專利名稱：：沉默兩個抗性基因防治煙灰虱的方法
技術領域：
：本發明涉及生物
技術領域：
，具體涉及沉默兩個抗性基因防治煙灰虱的方法。
背景技術：
：煙粉風Bemisiatabaci(Gennadius)屬同翅目，粉風科,小粉風屬，又名棉粉風或甘薯粉虱，在亞洲、歐洲、非洲、南美洲、中北美洲、大洋洲等大陸地區均有分布。煙粉虱寄主范圍十分廣泛，主要危害十字花科、茄科、葫蘆科、豆科、菊科、錦葵科等植物。煙粉虱的危害主要來自于其成蟲和若蟲。煙粉虱成蟲、若蟲將ロ針穿過寄主植物細胞間隙深入韌皮部取食，直接刺吸植物汁液，導致寄主作物生長受阻，植株弱小；成蟲產卵時卵柄直接插入葉組織內造成傷ロ為害；其若蟲和成蟲分泌蜜露，誘發煤污病，密度高時，葉片呈現黒色，嚴重影響光合作用。此外，煙粉虱還傳播70種以上的病毒病，引起寄主作物病毒病流行，給農業生產造成了巨大的經濟損失(A.RamiHorowitz,YehezkelAntignusandDanGerling.ManagementofBemisiatabaciWhiteflies,i'heWhitefly,Bemisiatabaci(HomopteraAleyrodidae)InteractionwithGeminivirus-InfectedHostPlants,2011,293-322,DOI10.1007/978-94-007-1524-0_lI)。目前，殺蟲劑是控制煙粉虱危害的重要手段。現在防治煙粉虱的常規藥劑主要包括有機磷類(如毒死蜱、こ酰甲胺磷等)、氨基甲酸酯類(如滅多威、丁硫克百威等)、新煙酰類(吡蟲啉、啶蟲脒、烯啶蟲胺等)以及昆蟲生長調節劑(噻嗪酮、蚊蠅醚)等殺蟲劑。由于煙粉虱本身的生物學特性、殺蟲劑用藥的頻繁性和盲目性等原因，煙粉虱在世界范圍內已經對多種化學農藥產生了抗性(PalumboJC,HorowitzAR,PrabhakerN.InsecticidalcontrolandresistancemanagementforBemisiatabaci.しropProt,2001,20:739-765)。對不同類型的殺蟲劑，煙粉虱有著不同的抗藥性分子機制。對抗吡蟲啉的B型和Q型煙粉虱進行熒光定量PCR檢測發現，煙粉虱體內的ー個P450基因(CYP6CM1)表達量增加了17倍，從而使其對包括卩比蟲啉在內的新煙堿類殺蟲劑產生抗性(IrisKarunker,JuergenBenting,BettinaLueke,etal.Over-expressionofcytochromeP450CYP6CM1isassociatedwithhighresistancetoimidaclopridintheBandQbiotypesofBemisiatabaci(HemipteraAleyrodidae).InsectBiochemistryandMolecularBiology,2008,38:634-644)。煙粉虱對機磷類殺蟲劑的分子抗性機制則可能涉及到羧酸酯酶介導的水解代謝作用的增強和こ酰膽堿酯酶發生點突變而對殺蟲劑的敏感性降低。在抗有機磷類殺蟲劑的B型煙粉虱中，羧酸酯酶基因(coel)的表達量提高了4倍，同吋，こ酰膽堿酯酶基因(acel)在酰基的活性位點發生了突變，最終導致煙粉虱的抗藥性增強(AionM,AlonF,NauenR,etal.Organophosphates'resistanceintheB-biotypeofBemisiatabaci(HemipteraAleyrodidae)isassociatedwithapointmutationinanacel-typeacetylcholinesteraseandoverexpressionofcarboxyIesterase.InsectBiochemistryandMolecularBiology,2008,38:940-949)。RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-strandedRNA,dsRNA)誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象。其作用機制是雙鏈RNA被特異的核酸酶降解，產生干擾小RNA(siRNA)，這些siRNA與同源的靶RNA互補結合，特異性酶降解靶RNA，從而抑制、下調基因表達。RNAi是普遍存在于動物和植物界的ー種防御反應，已經發展成為基因治療、基因功能研究和植物新種質創制的有效的方法。Mao等(MaoYing-bo,Caiffen-juan,WangJia-wei,etal.SilencingacottonboIlwormP450monooxygenasegenebyplant-mediatedRNAiimpairslarvaltoleranceofgossypol.NatBiotechnol,2007,25:1307-1313)構建P450CYP6AE14基因的RNAi載體轉化煙草，轉基因煙草葉片喂食棉鈴蟲幼蟲后發現CYP6AE14轉錄水平明顯下降，并且幼蟲對棉酹的敏感性增強，棉鈴蟲的生長明顯被抑制。Turner等(TurnerCT,Davymw,MacDiarmidRM,etal.RNAinterferenceinthelightbrownapplemoth,Epiphyaspostvittana(Walker)inducedbydouble-strandedRNAfeeding.InsectMolBiol,2006,15:383-391)利用RNAi技術對蘋果褐卷蛾Epiphyaspostvittana(Walker)羧酸酯酶基因(EposCXEl)實現了有效沉默，喂食外源性dsRNA2d后，蘋果褐卷蛾幼蟲中腸EposCXEl轉錄水平小于對照組的1/2。這些研究表明，通過RNAi技術干擾昆蟲體內P450基因和羧酸酯酶基因等部分抗藥性基因的表達，可以實現精確抗蟲，對農業生產具有重大指導意義。
發明內容本發明的目的是針對煙粉虱嚴重危害農業生產的現狀，以煙粉虱抗藥性基因為靶標，提供一種沉默兩個抗性基因防治煙灰虱的方法。根據本發明的沉默兩個抗性基因防治煙灰虱的方法，包括以下步驟I)選取煙粉虱抗藥性CYP6CM1基因和coel基因為RNAi靶基因；2)通過OverlapPCR將CYP6CM1基因和coel基因的部分序列嵌合并以之構建反向重復序列的RNAi載體；3)RNAi載體轉化目標植物，獲得具有防治煙粉虱的轉基因植物。根據本發明的具體實施方式，所述方法包括步驟如下I)根據煙粉虱CYP6CM1基因和coel基因序列，分別設計下列兩對引物F1/R1和F2/R2；FlATGGCGGCAGCTATTGACARlGTTTGGCTTGAACCTGGATGGGATGCCAGAAATCAF2TTCTGGCATCCCATCCAGGTTCAAGCCAAACTCCAR2GCCATACTTTTTCAGCAGGCT2)提取煙粉虱RNA并反轉錄獲得cDNA，以步驟I)引物通過OverlapPCR獲得CYP6CM1基因和coel基因的嵌合基因(嵌合基因序列為SEQNO.I所示)，純化后與pGEM_TEasyVector連接,轉化大腸桿菌JM109,測序吻合,提取質粒DNA。3)以步驟2)DNA為模板，利用下列F3/R3引物(下劃線所示為引入的酶切位點)進行PCR擴增，將PCR產物和中間載體Hurricane用BamHI和HindIII酶切，酶切片段進行連接，得到Hurricane-T；F3CAAGGATCCATGGCGGCAGCTATTGACATGR3TCCAAGCTTTTTCAGCAGGCTGTACCGT4)以步驟2)DNA為模板，利用下列F4/R4引物(下劃線所示為引入的酶切位點)進行PCR擴增，將PCR產物和Hurricane-T以XhoI和SacI酶切，酶切片段進行連接，得到Hurricane-RNAi；F4CAACTCGAGCAGGCTGTACCGTGAATGAGR4CAAGAGCTCATGGCGGCAGCTATTGACATG5)用BamHI和SacI酶切植物表達載體pBI121和Hurricane-RNAi，回收酶切的目的片段，用T4-DNA連接酶連接，獲得RNAi載體。