專利名稱：用于傳毒分子機制研究的無毒褐色桔蚜飼養方法
技術領域：
本發明屬于昆蟲飼養領域，具體的說，涉及一種用于傳毒分子機制研究的無毒褐色桔蚜的飼養方法。
背景技術：
褐色桔姆(Toxoptera citricida, Kirkaldy),又稱東方桔姆，屬于同翅目姆總科Aphidoidea，是一種世界性分布的柑桔害蟲，桔蚜不僅通過直接取食為害柑桔，而且是柑桔衰退病毒(Citrus tristeza virus, CTV)的有效傳播介體。柑桔衰退病毒(Citrus tristeza virus, CTV)屬于長線形病毒屬(Closterovirus),是目前已知植物病毒基因組中最大的病毒。柑桔衰退病毒引起的柑桔衰退病是一種具有經濟重要性的病害，廣泛分布于世界各柑桔產區，對全世界的柑桔產業造成了嚴重的威脅。蚜蟲人工飼料研究始于20世紀30年代，蚜蟲人工飼料飼養技術的出現，使得蚜蟲在脫離寄主植物后得以短期或長期存活。蚜蟲人工飼料可應用于蚜蟲傳播病毒機制、營養生理、共生菌、毒理與殺蟲活性物質生物測定以及昆蟲與植物相互關系等方面的研究，已發展為這些研究的重要試驗手段。植物病毒介體傳播分子機制的研究，主要集中在病毒參與傳播的基因及其產物的確定。目前在昆蟲傳播病毒分子機制的研究中經常使用的方法之一是人工飼養昆蟲，使昆蟲在脫離寄植物后能夠正常存活，在飼養液中添加病毒編碼的蛋白質、特異性蛋白抗體或在飼養液中添加病毒提取液、雙鏈RNA，通過比較傳毒率的變化，探討昆蟲傳播病毒的相關因子，對于一些基因組較小的病毒，使用侵染性克隆缺失突變體進行傳毒分子機制的研究， 但CTV基因組比較大，構建侵染性克隆缺失突變體比較困難，因此，研究傳毒分子機制時需要蚜蟲在脫離寄主植物后得以短期存活，為研究傳毒分子機制，需要尋找適合褐色桔蚜取食和生存的實用飼料。酵母提取液作為實用飼料的成分之一，一方面可以提供營養，另一方面液體黃色對蚜蟲有引誘作用，有利于蚜蟲取食。糖類是生物體內能量的主要來源，對蚜蟲具有刺激取食和營養雙重作用，不同的蚜蟲所需的蔗糖濃度是不同，目前已對桃蚜和豌豆蚜等不少蚜蟲種類已實現了人工繼代飼養，有桔二叉蚜在人工飼養上飼養I代的報道，但尚無褐色桔蚜人工飼養的資料的報道，而且柑桔衰退病毒的蚜蟲傳播分子機理進展不大。

發明內容
本發明的目的在于提供一種無毒褐色桔蚜人工飼養的方法，使蚜蟲在脫離寄主植物后得以短期存活且不影響傳毒效率，以便于無毒褐色桔蚜傳毒分子機制的研究。本發明具體按如下步驟進行(I)利用無毒柑桔苗進行繼代飼養得到無毒褐色桔蚜從田間采桔蚜蟲源，以初孵若蚜建立無毒種群，初孵若蚜是指剛出生尚未接觸葉面的蚜蟲，用脫毒柑桔苗或實生苗在養蟲室內飼養褐色桔蟲牙，養蟲室中設置溫度為25±2°C,光照黑暗為14 : IOh,為了確保連續有新稍可用于飼養蚜蟲，每兩周修剪20株無毒柑桔苗，追施質量分數為O. 5%尿素或復合肥促發新稍，若蚜會形成一個群體，群體太多就會產生有翅蚜蟲。為了抑制有翅成蚜的形成和獲得狀態一致的無翅成蟲，用毛筆輕輕將30頭以上無翅成蟲放在無毒柑桔苗新稍上產下一代若蚜，I 2天后將成蟲轉移到另一無毒苗上，下一代的I 2日齡的無翅成蟲備用。不斷挑用毛筆輕挑無翅成蚜于嫩梢，繼代飼養得到無毒蚜蟲備用；(2)飼養液的配制與滅菌；飼養液為A或B兩種，飼養液A為去離子水配制，其配制成分為NaCl 7 10g/L，KCl O. 05 O. 2g g/L，Na2HPO4 · 12Η202· 9 5g/L, KH2PO4 O. 05 O. 2g/L，酵母提取粉25-50g/L，蔗糖O 600g/L，pH調節為7. O 8. 0，飼養液A在O. IMPa, 121°C下高溫滅菌20分鐘，可在飼養液A中添加用于研究傳毒分子機制的特異性蛋白或者特異性抗體；上述飼養液B為去離子水配制，其配制成分為Tris I. 2 2g/L，EDTA0. 2
