專利名稱：抗高血壓活性肽vip的制作方法
技術領域：
本發明涉及兩個抗高血壓活性肽，具體涉及一種通過構建定量構效關系(Quantitative Structure-Activity Relationships, QSAR)數學模型和體外和體內生物活性實驗篩選出兩個抗高血壓的合成三肽。
背景技術：
我國高血壓患病率的態勢越來越嚴峻，當前常見的治療高血壓的藥物有以下六種利尿劑(可能引起低血鉀癥，影響糖代謝，使糖耐量下降)、3 —阻滯劑(可帶來中樞神經系統、消化系統以及血管系統的不良反應)、a 一阻滯劑、鈣拮抗劑(會導致水腫、頭痛、潮紅、多尿、低血壓以及心臟傳導受阻)、血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)和血管緊張素II受體阻滯劑(可引起干咳、血鉀高、甚至血管性水腫)。由于大部分藥物都有副作 用，所以科學家們一直致力于開發含有抑制血管緊張素轉換酶(angiotensin convertingenzyme, ACE, EC3. 4. 15. I)活性的小肽的功能食品，使高血壓患者得益。ACE酶是一種外肽酶，是調節血壓的重要因子，主要存在于血管的內皮細胞，在肺毛中含量最為豐富。根據文獻趙海珍，陸兆新，劉戰民等.天然食品來源的血管緊張素轉換酶抑制肽的研究進展[J].中國生化藥物雜志，2004，25(5) :315-317及文獻陳強.血管緊張素轉換酶抑制劑和血管緊張素II受體拮抗劑聯合應用治療腎小球疾病[J].腎臟病與透析腎移植雜志，2001，10(3) :274-277的報道，ACE酶的主要作用有兩個，一個是使得血管緊張素I (AngI)轉化為血管緊張素II (Ang II)，另外一個是使緩激肽失活，以這兩個作用影響腎素一血管緊張素系統(RAS)來完成血壓的調節。血管緊張素II可以與血管組織中的特異性受體AT1相結合，通過血流動力學作用，使得血管收縮，收縮腎小球出球小動脈，使腎血流量下降，腎小球毛細血管內壓升高，緩激肽可以通過血流動力學作用，使血管舒張，舒張腎小球出球小動脈，使腎血流量上升，腎小球毛細血管內壓降低。

發明內容
本發明的目的在于克服上述現有技術的不足，提供兩種高效低毒的抗高血壓活性肽。為實現上述目的，本發明使用以下技術方案兩種抗高血壓活性肽，其氨基酸序列分別為繳氨酸(Val)-異亮氨酸(Ile)-脯氨酸(Pro)(簡稱VIP)和異亮氨酸(lie)-纈氨酸(Val)-脯氨酸(Pro)(簡稱IVP)。本發明選擇了氨基酸的疏水性和氨基酸的空間占位(以分子量為衡量基準)建立了 ACE酶抑制效果(LogIC50)與乳源性抑制肽(3aa)的數學模型 Y=0. 560-0. 540*Xn_0. 007*X21_0. 054*X12+0. 010*X22+0. 696*X13+0. 006*X23。分析抗高血壓活性肽的結構特征，如C-末端的氨基酸殘基的疏水性和其倒數第二個氨基酸的拓撲空間結構，以及結合已知的ACE抑制二肽樣本集，確定乳源抗高血壓小肽的篩選原則C_末端具有疏水性，以Pro、Phe> Trp和Tyr為主；C-末端倒數第二個氨基酸具有較小的拓撲空間。選擇待測三肽序列，并通過構建的QSAR數學模型，對其理論LogIC5tl值進行分析，根據其值的大小確定體內外活性檢測候選小肽序列并進行合成，其中，Xu代表的是結構性質，其中，j = 1，2，3，代表的是乳源三肽中氨基酸的位置，i=l，2，分別代表的是氨基酸的疏水性和分子量，疏水性均取了正值來帶入方程進行運算。所選取的ACE酶抑制活性肽均取自牛奶中主要的蛋白質，所選取出的這些小肽的LogIC50均為正值，即意味著具有ACE酶抑制活性，根據數學方程可知，C末端第一位氨基酸的疏水性具有重要的影響作用，因為，在所篩選出來的小肽中，首位為Ile和Val的小肽的抑制效果較好，即LogIC5tl的值較小。