6)農桿菌介導法將RNAi載體轉化煙草，通過硫酸卡那霉素篩選，抗性再生苗生根、移栽，PCR鑒定獲取轉基因煙草。7)將轉基因煙草置于獨立防蟲溫室內，飼養煙粉虱，調查煙粉虱體內抗藥性基因的表達水平和施用殺蟲劑后煙粉虱死亡率，以飼喂非轉基因煙草的煙粉虱為對照。本發明是對以殺蟲劑為主的煙粉虱防治方法的重要補充，利用RNAi干擾煙粉虱抗藥性基因的表達，煙粉虱進食RNAi轉基因煙草后，其體內的抗藥基因CYP6CM1基因和coel基因表達量分別為進食非轉基因煙草煙粉虱的13.34-43.44%和13.25-42.99%;施用新煙堿類殺蟲劑后，RNAi轉基因煙草上的煙粉虱死亡率為96.33%，明顯高非轉基因煙草上的煙粉虱死亡率75.45%;施用有機磷類殺蟲劑后，RNAi轉基因煙草上的煙粉虱死亡率89.01%，明顯高非轉基因煙草上的煙粉虱死亡率43.12%。圖I為BamHI/SacI雙酶切驗證RNAi載體的結果，M=Marker；1:未酶切的RNAi載體；2:酶切后產生的RNAi片段和pBI121質粒片段。圖2顯示CYP6CM1基因和coel基因嵌合的dsRNA發夾結構，LB:T_DNA左邊界；RBT-DNA右邊界；N0S-TN0S終止子；N0S_PN0S啟動子；c_Ccoel基因和CYP6CM1基因的嵌合序列；FAD2intron:擬南芥FAD2基因的內含子；35S_P:CaMV35S啟動子；NPTII:抗卡那霉素性的選擇標記基因。圖3為PCR檢測轉基因煙草中的嵌合基因和FADintron間的序列片段的結果，MMarker；CK:非轉基因煙草；1_6:獨立的轉基因煙草株系。圖4顯示飼喂轉基因煙草的煙粉虱體內CYP6CM1基因和coel基因的相對表達量，CK:飼喂非轉基因煙草的煙粉虱；T1-T6:飼喂1-6號獨立轉基因煙草株系的煙粉虱。圖5顯示飼喂轉基因煙草的煙粉虱施用艾美樂(新煙堿類殺蟲劑)后的死亡率。圖6顯示飼喂轉基因煙草的煙粉虱施用樂果(有機磷類殺蟲劑)后的死亡率。具體實施例方式實施例II、以CYP6CM1基因和coel基因為靶基因的RNAi載體構建(I)選取CYP6CM1基因(IrisKarunker,JuergenBenting,BettinaLueke,etal.Over-expressIonofcytochromeP450CYP6CM1isassociatedwithhighresistancetoimidaclopridintheBandQbiotypesofBemisiatabaci(HemipteraAleyrodidae).InsectBiochemistryandMolecularBiology,2008,38:634-644)和coel基因(AIonM,AlonF,NauenR,etal.Organophosphates'resistanceintheB-biotypeofBemisiatabaci(HemipteraAleyrodidae)isassociatedwithapointmutationinanacel-typeacetylcholinesteraseandoverexpressionofcarboxylesterase.InsectBiochemistryandMolecularBiology,2008,38:940-949)為RNAi革巴基因，并分別根據其序列設計OverlapPCR引物F1/R1和F2/R2FlATGGCGGCAGCTATTGACARlGTTTGGCTTGAACCTGGATGGGATGCCAGAAATCAF2TTCTGGCATCCCATCCAGGTTCAAGCCAAACTCCAR2GCCATACTTTTTCAGCAGGCT(2)收集煙粉虱，以TaKaRaRNAisoReagent(TaKaRa公司)提取煙粉虱RNA，用TaKaRaM-MLVreversetranscriptase(TaKaRa公司)合成cDNA第一鏈。