專利名稱：控制水稻穗大小基因、其突變體及應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及控制水稻穗大小基因SSPl (Small and Sheathed Panicle I)和突變體sspl基因，以及它們在調控植物株高、葉夾角和穗型等方面的作用機理。本發明還涉及控制水稻穗大小基因SSPl和突變體sspl基因在降低株高提高抗倒能力、減小葉夾角提高光合效率、改變赤霉素響應抑制種子穗發芽等育種方面的應用。
背景技術：
“農以種為先”，提高產量一直是作物遺傳育種研究的主要目標。水稻株型由株高、分蘗數目、分蘗角度葉片夾角以及穗型等構成，也是影響水稻產量的重要因素之一。上世紀60年代以株型改良為特征的矮化育種使得小麥和水稻的產量大幅度提高，而水稻“綠色革命”就是利用了半矮桿sdl基因。SDl編碼赤霉素(Gibberellin，GA)合成基因，其突變使得水稻體內有活性的赤霉素含量下降，導致株高降低，提高植株抗倒伏能力，進而提高產量。目前研究表明，赤霉素促進植物生長發育是通過降解DELLA蛋白而實現的。在植物體內，GA首先與赤霉素受體GIDl蛋白結合，活化的GA-GIDl能與DELLA蛋白相結合，促進GID1-GA-DELLA復合體與GID2 (F-Box)蛋白結合，被泛素化后的DELLA蛋白經由26S蛋白酶解途徑降解，解除了 DELLA蛋白的阻遏作用來促進植物生長的(Jiang and Fu，2007)。小麥的“綠色革·命”基因是赤霉素信號途徑的關鍵元件一DELLA蛋白。目前在黃淮海平原大部分小麥新品種單產可達500公斤/畝，部分品種具有超過600公斤/畝產量的潛力。但在全國范圍的大面積生產中，小麥的平均單產遠低于350公斤/畝。據統計近30年來，小麥產量提高速度緩慢，平均年增長僅為0.7%左右。而根據預測，到2020年，我國小麥單產平均年增加2%以上才能基本滿足需求。因此，要實現小麥自給，必須進一步提高小麥產量潛力，培育出高產、穩產的小麥新品種。同樣，水稻的產量自上世紀60年代水稻“綠色革命”即矮化育種使得中國水稻單產比原有高桿品種提高20-30%。70年代成功采用以雜種優勢利用為手段的雜交稻育種，使水稻單產在矮桿品種的基礎上再增產20%左右，實現水稻產量上的飛躍，為解決我國13億人口的吃飯問題做出了巨大貢獻。然而，目前水稻生產中所應用的矮桿基因都是sdl，來源相當狹窄。矮桿基因利用單一化以及矮桿基因遺傳隱性化，導致了水稻品種遺傳背景單一和狹窄，影響了水稻品種特別是雜交水稻組合的產量潛力進一步挖掘和提高。所以發掘和利用新型矮桿基因十分重要。

發明內容
本發明涉及控制水稻穗大小基因SSPl基因和突變體sspl基因，以及它們在調控植物株高、葉夾角和穗型等方面的作用及其作用機制。本發明還涉及控制水稻穗大小基因SSPl和突變體sspl在植株半矮化提高抗倒能力、減小葉夾角提高光合效率、改變赤霉素響應抑制種子穗發芽等育種方面的應用。本發明人在中國水稻所收集的水稻資源材料中發現其中一個材料具有植株矮化、包穗等表型，通過遺傳雜交，確定這個性狀是受一個顯性基因控制的。進一步遺傳回交，構建了近等基因系，對近等基因系的比較分析發現，該基因除了控制株高外(降低株高對農作物抗倒伏，利于農作物密植增產)，還控制水稻的劍葉和葉夾角的大小，劍葉變短、葉夾角也變小的性狀對提高作物光合效率很重要，控制水稻的穗部性狀(包穗且穗也變小)。根據穗部的突出表型，本發明人將這個突變體命名為水稻穗型突變體sspl (Small andSheathed Panicle I)。