專利名稱：一種高效溶磷促生菌、由其制備的微生物菌劑及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物菌劑領域，具體地說，涉及一種高效溶磷促生菌、由其制備的微生物菌劑及應用。
背景技術：
(一 )溶磷微生物菌劑發展現狀我國90%以上的耕地缺磷，使用磷肥是解決作物增產的主要措施，磷肥日益成為限制我國農業可持續發展的瓶頸。我國是世界化肥消費第一大國，也是磷肥第一消費大國， 每年磷肥消費量1100萬噸左右。眾所周知，我國磷礦資源缺乏，保有儲量151. 98億噸，再過20年中高品位磷礦開采殆盡(李志寧，2003a，李志寧，200 )，不得不依靠購買國外高價磷礦石保障糧食生產。一些研究顯示，我國磷肥當季利用率僅為3. 22 18% (周曉芬，馬民強，1994 ；張李康，1997 ；崔正忠等，2001 ；周廣業等，1991 ；李云等，2002)。磷肥施入土壤后80 90%很快被土壤固定(范丙全等，1998,200 )，石灰性土壤中有效磷轉變成溶解度極低的磷灰石(lschmidt & Nixon，1944 ;Murrmann & Peech，1968)，而在酸性土壤中形成磷酸鐵和磷酸鋁(Ford，1933)。我國自20世紀70年代使用磷肥以來，土壤磷積累顯著 (林葆，2009)。土壤磷絕大部分以難溶無機磷形態存在，釋放緩慢，作物有效性低。隨著轔肥用量增加，磷肥轉化為極難利用的閉蓄態磷(來路等，200 與高穩定性有機磷(黃慶海等，200 。解決土壤磷的活化與釋放是提高土壤磷和磷肥利用效率的關鍵。因此，增強土壤磷有效性，提高磷肥增產效益，是我國農業可持續發展的必然之路。溶磷微生物是一類具有活化土壤難溶無機磷能力的有益微生物。應用溶磷微生物活化土壤難溶磷是世界公認的安全、經濟和有效的生物措施(Kucey，1988 ；Kamble & Mohite, 1996 ；Morales等，2007 ；El-Gawad等，2009)，倍受各國科學家和政府高度重視。開展高效溶磷微生物研究與利用，對于挖掘土壤磷資源的利用潛力、提高磷肥利用率、節約磷月巴、發揮我國有限磷礦資源的增產作用和農業持續發展意義重大。溶磷真菌(Salih等，1989 ；王延秋等，1993 ；Vassileva, 1998 ；Asea 等，1988 ； Abd-Alla & Omar，2001 ；程淑琴等，2003 ；Wakelin 等，2007 ；Morales 等，2007)和溶磷細菌 (Rasal，等，2004 ；Raychaudhuri，等，2003 ；Orhan，等，2006 ；)都具有顯著增加土壤有效磷、 提高作物產量能力，以及節約磷肥的效果(El-Lateef，1998 ；Suri，等，2006)。同時，溶磷微生物提高磷肥利用率(Tomar等，1994 ；Tomar等，1996 ；Kamble &Mohite, 1996 ；范丙全等， 2004a)，具有改善作物品質的能力(Hamed，2003 ；El-Gawad, 2009)，溶磷微生物對于提高土壤難溶磷和磷肥的生物有效性具有巨大應用潛力。以往研究涉及面非常廣，為溶磷微生物應用提供了技術支撐。然而，長期以來沒有重視溶磷微生物在大范圍、大區域與多種土壤、多種作物的廣泛適應性進行研究，使得大量溶磷菌種很大程度上無法找到更適合的應用土壤與作物，難以發揮溶解土壤磷和增強磷肥有效性的最大潛力。嚴重限制了溶磷菌的使用范圍和應用潛力發揮。對整體溶磷微生物資源而言，可能造成了巨大浪費，由此導致各國溶磷微生物菌劑研究和生產進入更大誤區。一些國家仍然以單株溶磷菌株生產溶磷微生物菌劑，而在全國范圍所有土壤和各種上使用。