(3)以引物F1/R1和F2/R2分別擴增CYP6CM1基因(424bp)、coel基因(523bp)，PCR反應條件94°C預變性3min，(94°C變性30sec，57°C退火30sec，72°C延伸60sec)35個循環，72°C繼續延伸lOmin。PCR產物在I.O%的瓊脂糖凝膠電泳分離，用AxygenDNAgelextractionkit(Axygen公司)回收純化目的片段。(4)將步驟(3)純化的目的片段混合做模板，以上述引物Fl和R2進行PCR擴增。PCR反應條件94°C預變性3min，(94°C變性30sec，57°C退火30sec，72°C延伸60sec)35個循環，72°C繼續延伸lOmin。PCR產物(916bp)在I.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離，用AxygenDNAgelextractionkit(Axygen公司)回收純化嵌合基因。(5)將步驟⑷純化的嵌合基因與pGEM-TEasyVector(Promega公司)連接，反應體系如下2XBuffer5.OμI,pGEM-TEasyVector0.7μI、PCR產物3.3μI、T4DNA連接酶I.Oμ1，上述成分混勻后16°C連接過夜。連接產物轉化大腸桿菌JM109(生エ生物エ程(上海)有限公司)，步驟如下取一管-70°C保存的感受態細胞，冰盒上融化，加入10μI連接產物，輕搖混勻，冰浴30min;42°C熱激90sec后迅速置冰浴2min，加入400μI液體LB，370CIOOrpm振蕩培養Ih;取200μI培養液均勻涂布于涂有4μIIPTG(200mg/ml)和40μIX-GAL(20mg/ml)的氨芐青霉素(50mg/l)平板上，37°C靜置培養12h。挑取平板上長出的單克隆，在含有氨芐青霉素(50mg/l)的LB液體培養基中37°C、220rpm培養16h，經引物Fl和R2進行PCR鑒定為陽性克隆后進行序列測定,916bp全部序列吻合,隨后用AxygenPlasmidMiniprepKit(Axygen公司)提取質粒DNA。(6)以步驟(5)質粒DNA為模板，利用F3-CAAGGATCCATGGCGGCAGCTATTGACATG和和R3-TCCAAGCTTTTTCAGCAGGCTGTACCGT弓I物(下劃線所示為引入的酶切位點)進行PCR擴增，PCR反應條件94°C預變性3min，(94°C變性30sec，57°C退火30sec，72°C延伸60sec)35個循環，72°C繼續延伸lOmin。PCR產物(925bp)在I.O%的瓊脂糖凝膠電泳分離，用AxygenDNAgelextractionkit(Axygen公司)回收純化PCR產物，用BamHI和HindIII酶切PCR產物和中間載體Hurricane(PeterA.Stoutjesdijk,SurinderP.Singh,QingLiu,etal.hpRNA-MediatedTargetingoftheArabidopsisFAD2GeneGivesHighlyEfficientandStableSilencing.PlantPhysiology,2002,129:1723-1731.