專利名稱：一種鑒別冬蟲夏草的線粒體基因序列和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鑒別冬蟲夏草的線粒體基因序列和方法，具體屬于一種可以用于鑒別冬蟲夏草真?zhèn)魏推焚|(zhì)的線粒體基因序列及其操作方法。
背景技術(shù)：
冬蟲夏草Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc.,別名蟲草,是較常用的名貴中藥材之一。它是由麥角菌科Clavicipitaceae蟲草屬Cordyceps冬蟲夏草菌寄生在高山草甸土中生活的鱗翅目蝙蝠蛾科Ifepialidae昆蟲蝙蝠蛾幼蟲體內(nèi)，經(jīng)過營養(yǎng)生長和生殖生長，形成冬蟲夏草菌的子實(shí)體與僵蟲菌核構(gòu)成的復(fù)合體。冬蟲夏草味甘性平，具有補(bǔ)虛損、益精氣、滋陰潤肺、止血化痰、補(bǔ)腎強(qiáng)壯等功效，常用于治療腎虛、肺氣虛以及腎肺兩虛引起的多種疾病，也多用做提高免疫力、抗癌、保肝、延壽等方面的保健品。目前全世界已知的蟲草種類有380種，其中最有名氣的是冬蟲夏草。真正的冬蟲夏草菌為野生，長于海拔3000-5000米的高原地 區(qū)。主要分布在西藏的那曲地區(qū)、林芝地區(qū)、昌都地區(qū)，青海的玉樹地區(qū)、果洛州一帶，四川的阿壩州壤塘、甘孜州理塘、巴塘、德格，云南迪慶州德欽、中甸以北一帶，甘肅的甘南州瑪曲以西等地。野生冬蟲夏草對生存環(huán)境要求苛刻、分布地區(qū)狹窄、自然寄生率低，造成其天然資源十分稀少。加之冬蟲夏草藥用價值高、效果好，國內(nèi)外對其需求量很大，因此價格非常昂貴，隨之而來的偽劣品也層出不窮，有些偽品根據(jù)形色味也很難與真品區(qū)分。此外，不同產(chǎn)地冬蟲夏草品質(zhì)的差異也是比較大的。所有的蟲草蝠蛾都是狹域分布類型，常常是同一地區(qū)，不同山脈就形成不同的種類，有時同一山脈不同坡向或溝谷也會形成不同的種類[1’2]。其中西藏那曲、昌都蟲草和青海玉樹蟲草的品質(zhì)是最高的，價格也最貴。因此，以其他產(chǎn)地的冬蟲夏草以次充好的現(xiàn)象時有發(fā)生。目前鑒別冬蟲夏草真?zhèn)蔚膶＠饕且罁?jù)冬蟲夏草菌的核苷酸序列進(jìn)行引物設(shè)計，雖然可以鑒定冬蟲夏草的真?zhèn)危遣荒軈^(qū)分其究竟是那曲地區(qū)出產(chǎn)的最優(yōu)質(zhì)的冬蟲夏草，還是別的產(chǎn)地冒充那曲出產(chǎn)的劣質(zhì)的冬蟲夏草，因此不能實(shí)際鑒別出冬蟲夏草的品質(zhì)如何。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可以用于鑒別冬蟲夏草真?zhèn)魏推焚|(zhì)的線粒體基因序列及其操作方法，該方法是從冬蟲夏草寄主昆蟲線粒體基因序列著手，以比較冬蟲夏草寄主昆蟲蝙蝠蛾與鱗翅目與其它昆蟲線粒體基因的差別，尋找高變異區(qū)設(shè)計冬蟲夏草寄主昆蟲蝙蝠蛾的特異引物，通過序列測定得到寄主昆蟲的線粒體相應(yīng)片段序列，并確定核苷酸序列差異小于1-1.5%為同種不同個體之間的變異率，>6%即為同屬不同種之間的變異率，以此標(biāo)準(zhǔn)來鑒定冬蟲夏草的真?zhèn)魏推焚|(zhì)。本發(fā)明提供的一種可以用于鑒別冬蟲夏草真?zhèn)魏推焚|(zhì)的線粒體基因序列，是冬蟲夏草寄主昆蟲當(dāng)雄蝙蝠蛾幼蟲干標(biāo)本經(jīng)基因組DNA提取、通用引物設(shè)計、PCR擴(kuò)增、序列測定、數(shù)據(jù)分析、選定高變異率區(qū)、特異引物設(shè)計后PCR擴(kuò)增得到的核苷酸序列。
本發(fā)明提供的一種可以用于鑒別冬蟲夏草真?zhèn)魏推焚|(zhì)的操作方法，包括如下步驟:I)取西藏當(dāng)雄地區(qū)采集的當(dāng)雄蝙蝠蛾幼蟲，經(jīng)專家鑒定，脫水制備為干標(biāo)本。挑選保存完好，無蟲蛀霉變的干標(biāo)本，將昆蟲干標(biāo)本剪開取出內(nèi)容物，用75%酒精擦拭干標(biāo)本體壁內(nèi)、外側(cè)2-3次以消除外源物質(zhì)的污染。2)取一小節(jié)蝙蝠蛾幼蟲干標(biāo)本(約3-4mm長)，于TE(10mM Tris-HCL, 200mM EDTA,50mM NaCl，pH 9.0)中浸泡48小時后，取出浸泡回軟后的材料采用酚/氯仿法提取蝙蝠蛾總 DNA。3)參考Simon 2006年所發(fā)表的線粒體通用引物序列和已發(fā)表的鱗翅目其它物種引物進(jìn)行首輪擴(kuò)增。