0.37g/L，酵母提取粉25-50g/L，蔗糖O 600g/L，pH調節為7. O 8. O，飼養液B在O. IMPa, 121°C下高溫滅菌20分鐘，可在飼養液B中添加用于研究傳毒分子機制的病毒提取液或者雙鏈RNA ；(3)將無毒褐色桔蚜和飼養液放入飼養室中進行飼養飼養室由蚜蟲取食液囊和取食室組成，取食液囊是由雙層拉薄的泊拉膜(Parafilm)夾飼養液滴構成，取食室用直徑
1.5 3cm，高2. 5 5cm的雙通管，飼養時，取食液囊固著于取食室的一端，將蚜蟲放人取食室，另一端圍以紗網，防止蚜蟲逃逸，并可起到通風的作用，每個飼養室中放10 15頭蚜蟲。在飼養室下方放置水槽，保持一定的濕度。將飼養裝置放置在養蟲室中養蟲室中設置溫度為25±2°C，光照黑暗為14 10h。為了優化，上述飼養液A的配制成分為NaCl 7 10g/L，KCl O. I O. 2g g/L, Na2HPO4 · 12H20 2· 9 4g/L, KH2PO4 0· I 0. 2g/L,酵母提取粉 25_50g/L，蔗糖 200 350g/ L，去離子水配制，上述飼養液B的配制成分為Tris I. 2 2g/L，EDTA0. 2 O. 37g/L，酵母提取粉25 50g/L,鹿糖200 350g/L,去離子水配制。上述酵母提取液作為實用飼料的成分之一，一方面可以提供營養，另一方面液體黃色對蚜蟲有引誘作用，有利于蚜蟲取食。糖類是生物體內能量的主要來源，對蚜蟲具有刺激取食和營養雙重作用，不同的蚜蟲所需的蔗糖濃度是不同的，本發明給出了飼養褐色桔蚜優化的蔗糖濃度。有益效果(I)本發明提出的無毒無翅褐色桔蚜蟲在柑桔苗上的繼代飼養，實現了室內、周年飼養褐色桔蚜的目的，可以周年獲得齡期和狀態等較為一致的蟲，克服了以往從自然發生地采集蟲源，所帶來的易受生長狀態及齡期等的影響，導致實驗結果存在差異的缺陷，保證了實驗試蟲的標準化。(2)本發明飼養方法易于操作，飼養室制作簡單，飼養液易于配制，適合褐色桔蚜成蟲取食，實現了成蚜蚜蟲在脫離寄主植物后得以短期正常存活，且不影響傳毒效率，適用于褐色桔蚜傳播柑桔衰退病毒的分子機制的研究。(3)本發明飼養液A中可以添加用于研究柑桔衰退病毒傳毒分子機制的特異性蛋白或者特異性抗體，可在飼養液B中添加用于研究柑桔衰退病毒傳毒分子機制的病毒提取液或者雙鏈RNA ;通過比較傳毒率的變化，探討褐色桔蚜傳播病毒的相關因子，推動了柑桔衰退病毒傳毒分子機制的研究。
具體實施例方式實施例I(I)無毒褐色桔蚜蟲在柑桔苗上的繼代飼養桔蚜采自田間，以初孵若蚜(若蚜是指剛出生的蚜蟲，初孵若蚜是指剛出生尚未接觸葉面的蚜蟲)建立無毒種群，用脫毒柑桔苗或實生苗飼養褐色桔蚜，為了保證一直有嫩稍飼養蚜蟲，在溫度為25±2°C的溫室每周修剪20株無毒柑桔苗，修剪后施質量分數為 O. 5%尿素或復合肥促進發梢，發新稍后移至養蟲室，養蟲室中設置溫度為為25±2°C，光照黑暗為14 10h，為了抑制有翅成蚜的形成和獲得狀態一致的無翅成蟲，用毛筆輕輕將 30頭以上無翅成蟲放在無毒柑桔苗新稍上產若蚜，I 2天后將成蟲轉移到另一無毒苗上， 下一代的I 2日齡的無翅成蟲備用。