由澳大利亞CSIROPlantIndustry提供，改造自文中的iHPconstruct),酶切產物用T4-DNA酶(TaKaRa公司)進行連接，連接產物轉化大腸桿菌JM109(生エ生物工程(上海)有限公司)，挑取平板上長出的單克隆，在含有卡那霉素的LB液體培養基中37°C、220rpm培養16h，經引物F3/R3進行PCR鑒定為陽性克隆后,用AxygenPlasmidMiniprepKit(Axygen公司)提取質粒DNA,命名為Hurricane-T。(7)以步驟(5)質粒DNA為模板，利用F4-CAACTCGAGCAGGCTGTACCGTGAATGAG和R4-CAAGAGCTCATGGCGGCAGCTATTGACATG弓I物(下劃線所示為引入的酶切位點)進行PCR擴增，PCR反應條件94°C預變性3min，(94°C變性30sec，57°C退火30sec，72°C延伸60sec)35個循環，72°C繼續延伸lOmin。PCR產物(919bp)在I.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離，用AxygenDNAgelextractionkit(Axygen公司)回收純化PCR產物，以XhoI和SacI酶切PCR產物和Hurricane-T，酶切產物用T4-DNA酶(TaKaRa公司)進行連接，連接產物轉化大腸桿菌JM109，挑取平板上長出的單克隆，在含有卡那霉素的LB液體培養基中37°C、220rpm培養16h,經引物F4/R4進行PCR鑒定為陽性克隆后，用AxygenPlasmidMiniprepKit(Axygen公司)提取質粒DNA,命名為Hurricane-RNAi。(8)用BamHI和SacI酶切植物表達載體pBI121(Clontech公司)和Hurricane-RNAi,酶切產物在O.8%的瓊脂糖凝膠電泳分離，用AxygenDNAgelextractionkit(Axygen公司)回收純化目的片段，用T4-DNA連接酶(TaKaRa公司)連接，連接產物轉化大腸桿菌JM109(生エ生物工程(上海)有限公司)。挑取平板上長出的單克隆，在含有卡那霉素的LB液體培養基中37°C、220rpm培養16h，用AxygenPlasmidMiniprepKit(Axygen公司)提取質粒DNA,經BamHI/SacI雙酶切驗證后(圖I)，獲得植物表達的RNAi載體(圖2)。2、農桿菌介導轉化煙草2.I農桿菌感受態細胞的制備取-70°C保存農桿菌EHA105(北京Biovector公司)劃線于LB(含有20mg/lrif)平板，28°C培養2d。挑單菌落培養于50ml液體LB(含20mg/lrif)，140rpm，28°C培養至OD600=O.5;農桿菌菌液轉入無菌50ml離心管,4000rpm離心4min,棄上清液,加入5ml預冷O.15MNaCl懸浮細胞，4000rpm離心4min,去上清液；再用O.15MNaCl懸浮細胞，4000rpm離心4min，去上清液；加入3ml預冷20mMCaCl2溶液，輕輕懸浮細胞，冰上放置30min，加入終濃度為15%甘油，混勻后每管分裝ΙΟΟμ1，立即凍存于-70°C。2.2RNAi載體轉化農桿菌取Iμg左右的RNAi質粒DNA加入到100μI農桿菌感受態細胞中，混勻后，冰浴30min;液氮冷凍Imin,取出后37°C水浴2min,冰浴2min;加入Iml液體LB,28°C、140rpm搖培2-3h;離心，10(^1液體1^重懸后涂在含5011^/1KanLB平板上，28°C培養到形成單菌落；單菌落培養于50mg/lKan液體LB，28°C、140rpm搖培16h，取2μI菌液進行PCR驗證，陽性克隆保存備用。2.3農桿菌轉化煙草農桿菌介導的葉盤法轉化煙草為本領域的常規技術，本發明中的轉基因煙草參照以下方法獲得(I)將健康煙草葉片置于大培養皿,用75%こ醇浸泡滅菌Imin,O.I%升萊浸泡滅菌8分鐘，用滅菌水沖洗5次。