從中篩選出了 6個計算值比較理想的三肽分子異亮氨酸(Ile)-纈氨酸(Val)-脯氨酸(Pro)(簡稱IVP)，LogIC50=O. 2 ;異亮氨酸(Ile)-天冬酰胺(Asn)-脯氨酸(Pro)(簡稱INP), LogIC50=O. 3878 ;異亮氨酸(Ile)-谷氨酰胺(Gln)-脯氨酸(Pro)(簡稱 IQP)，LogIC50=O. 5278;纈氨酸(Val)-異亮氨酸(Ile)-脯氨酸(Pro)(簡稱 VIP)，LogIC50=O. 5855 ;纈氨酸(Val)-亮氨酸(Leu)-脯氨酸(Pro)(簡稱 VLP)，LogIC50=O. 6233 ;賴氨酸(Lys)-賴氨酸(Lys)-酪氨酸(Tyr)(簡稱 KKY)，LogIC50=O. 674)。再通過體外和體內生物活性驗證篩選出2個抗高血壓能力最強的合成三肽IVP和VIP。較佳的，本發明所述三肽分子為直鏈?！け景l明所述三肽可采用本領域常規方法制備，如采用固相多肽合成方法合成，以VIP為例，包括以下具體步驟首先在脯氨酸二氯樹脂上接入芴甲氧羰基異亮氨酸，同時加入TBTU和DIEA進行偶聯，偶聯時間為30分鐘，并用體積比為20%的哌啶/ 二甲基甲酰胺洗滌3次去除末端芴甲氧羰基基團，然后用六氫吡啶進行脫保護，脫保護結束后再用體積比為20%的哌啶/ 二甲基甲酰胺洗滌6次。抽干后加入芴甲氧羰基纈氨酸，TBTU和DIEA進行偶聯，偶聯時間為30分鐘，并用20%的哌啶/ 二甲基甲酰胺洗滌3次，用六氫吡啶進行脫保護，再用體積比為20%的哌啶/ 二甲基甲酰胺洗滌6次抽干，最后通過半制備型反相高效液相色譜(反相柱VYDAC —C18柱(4. 6 X 250mm，5 iim);線性梯度溶液A (溶解于分析純級乙腈的0. l%(v/v)三氟乙酸)，梯度5%-30%(v/v) 25分鐘、100%(v/v) 25. I分鐘、停止30分鐘；溶液B (溶解于純水的0. l%(v/v)三氟乙酸)，梯度95%-70%(v/v) 25分鐘、0% 25. I分鐘、停止30分鐘；流速1. 0毫升/分鐘；分離收集洗脫峰，凍干后備用。IVP、INP、IQP、VLP和KKY的制備方法可同VIP制備方法，除了將VIP制備過程中所用氨基酸脯氨酸、異亮氨酸和纈氨酸替換為所需制備的三肽分子中相對應的位置上的氨基酸即可。本發明的優點是本發明是通過構建定量構效關系(QuantitativeStructure-Activity Relationships, QSAR)數學模型,利用乳源蛋白一級信息，篩選出6個計算值比較理想的具有抗高血壓功能的三肽分子，并通過體外和體內生物活性驗證篩選出2個抗高血壓能力最強的合成三肽。本發明獲得的具有抗高血壓能力的合成三肽，可分別用于抑制血管緊張素轉化酶(ACE酶)的活性，降低血管緊張素II (Ang II)的生成水平，達到降低血壓的效果。其存在于乳源性蛋白中且抗高血壓活性肽具有高效低毒的特點，對于開發治療高血壓藥物和功能食品有著較好的應用前景。由于能通過人工化學合成技術進行大規模制備，為將來藥物開發中低成本和高產率的制備奠定了基礎。


圖I為具體實施方式
中大鼠喂養異亮氨酸(Ile)-脯氨酸(Pro)-脯氨酸(Pro)(簡稱 IPP) (I. 5mg/kg)后收縮壓(Systolic Blood Pressure, SBP)與時間關系。圖2為具體實施方式
中大鼠喂養IVP (I. 5mg/kg)后收縮壓(Systolic BloodPressure, SBP)與時間關系。圖3為具體實施方式
中大鼠喂養VIP (I. 5mg/kg)后收縮壓(Systolic BloodPressure, SBP)與時間關系。圖4為具體實施方式
中空白組大鼠收縮壓收縮壓(Systolic Blood Pressure,SBP)與時間關系。
