菜的平皿中加入2mL的本實施方式具有殺蟲活性的小分子肽，浸泡生菜葉子2min后， 將葉子取出，用棉花蘸去表面液體。陰性對照為水。分別在每片經過處理后的葉片上接種 20頭紅蜘蛛，保證每頭紅蜘蛛的個體大小一致，處理后置于溫度25士0.5°C、光周期L D =14 10、相對濕度為75% 85%的培養箱中飼養。飼養48h后檢查幼蟲死亡率。殺蟲死亡率(％)；校正公式=(實驗組死亡率-對照組死亡率)/(1_對照組死亡率)X 100。本實施方式具有殺蟲活性的小分子肽對紅蜘蛛的殺蟲率為90%。而且本實施方式具有殺蟲活性的小分子肽對木虱、白粉虱均有殺滅作用。將本實施方式獲得的具有殺蟲活性的小分子肽凍干，每畝本實施方式具有殺蟲活性的小分子肽凍干粉用量僅為2克。將本實施方式具有殺蟲活性的小分子肽凍干粉加入水中配置成濃度為50 60ppm的生物藥液，即可使用，有效殺滅害蟲。與使用化學藥劑相比， 可節省農藥成本約90%。本發明具有殺蟲活性的小分子肽化學穩定性強，在pH = 2. 0 11. 0、溫度為20 80°C條件下均保持較高殺蟲活性。與未遭受蟲害的作物進行對比試驗，使用本實施方式具有殺蟲活性的小分子肽的作物產量無明顯變化。
權利要求
1.具有殺蟲活性的小分子肽，其特征在于具有殺蟲活性的小分子肽的氨基酸序列如 SEQID NO 1 所示。
全文摘要
具有殺蟲活性的小分子肽，它涉及一種有殺蟲活性的小分子肽。本發明是提供了一種具有殺蟲活性的小分子肽。本發明具有殺蟲活性的小分子肽的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示。本發明具有殺蟲活性的小分子肽可用于蟲害防治。
文檔編號A01P7/00GK102492025SQ20111043938
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月23日 優先權日2011年12月23日
發明者余瓊, 張巍, 張朝暉, 穆丹, 馬東升, 高金勝 申請人:黑龍江大學