(2)滅菌濾紙吸去煙葉表面水，用刀片切成小塊。(3)農桿菌28°C下培養至0D600=O.6，浸染葉盤5min。(4)將葉盤轉移到滅菌吸水紙上，吸干表面菌液后轉移到誘導培養基(MS培養基+0.lmg/LNAA+1mg/L6-BA+3%鹿糖+2.5g/Lphytagel,pH5.8)，21°C暗培養兩天(5)將葉盤轉移到選擇培養基(MS培養基+0.lmg/LNAA+lmg/L6-BA+3%蔗糖+2.5g/Lphytagel+500mg/L頭孢霉素+100mg/L卡那霉素,ρΗ5·8)光照培養ー個月左右,保持2830°C，每15天更換一次分化培養基。(6)分化出小苗后，將苗轉移到生根培養基(1/2MS培養基+O.lmg/LNAA+250mg/L頭孢霉素)，25°C光照16h。生根后將卡那霉素抗性苗移栽到土壌。2.4轉基因煙草的DNA提取利用CTAB法提取再生煙草植株葉片DNA，具體步驟如下取O.1-0.5g新鮮葉片，液氮研磨成粉末，轉入I.5ml離心管，加入600μI預熱CTAB裂解液(表I)，渦旋混勻，65°C水浴Ih,加入600μI氯仿-異戍醇(24:I),顛倒50次混勻，IOOOOrpm離心15min,取上清于新I.5ml離心管,加入等體積的預冷異丙醇,充分混勻，-20°C放置30min,12000rpm離心15min，棄上清，加入Iml75%酒精洗滌DNA沉淀，棄酒精，風干，加IOOylTE溶解DNA，4°C儲存備用。表ICTAB裂解液組成成分_mm_1.4MNaCl40.908g0.1MTris.HCl50mlof1.0MTris-HCl(pH8.0)stocksolution20mMNa.EDTA20mlof0.5MEDTA(pH8.0)stocksolution2%CTABIOg2%PVPIOg1%(V/V)P-Me5mlddWater425mlTotal500ml2.5轉基因煙草的PCR檢測用特異引物Carb-Mono-409F:CAGGTTCAAGCCAAACTCCA和FAD-intron96R:TATCGTGAGCGGAGAAATTC進行PCR檢測RNAi載體中的內含子部分序列，目的片段大小為600bp左右，非轉基因煙草為對照。PCR擴增程序如下95°C預變性5min;94°C變性30sec，56で退火3086(3，72で延伸50sec，30個循環；72°C延伸5min。PCR產物經I%瓊脂糖凝膠電泳，電泳檢測結果顯示轉基因煙草植株能擴增出400bp大小的片段，而非轉基因植株沒有擴增到特異條帶(圖3)，證明RNAi框架已經整合至轉基因煙草基因組。3、轉基因煙草防治煙粉虱的效果3.I飼喂轉基因煙草的煙粉虱體內CYP6CM1基因和coel基因表達水平檢測將轉基因煙草置于獨立防蟲溫室內，飼養煙粉虱。煙粉虱進食5天后，收集煙粉虱，以TaKaRaRNAisoReagent(TaKaRa公司)提取煙粉虱RNA，用TaKaRaM-MLVreversetranscriptase(TaKaRa公司)合成cDNA第一鏈。定量PCR檢測CYP6CM1基因(引物ACGGAGCCTTTCAAGTTACCAGA和CGTCTCCGAAAGGCAAATAGGT)和coel基因(引物GATGTCTCACGGCAACTTTACCC和GCCAACTCTGTAATTGAATGTGACA)的表達水平，內參為actin基因(引物TCAGGGTGTAATGGTCGGTA和TGATGATACCGTGCTCGATGG)。以飼喂非轉基因煙草的煙粉虱為對照，飼喂轉基因煙草的煙粉虱體內CYP6CM1基因和coel基因相對表達水平分別為13.34-43.44%和13.25-42.99%(圖4)。3.2飼喂轉基因煙草的煙粉虱對殺蟲劑的敏感性檢測將轉基因煙草置于獨立防蟲溫室內，飼養煙粉虱。