世界上大型溶磷微生物菌劑公司，如加拿大Wiilom Bios公司使用單株溶磷拜萊青霉菌(Penicillium bilaii) (Kucey，1988，1989)生產微生物菌劑 JumpMart。印度 Ruchi Biochemicals公司使用并生產一種溶磷微生物，推薦在全國使用。比利時生產一株溶磷細菌生產菌劑Wiosphorene (Ahmed等，1999)。我國主要以巨大芽孢桿菌(Bacillus megatarium)生產溶磷微生物菌劑(葛誠，吳薇，1995 ；范丙全，2007)。其他國家情形大致相似。沒有考慮溶磷微生物與地域、土壤類型、作物種類的最佳適配性，溶磷微生物菌劑的使用效果受到嚴重影響。因此，針對我國土壤磷有效性低、難溶磷積累，磷肥利用率持續下降的現狀，并且針對我國缺乏高效廣譜溶磷微生物菌種資源、微生物菌劑產業仍然使用適應范圍窄、溶磷能力低的老菌種的現狀，篩選和培育廣泛適用我國各類主要土壤、多種作物的新的溶磷微生物菌株，是開發高效溶磷微生物菌劑的重要前提。( 二)土傳病害防治菌劑發展現狀我國土傳病害、連作障礙日趨嚴重，造成大面積減產，土傳病害防治是保障糧食安全的必然途徑。土傳病害、連作障礙發生嚴重已經成為我國糧食持續增產的威脅因素。盡管我國對土傳病害進行了長期研究，但是土傳病害、連作障礙防治技術沒有得到有效的解決， 尤其是防治土傳病害、連作障礙的微生物防治技術依然缺乏。發展多功能微生物菌劑，是解決土傳病害、連作障礙防治，確保糧食安全的重大需求。由于人口急劇增長和耕地數量的限制，以及人類對高產出、高收入的追求，連作栽培成為我國農業生產中的常用措施。連作種植出現作物生長發育不良、土傳病害頻繁加重、 產量和品質下降等問題，給我國農業生產造成巨大的經濟損失，是農業可持續發展急需解決的重大課題。農業生產正在朝著無公害、有機農業方向發展，微生物制劑及其應用技術對于發展綠色農業、建立有機食品安全工程體系具有重要作用。我國蔬菜、果樹、花卉已經發展到 4億畝，其中，蔬菜播種面積2. 82億畝，總產量6. 37萬噸。保護地蔬菜超過5000多萬畝， 總產量1. 68億噸，而且有機蔬菜出口基地面積急劇增加；西瓜種植約500-1000萬畝，西瓜連作障礙是世界上長期存在的難題，產量和品質下降。研究表明，黃瓜、番茄、西葫蘆、甜椒等作物連作3年以上，每年產量降低10% -20%，連作4-5年的作物減產40%甚至一半以上。土傳病害、連作障礙對糧食作物發展造成了嚴重危害，我國大豆種植面積大約有1.45 億畝，由于連年種植、病害頻繁且發生面積大，引發作物減產甚至絕收。連作障礙已經成為農業生產發展的瓶頸，研究開發高效防治土傳病害、消除連作障礙的微生物菌劑迫在眉睫。 利用微生物菌劑可提高作物產量、改善作物品質、防治線蟲病害、節約化肥，在提高土壤的持續增產潛力中發揮著重要作用。各國非常重視防治土傳病害的微生物菌劑的產品研發，已經商品化的產品如澳大利亞的K84，放射形農桿菌菌株K84(Agrobacteriumra diobacterstrain k84)在 1973年就被大規模生產，用來防治由根癌病土壤(Agrobacterium tumefaciens)引起的感染(Kerr， A, 1980) ； 1988年Gustafson公司在美國注冊生產A13的PGPR產品Kodiak，成為作物促生菌商業化生產的拓疆者，商業化最成功的產品是Agrobacterium radiobacterK840美國研制的"Topshield (哈茨木霉T2》和以色列研制的"Trichodex (哈茨木霉T39)均是用于防治真菌病害如灰霉病以及以色列Mycontrol公司開發的商品制劑Trichoderma 2000主要用于防治立枯絲核菌、齊整小核菌、疫霉等；盾殼霉也是研究較多的一種生防菌，盾殼霉對核盤菌屬及蔥白腐小菌核菌引起的多種植物病害均有很強的抑制作用。