sspl穗部性狀不是農業直接應用的優良性狀，但是它的株型和葉型性狀對農業生產非常有利:1)，降低株高，可提高農作物的抗倒伏能力；2)，株型緊湊，可密植；3)，葉片深綠色，本身光合效率較高；4)，葉夾角變小，可提高群體光合效率；5)，改變赤霉素應答反應，可用于抑制種子穗發芽遺傳改良。本發明人的研究工作正是針對上述五個優良性狀開展的。產量是由復雜數量性狀位點QTL(Quantitative Trait Loci)和環境互作所控制，并最終通過調節單位面積的穗粒數和粒重來影響產量。穗型(包括穗長、枝梗數、穗粒數、籽粒大小和結實率等)是影響水稻產量的重要因素之一，而株高和葉片夾角對提高水稻種植密度、提高光能轉換效率和耐肥抗倒性以及提高產量非常重要。水稻穗型突變體sspl表現為植株半矮化和葉片直立等特征，屬典型的nl類矮化類型。為了弄清該突變體矮化株型的遺傳控制基礎，我們利用圖位克隆的方法，克隆了SSPl基因(Small and Sheathed Panicle I)。該基因編碼一個GRAS蛋白，它與水稻SLRl蛋白(水稻中的DELLA蛋白)C端氨基酸序列有較高的相似性。突變的sspl是由2個氨基酸置換突變造成的(參見SEQ ID NO:4)。SSPl基因幾乎在水稻不同發育階段的各個器官和組織部位都有表達，尤其在穗部和穗下節的居間分生組織中表達量最高。轉基因水稻植株中SSPl-GFP融合蛋白定位于細胞核中。赤霉素誘導糊粉層細胞α -淀粉酶活性實驗表明突變的sspl蛋白能抑制赤霉素應答反應，表明sspl參與GA信 號傳導過程，是赤霉素信號傳導中的一個關鍵元件。進一步的酵母雙雜交實驗結果顯示,突變的sspl和野生的SSPl蛋白均不能與赤霉素受體GIDl蛋白相互作用，這說明sspl/SSPl是一個參與赤霉素信號途徑但不依賴于GIDl功能的新的負調控因子。sspl和SSPl蛋白也不能與參與DELLA蛋白降解的F-Box蛋白(GID2)和U-Box蛋白互作，說明sspl/SSPl蛋白穩定性的調控機制與DELLA蛋白SLRl的降解途徑不同。另外，比較氨基酸序列發現，SSPl蛋白與另外一個參與油菜素內酯(BR)的調控因子DLT相似性較高。當利用外源油菜素內酯BR處理sspl突變體時，sspl突變體的第二葉鞘長度和葉夾角能夠恢復到野生型對照植株接近的水平。在sspl突變體背景下，DLT表達量被明顯上調，而另外一個油菜素內酯信號途徑的關鍵基因BUl表達量略有下調。這表明SSPl基因也參與調控油菜素內酯的應答反應。以上實驗結果說明，SSPl可能既參與赤霉素信號傳導，又參與油菜素內酯信號傳導，是兩激素互作的一個關鍵調控元件。具體地，本發明包括下述方面:1.鑒定了水稻穗型突變體sspl的表型。水稻sspl突變體表現為包穗(抽穗不完全)、葉片直立，是一個赤霉素不敏感的半矮桿突變體。遺傳分析表明，植株矮化(抽穗不完全)是受一對顯性基因控制的。樹脂切片實驗結果表明，sspl突變體倒一節莖桿的細胞數目和細胞伸長都受到明顯抑制，表明sspl抑制莖桿的細胞分裂和細胞伸長；同時，sspl突變體葉夾角明顯變小，外源施加油菜素內酯能使葉夾角表型恢復到野生型水平，這說明，SSPl基因參與油菜素內酯的應答反應。2.克隆了 SSPl基因。sspl突變體分別與南京6號(NJ6，一種秈稻)和中花11號(ZH11，一種粳稻)雜交，構建了 SSPl基因的粗(精細)定位群體。通過圖位克隆方法，獲得了 SSPl候選基因。SSPl基因編碼一個GRAS蛋白，其C端與水稻DELLA蛋白SLRl具有較高的序列保守性。獲得候選基因后，通過以下實驗對該候選基因進行了互補驗證:a.遺傳互補實驗:構建自身啟動子+sspl cDNA+3’UTR的載體(pSSPl: sspl-3’UTR)并通過農桿菌介導轉化到日本晴(一種粳稻)中，轉基因植株表現為sspl突變體的表型，具體為:株高變矮、倒一節明顯縮短、葉夾角變小和對外源赤霉素處理不敏感；b.