專利名稱：：一種培育抗黃萎病棉花新品種的分子育種方法
技術領域：
：本發明屬于分子育種領域，涉及一種培育抗黃萎病棉花新品種的分子育種方法，具體涉及一種利用海島棉染色體片段導入系培育抗黃萎病棉花新品種的分子育種方法。
背景技術：
：棉花是世界性的重要經濟作物。中國是棉花的生產大國，消費大國和紡織大國。作為棉花生產大國，我國主產棉區覆蓋16個省、市(自治區)，常年植棉面積7000-8000萬畝，總產約600萬噸，占世界總產的四分之一。然而在棉花的生長期內受到各種不同病害的威脅，如被稱為棉花“癌癥”的黃萎病，它在全球都有分布且造成嚴重的經濟損失(CaiYF,HeXH,MoJC,etal.MolecularresearchandgeneticengineeringofresistancetoVerticilliumwiltincotton:Areview[J].AfrJBiotech，2009，8:7363-7372.)。棉花黃萎病是黃萎病菌經土壤傳播、侵染到棉花植株最終引發維管束疾病的一種真菌性病害，具有危害嚴重、分布范圍大、寄主種類多及存活時間長等特點，可造成棉花大量減產甚至絕收(YangC,GuoWZ,LiGY,etal.QTLsmappingforVerticilliumwiltresistanceatseedlingandmaturitystagesforinG.barbadenseL[J].PlantSci,2008,174290-298)ο黃萎病菌屬于真菌的半知菌亞門(Deutermycotina)淡色孢科(Monilaceae)輪枝菌屬(Verticillium)，屬內有若干種；其中危害棉花的有黑白輪枝菌(VerticilliumalboatrumReinke&Berthier)和大麗輪枝菌(VerticilliumdahliaKlebahn)，它們在形態、特征、寄主范圍以及生長特征方面都有所差異。應用傳統育種方法和轉基因技術培育抗病品種是目前最有效和可行的控制棉花黃萎病危害的方法。陸地棉是4個栽培種中種植最廣泛的棉種，它的產量占到當年棉花產量的95%，所以是遺傳研究和育種的主要對象，但是大部分的陸地棉品種均感或耐黃萎病(ChenZJ,SchefflerBE,Dennis,Eetal.Towardsequencingcotton(Gossypium)genomes[J],PlantPhysiol,2007,145:1303-1310.)。海島棉是另一個四倍體栽培種，它的纖維比陸地棉“長、強、細”，同時它高抗或抗黃萎病，因此海島棉是重要的棉優質纖維和抗黃萎病基因的重要來源。育種家們一直想通過海陸種間雜交的方式把海島棉中抗黃萎病的基因導入到陸地棉中去，但是由于連鎖累贅和雜交后代不容易穩定等原因限制了抗病品種的培育。分子標記技術在提高棉花抗黃萎病育種中的應用大大減少了育種過程中選擇的盲目性，快速實現外源優良種質向栽培品種滲透，拓寬了品種的遺傳基礎。國內外研究人員對黃萎病抗性進行了大量的QTL定位研究，有的已經用于標記輔助選擇育種實踐。'^^W^^i^AM(Chromosomesegmentintrogressionlines,CSIL)交，回交和分子標記輔助選擇(marker-assistedselection,MAS)構建的覆蓋作物整個基因組的一系列近等基因系。它的基因組內只有來自供體親本的一個純合的染色體片段，而基因組的其余部分與輪回親本相同。它是進行基因組研究，特別是QTL定位和分子設計育種的理想材料。萬建民(萬建民.作物分子設計育種.作物學報，2006，32(3)=455-462.)已利用由粳稻Asominori(輪回親本)和秈稻IR24(非輪回親本)構建的染色體片段置換系進行了分子育種的實踐。
發明內容本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一種培育抗黃萎病棉花新品種的分子育種方法。本發明的目的可通過如下技術方案實現—種利用海島棉染色體片段導入系培育抗黃萎病棉花新品種的分子育種方法，包含如下步驟(1)以保藏號為CGMCCNO.5574的海島棉染色體片段導入系IL095為母本，保藏號為CGMCCNO.5575的海島棉染色體片段導入系ILlM為父本，雜交1代，再自交1代獲得F2，每代都是單株收獲；(2)分子標記輔助第一次選擇=F2種植，應用CTAB法提取DNA，采用所述的海島棉染色體片段導入系IL095對應的分子標記引物對NAU2626、NAU5061、NAU5024、BNL1026和所述的海島棉染色體片段導入系ILlM對應的分子標記引物對BNL1034、NAU1366、BNL3171進行PCR擴增，選擇同時含有上述7個來源于海島棉的分子標記條帶，分子量分別是2Mbp；340bp；400bp；300bp；220bp；230bp；700bp