未能得到的序列通過在GenBenk中下載相關(guān)昆蟲部分線粒體基因序列或全線粒體基因組序列進(jìn)行ClustalX對比尋找相關(guān)保守區(qū)域，根據(jù)引物設(shè)計的基本原則，使用Primer Primier (Ver.5.0)設(shè)計相關(guān)引物21對,覆蓋了線粒體基因組所有序列。4)根據(jù)21對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測定和拼接，得到完整的當(dāng)雄編fe蛾的線粒體基因組序列。5)結(jié)合GenBank中已有的40個以及本實(shí)驗(yàn)室自行測定的5個(合計45個)鱗翅目昆蟲線粒體基因組序列，比對后以Bombyx mori的基因組注釋為基準(zhǔn)，綠色為基因，紅色為rRNA，黃色為tRNA，灰色的為D-1oop區(qū)進(jìn)行兩兩基因組比較，得到圖1。內(nèi)圈三圈紫色的圓環(huán)分別代表以Bombyx mori為基準(zhǔn)，與三種基因組兩兩比較的結(jié)果。其中，最外圈深紫色的為當(dāng)雄蝙蝠蛾與家蠶比較的結(jié)果，中間為Ochrogaster Iunifer與家蠶比較的結(jié)果,最內(nèi)圈為Papilio maraho與家蠶比較的結(jié)果。中心的圓環(huán)表示45個鱗翅目昆蟲線粒體基因組一起與家蠶比較的結(jié)果:紅色代表分辨率在40 45之間，藍(lán)色為30 39，綠色為20 29,深灰色為小于20。6)依據(jù)圖1結(jié)果，選擇變異率最大且連續(xù)性最好的區(qū)域，分別對應(yīng)于蛋白編碼基因 nad2、cox3 和 atp6。7)針對這三個基因，分別設(shè)計以下三對特異引物:ND2F:ATTTTCGTGCTTCTTA 和 ND2R:TTGAAGATTATTAGTT ；ATP6F:GTAAGTATTGGTCTCT 和 ATP6R:ATGGGTGATTTTGATT ；C0X3F: CCAAGGAACACCAAAT 和 C0X3R:GTAATGAAAATGGAAT。8)三對引物的擴(kuò)增體系為 50μ 1，內(nèi)含 0.5-1μ I TaKaRa LA Taq (5U/μ I),4-6 μ 110XLAPCR Buffer (Mg2+Plus), 7-9 μ I dNTP,上下游引物各 1-2 μ 1，0.5-2 μ I (含20-50ng DNA)模板溶液。9)三對引物PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為預(yù)變性94°C 2分鐘；35個循環(huán)，每個循環(huán)包括變性94°C 20s，退火48-55°C lm，延伸68°C 1_1.5m ;然后延展72°C 10分鐘。10)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用3730測序儀雙向測通，得到三個基因的序列長度分別為:nad21158bp ；atp6 977bp ；cox3 1307bp。11)取被檢樣品提取基因組DNA，采用上述三對特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果可以分別得到3個蛋白編碼基因的序列，且通過Mega軟件計算三個基因聯(lián)合數(shù)據(jù)集中核苷酸序列差異小于1-1.5%，即 為同種不同個體之間的變異率，表明其為真的冬蟲夏草，且其寄主昆蟲為當(dāng)雄蝙蝠蛾；若序列差異>6%，即為同屬不同種之間的變異率，表明其為真的冬蟲夏草，但其寄主昆蟲為當(dāng)雄蝙蝠蛾之外的蝠蛾屬昆蟲。與已有技術(shù)相比本發(fā)明具有以下特點(diǎn):(I)本發(fā)明是以冬蟲夏草菌寄主昆蟲線粒體的3個蛋白編碼基因(nad2、cox3和atp6)序列作為鑒別冬蟲夏草真?zhèn)魏蜋n次(產(chǎn)地)的依據(jù)。這3個蛋白編碼基因?qū)儆邝[翅目線粒體基因組中變異最高的區(qū)域，可以反映冬蟲夏草不同寄主昆蟲之間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近，不僅可以鑒定待測樣品是否為以蝠蛾屬幼蟲為寄主昆蟲而形成的冬蟲夏草，而且可以確定待測樣品的產(chǎn)地，由此可知待測樣品的的真?zhèn)魏蜋n次。(2)本發(fā)明的用于鑒別冬蟲夏草真?zhèn)魏推焚|(zhì)的操作方法步驟簡單、容易操作，加之樣品用量少，可以最大程度的減少樣品損耗。根據(jù)本發(fā)明提供的三對特異引物，可通過檢測樣品中是否存在與之相同或相似的核苷酸序列及其相似度，快速方便地檢測樣品的真?zhèn)魏蜋n次。