過量表達實驗:構建過表達載體p35S: sspl,并通過農桿菌介導轉化到日本晴中。表型分析發現,過量表達sspl的轉基因水稻表現更為明顯的矮化，且矮化程度與該基因表達水平呈正相關。通過以上實驗確定了該候選基因是目的基因。3.獲得了近等基因系NIL-sspl和NIL-SSP1。構建粳稻(日本晴)和秈稻(南京6號)兩個不同遺傳背景的近等基因系:NIL-sspl和NIL-SSPl。遺傳分析表明，sspl基因在秈稻和粳稻中均表現為顯性遺傳。4.SSPl/sspl基因表達分析。利用RT-PCR方法分析了 SSPl基因在各個發育階段和不同組織器官中的表達情況，包括:花、葉、鞘、葉枕、根、穗下莖節(從下到上0-3cm(居間分生組織區)，3-8cm(伸長區)，8cm以上(成熟區))等組織。結果表明，SSPl基因幾乎在水稻不同發育階段的各個器官組織部位都有表達，尤其在穗部和穗下節的居間分生組織中表達量最高。同SSPl野生型相比，sspl基因表達模式和表達量均沒有明顯的變化。5.SSPl-GFP融合蛋白的亞細胞定位分析。構建了 p35S:HA-SSPl_GFP載體，轉化日本晴，利用共聚焦顯微鏡觀察轉基因植株根部的熒光信號。實驗結果表明，SSPl-GFP融合蛋白定位于細胞核中。另外，GA處理并沒有觀察到細胞核中SSPl-GFP或sspl-GFP融合蛋白量的變化，表明SSPl-GFP融合蛋白穩定性不受GA影響。6.SSPl參與赤霉素信`號途經，但不依賴于赤霉素信號傳導途徑中GIDl和DELLA蛋白的功能。在sspl突變體種子糊粉層細胞中，GA不能誘導淀粉酶活性；其第二葉鞘的生長也不受GA影響。這些結果表明，SSPl參與GA信號傳導過程，是赤霉素信號途徑中的一個關鍵負調控因子。雖然，從氨基酸序列比較來看，SSPl蛋白與SLRl蛋白具有較高的同源性，但酵母雙雜交結果顯示，SSPl和sspl蛋白都不能與赤霉素受體GIDl蛋白互作。這些研究表明SSPl在GA信號傳導途徑中起作用，卻是一個不依賴于GIDl功能的調控因子。同時，SSPl/sspl蛋白也不能與參與SLRl蛋白降解的U-BOX和F-BOX(GID2)蛋白互作，表明SSPl/sspl蛋白穩定性(蛋白降解途徑)的調控機制與SLRl不同。sspl突變體中SLRl蛋白水平沒有明顯改變，而且GA處理也能導致SLRl蛋白的降解，但sspl突變體矮化表型并沒有改變。這些實驗也表明，sspl基因并不依賴于(或影響)DELLA蛋白的功能。7.過量表達SSPl基因也能導致植株矮化、葉夾角變小和包穗等性狀。構建過表達載體p35S:SSpl/SSPl，將其轉化水稻日本晴。轉基因水稻表型分析證實，過量表達SSPl也能導致類似sspl突變體的表型，包括株高、葉夾角和包穗等性狀。在基因表達水平相同時，過量表達sspl有更強的矮化表型。8.SSPl基因參與油菜素內酯(BR)的應答反應。在sspl突變體背景下，參與油菜素內酯信號途徑的調控因子，如:DLT、BU1等基因的表達量都發生了變化。DLT基因表達量得到較為明顯的上調，而BUl的表達量略有下調。當外源油菜素內酯BR處理sspl突變體后，sspl突變體第二葉鞘長度和葉夾角表型等能恢復到野生型表型。這些實驗表明，SSPl基因也參與了調控油菜素內酯應答反應。SSPl既參與了赤霉素信號傳導，又參與了油菜素內酯信號傳導，是兩大激素互作的一個關鍵調控元件。另外，本發明人在進一步的研究中發現，控制水稻穗大小基因SSPl基因在農作物中非常保守，通過Blast發現控制水稻穗大小基因突變體sspl基因在小麥、大麥、玉米、高粱、大豆、棉花、油菜、或擬南芥等植物中的同源基因，可以將它們統稱為控制穗大小基因，這些基因的名稱以及它們的cDNA序列編號可參見表I。根據本發明對控制水稻穗大小基因SSPl及其突變體sspl基因的研究結果，可以推測這些同源基因也具有與控制水稻穗大小基因SSPl及其突變體sspl基因相似的功能。表1:控制水稻穗大小基因突變體sspl基因在其它植物中的同源基因