煙粉虱進食5天后，分別施用新煙堿類殺蟲劑(70%艾美樂水分散粒劑，購于杭州拜耳作物科技公司)和有機磷類殺蟲劑(40%樂果乳劑，購于江蘇東進農藥化工廠銷售公司)，調查煙粉虱死亡率，以飼喂非轉基因煙草的煙粉虱為對照。用藥3天后，RNAi轉基因煙草上的煙粉虱在施用艾美樂(新煙堿類殺蟲劑)后死亡率為96.33%，明顯高于非轉基因煙草上的煙粉虱死亡率75.45%(圖5)，在施用樂果(有機磷類殺蟲劑)后死亡率為89.01%，明顯高于非轉基因煙草上的煙粉虱死亡率43.12%(圖6)。權利要求1.沉默兩個抗性基因防治煙灰虱的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟1)選取煙粉虱抗藥性CYP6CM1基因和coel基因為RNAi靶基因；2)通過OverlapPCR將CYP6CM1基因和coel基因的部分序列嵌合并以之構建反向重復序列的RNAi載體；3)RNAi載體通轉化目的植物，獲得具有防治煙粉虱效果的轉基因植物。2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟1)根據煙粉虱CYP6CM1基因和coel基因序列，分別設計下列兩對引物F1/R1和F2/R2；FlATGGCGGCAGCTATTGACARlGTTTGGCTTGAACCTGGATGGGATGCCAGAAATCAF2TTCTGGCATCCCATCCAGGTTCAAGCCAAACTCCAR2GCCATACTTTTTCAGCAGGCT2)提取煙粉虱RNA并反轉錄獲得cDNA，以步驟I)引物通過OverlapPCR獲得CYP6CM1基因和coel基因的嵌合基因，嵌合基因序列如SEQNO.I所示，純化后與pGEM-TEasyVector連接，轉化大腸桿菌JM109，測序吻合，提取質粒DNA；3)以步驟2)質粒DNA為模板，利用下列F3/R3引物進行PCR擴增，將PCR產物和中間載體Hurricane分別用BamHI和HindIII酶切,酶切片段再進行連接,得到Hurricane-T,F3CAAGGATCCATGGCGGCAGCTATTGACATGR3TCCAAGCTTTTTCAGCAGGCTGTACCGT；4)以步驟2)質粒DNA為模板，利用下列F4/R4引物進行PCR擴增，將PCR產物和Hurricane-T分別以XhoI和SacI酶切，酶切片段再進行連接，得到Hurricane-RNAi,F4CAACTCGAGCAGGCTGTACCGTGAATGAGR4CAAGAGCTCATGGCGGCAGCTATTGACATG；5)用BamHI和SacI分別酶切植物表達載體pBI121和Hurricane-RNAi，回收酶切的目的片段，用T4-DNA連接酶連接，獲得RNAi載體；6)農桿菌介導法將RNAi載體轉化煙草，通過硫酸卡那霉素篩選，抗性再生苗生根、移栽，PCR鑒定獲取轉基因煙草。3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述RNAi載體含有SEQIDNO.I所示的部分或全部核苷酸序列。全文摘要本發明涉及生物
技術領域：
，具體涉及沉默兩個抗性基因防治煙灰虱的方法。根據本發明的方法包括以下步驟選取煙粉虱抗藥性CYP6CM1基因和coe1基因為RNAi靶基因；通過OverlapPCR將CYP6CM1基因和coe1基因的部分序列嵌合并以之構建反向重復序列的RNAi載體；RNAi載體轉化目的植物，獲得具有防治煙粉虱的轉基因植物。本發明是對以殺蟲劑為主的煙粉虱防治方法的重要補充。本發明利用RNAi技術干擾煙粉虱體內的抗藥性相關基因的表達，為防治煙粉虱提供了技術支持。文檔編號A01H5/00GK102690837SQ20121002565公開日2012年9月26日申請日期2012年2月7日優先權日2012年2月7日發明者劉方,張保龍,王坤波,蔡小彥,陳天子申請人:中國農業科學院棉花研究所,江蘇省農業科學院