現在國外已有商品化產品出現，如前蘇聯開發的商品制劑Coniothyrin可以用于防治向日葵的菌核病，德國開發的商品制劑ContansWG可以用于防治萵苣的核盤菌菌核病等。此外還有針對粘帚霉的， 由美國研制成功的SoilGard，用于防治猝倒病和根腐等，意大利研制的BiofoxC專用于防治鐮刀菌屬病害等。我國商品化的木霉菌殺菌劑(生菌消，又名滅菌靈)，主要用于防治各種作物的霜霉病(沈寅初，2000)，我國開發的M06抗生菌為鏈霉菌屬，定名為涇陽鏈霉菌， 對黃萎病菌、枯萎病菌、立枯病菌、猝倒病菌等多種植物病害具有抗性，并且可促進植物生長(包建中，1998)。江蘇省農科院植保所防治水稻病害的拮抗細菌(Bacillus subtilis), 大面積示范推廣試驗證明，拮抗菌在水稻植株上定植能力較強，繁殖較快，紋枯病防效達 75% 85%，稻曲病防效63. 8% 85. 7% (陳志誼，2001)。沈陽農業大學生物農藥工程中心利用拮抗木霉和拮抗細菌混合發酵制成粉劑，成功防治了保護地蔬菜和甜瓜的苗期病害，其它報道的細菌殺菌劑還有用來防治黃瓜及煙草炭疽病菌的地衣芽孢桿菌，防治甘蔗黑腐病的枯草芽孢桿菌、熒光假單孢桿菌O^eudomonas radiobacter)防治小麥全蝕病等。微生物菌劑防治土傳病害、連作障礙是當前主要發展方向。大棚蔬菜土壤、大豆連作農田、棉花產區農田、西瓜生產基地農田等是我國土傳病害、連作障礙最為嚴重的地區， 研制、開發和生產防治主要作物土傳病害以及連作障礙，對于我國糧食增產、減少農藥使用量、保障農產品品安全作用巨大。廣適應性(土壤、作物)的溶磷微生物菌種資源為世界范圍內稀缺，且未見有關廣適應性的溶磷微生物菌劑的報道。

發明內容
本發明主要針對我國缺磷和磷肥利用率低、土傳病害嚴重、增產潛力下降的農田現狀，提供一種新的高效溶磷促生菌以及由其制備的微生物菌劑。本發明還通過上述微生物菌劑在防治作物病害及提高產量中的應用。為了實現本發明目的，本發明提供一種高效溶磷促生菌一成團泛菌(Pantoea agglomerans) P36，其分離自我國江蘇錦屏磷礦區植物根際土壤中，現已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏日期2012年2月9日，保藏號CGMCC N0. 5750。成團泛菌P36的微生物學特性為能利用丙二酸、檸檬酸，吲哚、甲基紅、硝酸鹽還原、苯丙氨酸脫氨酶試驗為陽性，明膠液化、脲酶、H2S產生、賴氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶試驗為陰性，發酵葡萄糖產酸。本發明還提供含有成團泛菌P36的微生物菌劑。本發明還提供成團泛菌P36及其微生物菌劑在防治作物病害中的應用。本發明還提供一種復合微生物菌劑，其有效成分為成團泛菌P36和哈茲木霉菌 (Trichoderma harzianum)。優選地，其有效成分為成團泛菌P36和哈茲木霉(Trichoderma harzianum) T-315，哈茲木霉T-315保藏于美國標準微生物保藏中心(ATCC)，保藏號ATCC 20671。