的單株自交獲得F3，種子按單株收獲；其中分子標記引物對NA似6正/反向序列為SEQIDNO.3/SEQIDNO.4，NAU5061正/反向序列為SEQIDNO.7/SEQIDNO.8，NAU5024正/反向序列為SEQIDNO.5/SEQIDN0.6,BNL1026正/反向序列為SEQIDNO.1/SEQIDNO.2，BNL1034正/反向序列為SEQIDNO.9/SEQIDNO.10，NAU1366正/反向序列為SEQIDNO.13/SEQIDNO.14，BNL3171正/反向序列為SEQIDNO.11/SEQIDNO.12；(3)分子標記輔助第二次選擇種植F3，每株提取DNA后，再利用所述的分子標記引物對NAU2626、NAU5061、NAU5024、BNL1026、BNL1034、NAU1366,BNL3171確定F3單株的基因型，同時具有7個來源于上述海島棉的分子標記條帶，分子量分別是2Mbp；340bp；400bp；300bp；220bp；230bp；700bp的單株即為抗多個黃萎病菌種的育成品系。所述的分子育種方法還包括步驟將步驟C3)篩選到的抗多個黃萎病菌種的F3種植在溫室，利用致病力不同的黃萎病菌株進行抗病性篩選獲得抗多個黃萎病菌種的育成品系。有益效果本發明所提供的一種利用海島棉染色體片段導入系培育抗黃萎病棉花新品種的分子育種方法，與傳統的回交聚合育種技術相比具有如下優點傳統的回交聚合育種技術存在雜交工作量大、選擇可靠性差、育種周期長的缺陷。通過分子標記輔助選擇目標性狀，可在2-3年內快速高效培育出多抗的棉花新品系。本發明以海島棉染色體片段導入系——IL095和ILlM為材料，通過分子標記輔助選擇獲得了抗多個黃萎病菌種的棉花新品系“南農海導5號”，“南農海導5號”抗棉花黃萎病的相對病指為15.51%-20.97%。圖1分子標記輔助選擇抗多個黃萎病菌種的棉花新品系。圖2IL095、IL154和南農海導5號接種3個落葉型的黃萎病菌株后的相對病指。A為IL095、IL154和南農海導5號接種黃萎病菌株V991后的相對病指，B為IL095、IL154和南農海導5號接種黃萎病菌株V07DF2后的相對病指，C為IL095、IL154和南農海導5號接種黃萎病菌株D8092后的相對病指。生物材料保藏證明IL095為陸地棉(Gossypiumhirsutum.)，2011年12月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏號為CGMCCNO.5574；ILlM為陸地棉(Gossypiumhirsutum.)，2011年12月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏號為CGMCCNO.5575。具體實施例方式實施例1選擇親本南京農業大學作物遺傳與種質創新國家重點實驗室棉花研究所以陸地棉遺傳標準系TM-I為輪回親本，抗病、優質的海島棉海71M品系為供體親本(非輪回親本)，在回交高世代結合覆蓋全基因組的SSR分子標記輔助選擇，培育了國內首套陸地棉遺傳標準系TM-I背景的海島棉染色體片段導入系174個，其基因組的覆蓋率達83.5%。黃萎病菌株V991和V07DF2是長江棉區致病力不同的2個落葉型菌株(菌株由江蘇省農業科學院植物保護研究所保存)，黃萎病菌株D8092是黃河棉區的中等致病力的落葉型菌株(菌株由中國農業科學院棉花研究所保存)。利用V991、V07DF2和D80923個不同致病力的菌株在溫室接菌海島棉染色體片段導入系，篩選出抗V991、V07DF2和D80923個菌種的導入系IL095和抗V07DF2和D80922個菌株的導入系IL154。導入系IL095抗3個菌種的相對病指分別是24.55%(V991),27.45%(V07DF2)和25.16%(D8092)。導入系IL154抗3個菌種的相對病指分別是35.60%(V991)、19.56%(V07DF2)和14.05%(D8092)。導入系IL095為陸地棉(Gossypiumhirsutum.)，2011年12月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏號為CGMCCNO.5574；導入系IL154為陸地棉(Gossypiumhirsutum.),2011年12月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏號為CGMCCN0.5575。實施例2(1)2008年夏季在南京農業大學江浦試驗站分別種植IL095和ILlM各一行，IL095(CGMCCN0.5574)為母本，ILlM(CGMCCN0.5575)為父本配制雜交組合產生F1,成熟后全部混收。2008年冬季在海南三亞種植3行F1，自交獲得F2，成熟后全部混收。