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1I)取待測冬蟲夏草樣品，挑選保存完好，無蟲蛀霉變的干標(biāo)本，將干標(biāo)本剪下一小段后，剪開取出內(nèi)容物，用75%酒精擦拭干標(biāo)本體壁內(nèi)、外側(cè)2-3次以消除外源物質(zhì)的污染。·2)將樣品置于 TE(10mM Tris-HCL, 200mM EDTA, 50mM NaCl，pH 9.0)中浸泡 48 小時后，取出浸泡回軟后的材料采用酚/氯仿法提取蝠蛾總DNA。3)采用本發(fā)明設(shè)計的三對特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列為:ND2F:ATTTTCGTGCTTCTTA 和 ND2R:TTGAAGATTATTAGTT ；ATP6F:GTAAGTATTGGTCTCT 和 ATP6R:ATGGGTGATTTTGATT ；C0X3F: CCAAGGAACACCAAAT 和 C0X3R:GTAATGAAAATGGAAT。4)三對引物的擴(kuò)增體系為 50 μ 1，內(nèi)含 0.5 μ I TaKaRa LA Taq (5U/ μ I)，5μ 110XLA PCRBuffer (Mg2+Plus), 8 μ I dNTP，上下游引物各 2 μ 1，2 μ I (含 20_50ng DNA)模板溶液。5)三對引物PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為預(yù)變性94°C 2分鐘；35個循環(huán)，每個循環(huán)包括變性94°C 20s，退火48-55°C lm，延伸68°C 1.5m ;然后延展72°C 10分鐘。6)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用3730測序儀雙向測通，得到三個基因的序列長度分別為:nad21158bp ；atp6 977bp ；cox3 1307bpo7)取被檢樣品提取基因組DNA，采用上述三對特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果可以分別得到3個蛋白編碼基因的序列，且通過Mega軟件計算三個基因聯(lián)合數(shù)據(jù)集中核苷酸序列差異小于1-1.5%，即為同種不同個體之間的變異率，表明其為真的冬蟲夏草，且其寄主昆蟲為當(dāng)雄蝙蝠蛾。實(shí)施例2I)同實(shí)施例1。I)同實(shí)施例1。2)同實(shí)施例1。3)同實(shí)施例1。
4)同實(shí)施例1。5)同實(shí)施例1。6)同實(shí)施例1。7)取被檢樣品提取基因組DNA，采用上述三對特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果可以分別得到3個蛋白編碼基因的序列，且通過Mega軟件計算三個基因聯(lián)合數(shù)據(jù)集中核苷酸序列差異>6%，即為同屬不同種之間的變異率，表明其為真的冬蟲夏草，但其寄主昆蟲為當(dāng)雄蝙蝠蛾之外的蝠蛾屬昆蟲。


圖1，46種鱗翅目昆蟲線粒體基因組序列變異情況比較，包括基因組注釋:利用Bombyx mori的基因組注釋為基準(zhǔn)，綠色為基因，紅色為rRNA，黃色為tRNA，灰色的為D-1oop.兩兩基因組比較:內(nèi)圈三圈紫色的圓環(huán)分別代表以Bombyx mori為基準(zhǔn)，于三種基因組兩兩比較的結(jié)果，每段序列以200bp為窗口，200bp為步長。其中，最外圈深紫色的為 H.amxungens 和 B.mori 比較，中間為 Ochrogaster Iunifer 和 B.mori 比較，最內(nèi)圈為Papilio maraho和B.mori比較。坐標(biāo)軸從內(nèi)向夕卜，最內(nèi)代表0，最外代表1，每0.2力口一條基準(zhǔn)線。多種顏色組成的最內(nèi)圈為所有45個基因組一起比較:紅色代表分辨率在40 45之間，藍(lán)色為30 39,綠色為·20 29,深灰色為小于20。
權(quán)利要求