前述復合微生物菌劑中還含有添加劑、粘結劑和保護劑；其中，所述的添加劑為二氧化硅、高嶺土、稻殼粉、麥殼粉、秸稈粉等中的一種或多種；所述粘結劑為膨潤土或水溶性微生物多糖等；所述保護劑為甘油、脫脂奶、植物油、海藻酸鈉、殼聚糖等中的一種或多種。前述溶磷防病復合微生物菌劑由如下重量份的組分組成成團泛菌P36菌劑 1份；哈茲木霉菌劑 1份；添加劑6-12份；粘結劑0. 05-0. 1 份；保護劑0. 01-0. 1 份。優選地，前述復合微生物菌劑由如下重量份的組分組成成團泛菌P36菌劑1份；哈茲木霉菌劑1份；添加劑8-10份；粘結劑0. 05-0. 1 份；保護劑0. 01-0. 1 份。其中，成團泛菌P36菌劑中活菌數為2X 108-3X 108cfu/g，哈茲木霉菌劑中活菌數為 lX107-lX108cfu/go本發明還提供前述溶磷防病復合菌劑在防治作物病害中的應用，所述作物病害包括腐霉病、枯萎病、猝倒病、菌核菌病和/或白絹病等。本發明還提供前述溶磷防病復合菌劑在提高作物產量中的應用，其是將所述溶磷防病復合微生物菌劑與氮肥、磷肥、鉀肥或復合肥混合施用。所述作物優選為水稻、大豆、玉米、小麥、棉花、油菜及其它蔬菜或作物。本發明還提供前述復合微生物菌劑在活化土壤難溶磷以及降低化肥用量中的應用。適宜的土壤為黑土、黑鈣土、沙姜黑土、白漿土、褐土、潮土、鹽潮土、紅壤、水稻土、灰鈣土、灰漠土等。此外，本發明還提供了上述復合微生物菌劑的不同造粒類型，以滿足菌劑與不同作物種子播種的應用，包括與大豆、玉米、棉花、小麥等機械化播種匹配的顆粒菌劑。本發明還提供上述復合微生物菌劑與尿素、二銨、紅色鉀肥、復合肥料等顆粒肥料在機械化施肥中應用。本發明的成團泛菌(Pantoea agglomerans) P36，是一株高效溶磷促生菌，在使用化肥的土壤條件下，它對我國主要土壤和主要作物都表現顯著增產的作用，一般增產10 20%，甚至達到50%以上。以黑土增產最為顯著。適用于大豆、玉米、小麥、棉花、油菜、水稻、蔬菜等主要作物。本發明的溶磷抗病復合微生物菌劑中的哈茲木霉菌(Trichoderma harzianum) T-315，防治作物土傳病害效果顯著。本發明以我國主要土壤為研究對象，進行了廣譜高效溶磷微生物菌種的篩選，獲得了大量溶磷菌株，經過研究比較這些溶磷菌株與我國主要土壤、主要作物的適應性、溶磷能力、增產效果，獲得了一株廣泛適用于我國主要土壤類型、主要作物的高效溶磷的成團泛菌P36，特別適合我國南方、北方、西北、東北、西南等區域的典型土壤，為溶磷微生物在土壤磷轉化、磷肥高效利用和節約磷肥資源等方面提供了菌種資源和技術支撐。本發明將廣泛適應性的高效溶磷增產細菌成團泛菌P36與高效抗作物病害的哈茲木霉真菌有機地結合起來，通過施用本發明的復合菌劑，在高效利用土壤磷素、提高磷肥利用率的同時，充分發揮微生物防治土傳病害的作用，達到了溶磷增產、抗病增產的效果， 具有巨大農業應用價值。本發明的復合微生物菌劑具有高效溶解難溶磷、防治多種病害和促進作物增產的作用，是一種可有效降低化肥用量、節約化肥資源、防治土傳病害、提高作物產量的復合微生物菌劑，其有益效果為(一 )溶解難溶磷、促進作物生長效果顯著；( 二)防治多種作物病害，包括腐霉病、枯萎病、疫病、猝倒病、紋枯病、齊整小核菌 (白絹病)等；(三)該菌劑溶磷效果不受化學肥料影響，使用化肥條件下作物持續增產；(四)使用地域范圍廣，適用于我國黑土、黑鈣土、沙姜黑土、白漿土、褐土、潮土、 鹽潮土、紅壤、水稻土、灰鈣土、灰漠土等；(五)適合提高玉米、大豆、小麥、水稻、棉花、油菜和蔬菜等主要作物的產量；(六)使用簡便，顆粒菌劑可以與大豆、玉米、棉花、小麥播種機一起使用，也可以與多元復合肥、尿素、磷酸二銨、紅色鉀肥等顆粒肥一起機械施用。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。實施例1成團泛菌P36的分離及培養1.