具體實施例方式實施例I :三肽分子抗高血壓活性測試·實驗材料新西蘭大白兔上海交通大學藥學院動物實驗中心提供；20周齡雄性高血壓模式大鼠(SHR):上海實驗動物中心提供；VPP、IPP、KKY、IVP、INP、IQP、VLP、VIP，吉爾生化(上海)有限公司制備;微量移液器(100 1000 u L, 20^200 u L, 10^100 u L, 0. 5 IOy L)，Eppendorf Ltd ;過濾器(O 50mm),上海醫藥工業研究所；微孔濾膜(①50mm,孔徑為0. 22 ii m),上海摩速科學器材有限公司；Centrifuge 5415 D小型高速離心機，EppendorfLtd ;AKTApurifier 10 層析系統，Superdex 30 prep grade 層析柱(GE Healthcare, USA)；Zorbax SB-C18反相色譜柱(Agilent);摩爾超純水機，上海摩勒科學儀器有限公司；GL-22M高速冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器廠JY2002型電子天平，上海良平儀器儀表有限公司；手提式壓力蒸汽滅菌器，上海醫用核子儀器廠；HWS26型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；Lab Dancer試管振蕩器，IKA Works Guangzhou ；ElectroluxB⑶-252T型冰箱，伊萊克斯(中國)電器有限公司；DW-HW138型超低溫冰箱，中科美菱低溫科技有限責任公司；分析天平，Meitelei-tolido, German ;大鼠血壓計SoftronBP_98A,北京軟隆生物技術有限公司。合成三肽的體外ACE酶抑制活性結果分析馬脲酰組氨酰亮氨酸(hippuryl-L-histidyl-L-leucine,HHL)在 ACE 的催化下快速分解產生馬尿酸(Hippuric Acid, HA)和二肽histidyl-leucine (HL),加入ACE抑制劑后，ACE的活性受到抑制，HA和HL的生成量減少，通過RP-HPLC方法(色譜柱=ZorbaxSB-C18 柱(80 A, 5 y m, 4. 6mmX 250mm ;流動相20%(v/v)分析純乙腈+0. l%(v/v)三氟乙酸；流速I. 0毫升/分鐘)測定228nm下HA的生成量，按公式I評價ACE抑制劑對ACE的抑制率。ACE抑制率(%)=100X (A對照一A樣品)/(A對照一A空白) (公式I)A對照=IOOmM硼酸鈉緩沖液(BBS，pH8. 3)代替三肽時生成HA的峰面積；A#S :三肽樣品時生成HA的峰面積；AS自，鹽酸先于HHL加入時IOOmM硼酸鈉緩沖液(BBS，pH8. 3)代替三肽時生成HA的峰面積；反應體系和條件見表I :表I
權利要求
1.一種抗高血壓活性肽，其特征在于，所述活性肽的氨基酸序列為纈氨酸-異亮氨酸-脯氨酸。
2.如權利要求I所述的抗高血壓活性肽在制備治療或預防高血壓的藥物和食物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種抗高血壓活性肽，其氨基酸序列為纈氨酸-異亮氨酸-脯氨酸；本發明是通過構建定量構效關系數學模型，利用乳源蛋白一級信息，并通過體外和體內生物活性驗證篩選抗高血壓能力最強的合成三肽，本發明獲得的具有抗高血壓能力的合成三肽，可分別用于抑制ACE酶的活性，降低AngII的生成水平，達到降低血壓的效果。其存在于乳源性蛋白中且抗高血壓活性肽具有高效低毒的特點，對于開發治療高血壓藥物和功能食品有著較好的應用前景；由于能通過人工化學合成技術進行大規模制備，為將來藥物開發中低成本和高產率的制備奠定了基礎。
文檔編號A61P9/12GK102786579SQ20121024782
公開日2012年11月21日 申請日期2012年7月17日 優先權日2012年7月17日
發明者張建華, 沈珊齊, 索庚, 薛婷, 趙艷云, 鄧云, 金雅芳, 錢炳俊, 駱亞麗 申請人:上海交通大學