田間管理按常規方法進行。(2)分子標記輔助選擇2009年夏季在南京農業大學江浦試驗站種植50行F2,每行10-12株，每株采集3-4片未展開的葉片放入1.5ml的印pendorf管中，并加入預冷的新鮮配制的提取緩沖液600μ1，電鉆研磨，應用CTAB法(PatersonAH,BrubakerCL,WendelJF.Arapidmethodforextractionofcotton(Gossypiumspp.)genomicDNAsuitableforRFLPorPCRanalysis[J].PlantMolBiolR印，1993，11，2:122-127)提取DNA，采用IL095(CGMCCNO.5574)和IL154(CGMCCNO.5575)導入片段上的分子標記(表1)進行PCR擴增，擴增體系10μ1，DNA模板1μ1，94°C預變性5min，94°C變性0.5min，57°C復性0.5min，72°C延伸lmin，30個循環后，72°C再延伸lOmin，擴增產物經非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠濃度為8%，電泳緩沖液為0.5倍TBE，170V恒壓電泳1.5小時。選擇含有7個分子標記的50個單株自交獲得F3，種子按單株收獲。(3)2009年冬季在南京農業大學溫室將每一F3種植1行，每行15_25株，每株采集葉片，提取DNA后，利用表1提供的分子標記確定F3株行的基因型，選擇7個標記都是純合的株行(同時具有表1中來源于上述海島棉的7個分子標記條帶)。表1IL095和IL154導入片段的SSR分子標記權利要求1.一種利用海島棉染色體片段導入系培育抗黃萎病棉花新品種的分子育種方法，其特征在于包含如下步驟(1)以保藏號為CGMCCNO.5574的海島棉染色體片段導入系IL095為母本，保藏號為CGMCCNO.5575的海島棉染色體片段導入系ILlM為父本，雜交1代，再自交1代獲得F2,每代都是單株收獲；(2)分子標記輔助第一次選擇F2種植，應用CTAB法提取DNA，采用所述的海島棉染色體片段導入系IL095對應的分子標記引物對NAU2626、NAU5061、NAU5024、BNL1026和所述的海島棉染色體片段導入系ILlM對應的分子標記引物對BNL1034、NAU1366、BNL3171進行PCR擴增，選擇同時含有上述7個來源于海島棉的分子標記條帶，分子量分別是2Mbp；340bp；400bp；300bp；220bp；230bp；700bp的單株自交獲得F3，種子按單株收獲；其中分子標記引物對NA似6正/反向序列為SEQIDNO.3/SEQIDNO.4，NAU5061正/反向序列為SEQIDNO.7/SEQIDNO.8，NAU5024正/反向序列為SEQIDNO.5/SEQIDN0.6，BNL1026正/反向序列為SEQIDNO.1/SEQIDNO.2，BNL1034正/反向序列為SEQIDNO.9/SEQIDNO.10，NAU1366正/反向序列為SEQIDNO.13/SEQIDNO.14，BNL3171正/反向序列為SEQIDNO.11/SEQIDNO.12；(3)分子標記輔助第二次選擇種植F3，每株提取DNA后，再利用所述的分子標記引物對NAU2626、NAU5061、NAU5024、BNL1026、BNL1034、NAU1366、BNL3171確定F3單株的基因型，同時具有7個來源于上述海島棉的分子標記條帶，分子量分別是2Mbp；340bp；400bp；300bp；220bp；230bp；700bp的單株即為抗多個黃萎病菌種的育成品系。2.根據權利要求1所述的一種利用海島棉染色體片段導入系培育抗黃萎病棉花新品種的分子育種方法，其特征在于所述的分子育種方法還包括步驟將步驟C3)篩選到的抗多個黃萎病菌種的F3種植在溫室，利用致病力不同的黃萎病菌株進行抗病性篩選獲得抗多個黃萎病菌種的育成品系。全文摘要本發明屬于分子育種領域，涉及一種培育抗黃萎病棉花新品種的分子育種方法。該方法是以保藏號為CGMCCNo.5574的海島棉染色體片段導入系IL095為母本，保藏號為CGMCCNo.5575的海島棉染色體片段導入系IL154為父本，雜交1代，再自交1代獲得F2，每代都是單株收獲；再以分子標記輔助選擇獲得抗多菌種的棉花新品系。利用這一方法，已經培育出抗多菌種的棉花新品系“南農海導5號”。通過分子標記輔助選擇目標性狀，可在2-3年內快速高效培育出抗多菌種的棉花新品系?！澳限r海導5號”抗棉花黃萎病的相對病指為15.51％-20.97％。文檔編號A01H1/02GK102517396SQ20111045096公開日2012年6月27日申請日期2011年12月29日優先權日2011年12月29日發明者張天真,王鵬,郭旺珍申請人:南京農業大學