溶磷促生成團泛菌P36的培養及溶磷菌P36菌劑的制備(1)成團泛菌P36培養基發酵液配方(kg/t發酵液)磷酸氫二鉀0. 1，磷酸二氫鉀0. 1，氯化鈉4. 3，硫酸鎂 0. 1，淀粉8. 6，牛肉膏4. 3，蛋白胨4. 3，酵母粉4. 3，蔗糖8. 6，硫酸銨2. 6，碳酸鈣10，硫酸亞鐵0. 001，豆油6. 8，以水配制。(2)成團泛菌P36培養過程將成團泛菌(Pantoea aggl0meranS)P36菌株接種于牛肉汁蛋白胨培養基上， 28 30°C培養48h，然后接入IOOOmL三角瓶，在30°C，220r/min下，培養36h。按5%接種量接入到50L種子罐中，在220r/min，pH7. 5，通氣量0. 5vvm下，培養2d后，再按1(^八％接種量轉到500L的發酵罐中，在200r/min，pH7. 5，通氣量0. 7 1. Ovvm下，培養3d。發酵完成后，以！ 13 6倍的高嶺土吸附，即得溶磷菌P36菌劑。2.成團泛菌P36的微生物學特性將菌株P36接種在牛肉膏蛋白胨培養基上，30°C培養，菌落為圓形，表面光滑，顏色為黃色。革蘭氏染色為陰性，周生鞭毛，運動性。菌株P36能利用丙二酸、檸檬酸鹽、硝酸鹽，發酵葡萄糖不產氣；利用阿拉伯糖、木糖、海藻糖、鼠李糖、甘露醇產酸，不能利用衛矛醇產酸；明膠不液化、吲哚、V-P, 、苯丙氨酸脫氨酶、脲酶、精氨酸雙水解酶、賴氨酸脫羧酶試驗為陰性反應。
實施例2高效溶磷抗病增產復合微生物菌劑的制備1.哈茲木霉的培養哈茲木霉(Trichoderma harzianum)T-315，保藏于美國標準微生物保藏中心 (ATCC)，保藏號 ATCC 20671。(1)培養基的組成(kg/t發酵液)可溶性淀粉10kg，黃豆餅粉10kg，玉米粉^g，葡萄糖1kg，蔗糖10kg，酵母粉 5kg, (NH4)2SO4 3kg, K2HPO4 0. 2kg, NaCl 2. 5kg, MgSO4 · 7H20 0. lkg, CaCO3 0. 5kg, FeSO4 0.001kg，硼酸(1% )1L, pH 7.0，以水配制。(2)發酵培養過程將哈茲木霉T-315接種于土豆蔗糖(PDA)培養基上，25 培養3d。將哈茲木霉菌孢子轉接入IOOOmL三角瓶，26-280C，220r/min下液體發酵培養36h。然后按1 %接種量接入50L種子罐，在200r/min、pH7. 0、通氣量0. 7vvm條件下，培養36h后，再按10v/v% 接種量轉入500L發酵罐，在220r/min，pH7. 0，通氣量0. 7 1. Ovvm下，培養3d。加入保護劑海藻酸鈉，以1 3 6倍的二氧化硅吸附。2.高效溶磷抗病增產復合微生物菌劑的制備分別對溶磷成團泛菌P36、哈茲木霉菌T-315進行發酵，發酵后分別加入保護劑海藻酸鈉。成團泛菌P36以高嶺土吸附，活菌數2X 108-3X 108cfu/g。哈茲木霉(Trichoderma harzianum)T-315以二氧化硅吸附，活菌數為1 X IO7-I X 108cfu/g。然后，按照成團泛菌 P36、哈茲木霉菌T-315菌的體積比1 1混合均勻。3.高效溶磷促生抗病復合微生物菌劑造粒向以上吸附、混合好的菌體中加入適量稻殼粉、秸稈粉和膨潤土粘結造粒，根據生產需要形成不同的顆粒粒徑菌劑，用于與玉米、大豆、棉花種子一起機械播種施入土壤，或者與尿素、磷酸二銨、鉀肥、復合肥等顆粒肥料一起機械施入土壤。實驗例1成團泛菌P36培養皿條件下溶磷效果1.從我國江蘇錦屏磷礦區采集植物根際土壤樣品中，分離篩選出成團泛菌P36， 同時，從其他地區土壤樣品分離篩選了溶磷菌株P36、P31、P29-5、P40和P40-2。