1.一種可以用于鑒別冬蟲夏草真?zhèn)魏推焚|(zhì)的線粒體基因序列，其特征是冬蟲夏草寄主昆蟲當(dāng)雄蝙蝠蛾幼蟲干標(biāo)本經(jīng)基因組DNA提取、通用引物設(shè)計、PCR擴(kuò)增、序列測定、數(shù)據(jù)分析、選定高變異率區(qū)、特異引物設(shè)計后PCR擴(kuò)增得到的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求I所述的一種可以用于鑒別冬蟲夏草真?zhèn)魏推焚|(zhì)的操作方法，其特征在于包括如下步驟 1)取冬蟲夏草寄主當(dāng)雄蝙蝠蛾幼蟲干制標(biāo)本。挑選保存完好,無蟲蛀霉變的干標(biāo)本,將干標(biāo)本剪下一小段后，剪開取出內(nèi)容物，用75 %酒精擦拭干標(biāo)本體壁內(nèi)、外側(cè)2-3次以消除外源物質(zhì)的污染。
2)將樣品置于TE(10mMTris-HCL, 200mM EDTA, 50mM NaCl，pH 9.0)中浸泡48 小時后，取出浸泡回軟后的材料采用酚/氯仿法提取蝠蛾總DNA。
3)設(shè)計相關(guān)引物21對，覆蓋了線粒體基因組所有序列。
4)根據(jù)21對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測定和拼接，得到完整的當(dāng)雄蝙蝠蛾的線粒體基因組序列。
5)結(jié)合GenBank已有的40個以及本實(shí)驗(yàn)室自行測定的5種共45種鱗翅目昆蟲線粒體基因組序列，比對后以Bombyx mori的基因組注釋為基準(zhǔn)獲得鱗翅目昆蟲線粒體基因組蛋白編碼基因高變的區(qū)域。
6)依據(jù)圖I結(jié)果，選擇變異率最大且連續(xù)性最好的區(qū)域，分別對應(yīng)于蛋白編碼基因nad2、cox3和atp6。據(jù)此設(shè)計三對引物分別為ND2F ATTTTCGTGCTTCTTA 和 ND2R TTGAAGATTATTAGTT ；ATP6F GTAAGTATTGGTCTCT 和 ATP6R ATGGGTGATTTTGATT0X3F CCAAGGAACACCAAAT 和 C0X3R :GTAATGAAAATGGAAT。
7)三對引物的擴(kuò)增體系為50μ 1，內(nèi)含 O. 5μ I TaKaRa LA Taq (5U/μ I), 5 μ IlOXLAPCR Buffer (Mg2+Plus)，8 μ I dNTP,上下游引物各 2 μ 1，2 μ I (含 20_50ngDNA)模板溶液。
8)三對引物PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為預(yù)變性94°C2分鐘；35個循環(huán)，每個循環(huán)包括變性94°C 20s，退火 48-55°C lm，延伸 68°C I. 5m ;然后延展 72°C 10 分鐘。
9)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用3730測序儀雙向測通，得到三個基因的序列長度分別為nad21158bp ；atp6 977bp ；cox3 1307bpo 10)取被檢樣品提取基因組DNA，采用上述三對特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果可以分別得到3個蛋白編碼基因的序列，且通過Mega軟件計算三個基因聯(lián)合數(shù)據(jù)集中核苷酸序列差異小于1-1.5%，即為同種不同個體之間的變異率，表明其為真的冬蟲夏草，且其寄主昆蟲為當(dāng)雄蝙蝠蛾；若>6%，即為同屬不同種之間的變異率，表明其為真的冬蟲夏草，但其寄主昆蟲為當(dāng)雄蝙蝠蛾之外的蝠蛾屬昆蟲。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種鑒別冬蟲夏草真?zhèn)魏推焚|(zhì)的線粒體基因序列及其操作方法，該方法通過比較蝙蝠蛾與鱗翅目其它昆蟲線粒體基因的差別，尋找高變異區(qū)。并設(shè)計昆蟲蝙蝠蛾的特異引物，得到寄主昆蟲的線粒體相應(yīng)區(qū)段序列，并確定核苷酸差異率小于1-1.5％為同種不同個體，＞6％為同屬不同種，據(jù)此不僅可以鑒定待測樣品是否為以蝠蛾屬幼蟲為寄主昆蟲而形成的冬蟲夏草，而且可以確定待測樣品的產(chǎn)地，由此可知待測樣品的的真?zhèn)魏蜋n次。該方法步驟簡單、易操作，加之樣品用量少，可以最大程度的減少樣品損耗。根據(jù)本發(fā)明提供的三對特異引物，可通過檢測樣品中是否存在與之相同或相似的核苷酸序列及其相似度，快速方便地檢測樣品的真?zhèn)魏蜋n次。
文檔編號C12Q1/68GK103255200SQ20121003461
公開日2013年8月21日 申請日期2012年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月16日
發(fā)明者張敏, 王莉 申請人:上海立得生物科技有限公司