權利要求
1.控制水稻穗大小基因突變體sspl基因，其編碼的氨基酸序列為SEQID N0:4。
2.根據權利要求1所述的控制水稻穗大小基因突變體sspl基因，其核苷酸序列為SEQID NO:3。
3.—種重組載體，其包含權利要求2所述的控制水稻穗大小基因突變體sspl基因。
4.一種轉基因植物細胞，其轉化了權利要求3所述的重組載體。
5.根據權利要求4所述的轉基因植物細胞，其為下列植物的細胞:水稻、小麥、大麥、玉米、高粱、大豆、油菜、棉花、或擬南芥。
6.根據權利要求5所述的轉基因植物細胞，其為水稻細胞。
7.控制水稻穗大小基因突變體sspl基因的應用，其用于培育具有植株半矮化提高抗倒伏能力、減小葉夾角提高光合效率、改變赤霉素響應抑制種子穗發芽的優點的農作物。
8.一種培育植株矮化耐倒伏、改良農作物穗型和提高葉片光合效率的農作物的方法，其包括通過轉基因技術在所述農作物中組織特異性啟動子過量表達控制水稻穗大小基因SSPl基因或其突變體sspl基因的步驟。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述農作物包括水稻、小麥、大麥、玉米、高粱、大豆、油菜、棉花、或擬南芥。
10.控制水稻穗大小基因突變體sspl基因在小麥、大麥、玉米、高粱、大豆、棉花、油菜、或擬南芥等植物中的同源基因，它們統稱為控制糖大小基因，其cDNA序列為:小麥 TaSSPl-1ikel (Rht-Ala):SEQ ID NO:5 ；大麥 HvSSPl-1ike·:SEQ ID NO:7 ；玉米 ZmSSPl-1ike:SEQ ID NO:9 ；高粱 SbSSPl-1ike:SEQ ID NO:11 ；大豆 GmSSPl-1ike:SEQ ID NO:13 ；棉花 GhSSPl-1ikel:SEQ ID NO:15 ;棉花 GhSSPl-like2:SEQ ID NO:17 ;油菜 BnSSPl-1ikel:SEQ ID NO:19 ；油菜 BrSSPl-like2:SEQ ID NO:21 ；擬南芥 AtSSPl-1ikel:SEQ ID NO:23 ；擬南芥 AtSSPl-like2:SEQ ID NO:25。
全文摘要
本發明涉及控制水稻穗大小基因SSP1(Small and Sheathed Panicle 1)及其突變基因ssp1，以及它們在調控植物株高、葉夾角和穗大小等方面的作用機理，其中來源于控制水稻穗大小基因突變體ssp1基因的序列SEQ IDNO3。本發明還涉及控制水稻穗大小基因突變體ssp1基因在大麥、小麥、玉米、高粱、大豆、棉花、油菜、或擬南芥等植物中的同源基因，它們統稱為控制穗大小基因。本發明還涉及SSP1基因和突變體ssp1基因在控制植物株高、提高耐倒伏能力、減小葉夾角提高光合效率、改變赤霉素響應抑制穗發芽等育種方面的應用。
文檔編號A01H5/00GK103243107SQ20121003046
公開日2013年8月14日 申請日期2012年2月10日 優先權日2012年2月10日
發明者傅向東, 劉正斌, 劉學英, 吳昆 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所