在室內固體培養皿培養、液體培養基培養條件下，測定了它們的溶磷能力。溶磷菌株P36溶磷圈與菌落直徑比值達到了 2. 83，溶磷圈內溶解的水溶性溶 (P2O5)為2. 2Img ；P31溶磷圈與菌落直徑比值達到了 2. 50，溶磷圈內溶解的水溶性溶(P2O5) 為1. 96mg ；P29-5溶磷圈與菌落直徑比值達到了 2. 81，溶磷圈內溶解的水溶性溶(I32O5)為 2. 20mg ；菌株P40和P40-2的溶磷圈與與菌落直徑比值分別為2. 25和1. 56，溶磷圈內的溶磷量(P2O5)分別為1. 76和1. 22mg,都低于菌株P36 (表1)。表1溶磷菌株在含Ca3(PO4)2培養基上的溶磷圈與菌落的直徑比值(d/D)
權利要求
1.成團泛菌(Pantoeaagglomerans) P36，保藏號 CGMCC NO. 5750。
2.含有權利要求1所述成團泛菌(Pantoeaagglomerans) P36的微生物菌劑。
3.權利要求1所述成團泛菌P36及權利要求2所述微生物菌劑在防治作物病害中的應用。
4.一種復合微生物菌劑，其有效成分為成團泛菌P36和哈茲木霉(Trichoderma harzianum) 0
5.根據權利要求4所述的溶磷防病復合微生物菌劑，其特征在于，所述復合微生物菌劑中還含有添加劑、粘結劑和保護劑；其中，所述的添加劑為二氧化硅、高嶺土、稻殼粉、麥殼粉、秸稈粉中的一種或多種； 所述的粘結劑為膨潤土或水溶性微生物多糖；所述的保護劑為甘油、脫脂奶、植物油、海藻酸鈉、殼聚糖中的一種或多種。
6.根據權利要求5所述的復合微生物菌劑，其特征在于，由如下重量份的組分組成 成團泛菌P36菌劑 1份；哈茲木霉菌劑 1份； 添加劑6-12份；粘結劑0. 05-0. 1份；保護劑0. 01-0. 1份；其中，成團泛菌P36菌劑中活菌數為2X 108-3X 108cfu/g，哈茲木霉菌劑中活菌數為 lX107-lX108cfu/go
7.根據權利要求6所述的復合微生物菌劑，其特征在于，由如下重量份的組分組成 成團泛菌P36菌劑1份；哈茲木霉菌劑1份；添加劑8-10份；粘結劑0. 05-0. 1份；保護劑0. 01-0. 1份。
8.權利要求4-7任一項所述的復合微生物菌劑在防治作物病害中的應用，所述作物病害包括腐霉病、枯萎病、猝倒病、菌核菌病和/或白絹病等。
9.權利要求4-7任一項所述的復合微生物菌劑在提高作物產量中的應用，其是將所述復合微生物菌劑與氮肥、磷肥、鉀肥或復合肥混合施用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于，所述作物為水稻、大豆、玉米、小麥、棉花、油菜。
全文摘要
本發明提供了一種高效溶磷促生菌及由其制備的微生物菌劑，該微生物菌劑的有效成分為成團泛菌(Pantoea agglomerans)P36和哈茲木霉(Trichoderma harzianum)。本發明將廣泛適應性的高效溶磷增產細菌成團泛菌P36與高效抗作物病害的哈茲木霉真菌有機地結合起來，通過施用本發明的復合菌劑，在高效利用土壤磷素、提高磷肥利用率的同時，充分發揮微生物防治土傳病害的作用，達到了溶磷增產、抗病增產的效果，具有巨大農業應用價值。
文檔編號A01P3/00GK102533611SQ201210030659
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月10日 優先權日2012年2月10日
發明者范丙全 申請人:中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所