(2)飼養液的配制與滅菌配制飼養液I. 2g Tris, O. 37g EDTA，調pH于7· 8，25g酵母提取粉，配成O、10%、 20 %、25 %、30 %、35 %、40 %、50 %和60 %不同蔗糖濃度的飼養液，用去離子水配制，定容到 IOOOmL0 121°C下高壓滅菌20分鐘。(3)飼養室的制備飼養室由蚜蟲取食液囊和取食室組成，取食液囊是由雙層拉薄的泊拉膜夾人工飼料液滴構成，取食液囊加入300 μ L的飼養液，取食室用直徑I. 5cm,高2. 5cm的雙通管，飼養時，取食液囊固著于取食室的一端，將蚜蟲放人取食室，另一端圍以紗網，防止蚜蟲逃逸，并可起到通風的作用，每個飼養室中放10頭蚜蟲。在飼養室下方放置水槽，保持一定的濕度。 將飼養裝置放置在養蟲室中，養蟲室中設置溫度為25±2°C，光照黑暗為14 IOh0(4)成蟲在飼養室的飼養及觀察每個蔗糖濃度下有3個飼養室，每個飼養室用毛筆輕挑10頭無翅成蟲放入每個飼養室，記錄詞喂48h后成姆數，結果如表I :稱量新鮮制作的飼養室和飼喂第3天飼養室的重量變化，分析結果如表2 表I不同蔗糖濃度的飼料對無翅成蚜存活的影響
權利要求
1.一種用于傳毒分子機制研究的無毒褐色桔蚜飼養方法，其特征在于按如下步驟進(1)利用無毒柑桔苗進行繼代飼養獲得無毒無翅褐色桔蚜成蟲修剪無毒柑桔苗放入養蟲室中，追施尿素或者復合肥促發新稍，從田間采集初孵若蚜建立無毒種群，將無毒種群放在無毒柑桔苗上飼養，用毛筆輕輕將產生的無翅成蟲轉移到無毒柑桔苗新梢上產生下一代若蚜，I 2天后將成蟲轉移到另一無毒苗上，獲得大量的無毒無翅褐色桔蚜成蟲備用；(2)配制飼養液，滅菌所述飼養液為A或B兩種，飼養液A的配制成分為NaCl7 10g/L，KCl O. 05 O. 2g g/L，Na2HPO4 · 12Η20 2· 9 5g/L, KH2PO4O. 05 0. 2g/L，酵母提取粉25-50g/L，蔗糖O 600g/L，所述飼養液B的配制成分為Tris I. 2 2g/L，EDTA O. 2 O.37g/L,酵母提取粉25-50g/L,鹿糖O 600g/L,飼養液A和飼養液B均為去離子水配制；(3)飼養室飼養姆蟲,然后將無毒褐色桔姆成蟲放入飼養室中進行飼養,飼養室置于養蟲室中。
2.根據權利要求I所述的一種用于傳毒分子機制研究的無毒褐色桔蚜飼養方法，其特征在于所述步驟(2)中飼養液A為去離子水配制，其配制成分為NaCl 7 10g/L，KClO.I O. 2g g/L, Na2HPO4 · 12H20 2· 9 4g/L, KH2PO4 0· I 0. 2g/L，酵母提取粉 25_50g/ L，蔗糖 200 350g/L。
3.根據權利要求I所述的一種用于傳毒分子機制研究的無毒褐色桔蚜飼養方法，其特征在于所述步驟(2)中飼養液B為去離子水配制，其配制成分為=Tris I. 2 2g/L， EDTA0. 2 O. 37g/L，酵母提取粉 25_50g/L，蔗糖 200 350g/L。
4.根據權利要求I所述的一種用于傳毒分子機制研究的無毒褐色桔蚜飼養方法，其特征在于所述步驟(2)中飼養液A或飼養液B均在O. IMPa, 121°C下高溫滅菌20分鐘。
5.根據權利要求I所述的一種用于傳毒分子機制研究的無毒褐色桔蚜飼養方法，其特征在于所述步驟(3)中飼養室為雙通管，雙通管一端由泊拉膜封住，飼養液置于泊拉膜上，蚜蟲置于雙通管道中，雙通管的另一端由紗網封住。
6.根據權利要求I所述的一種用于傳毒分子機制研究的無毒褐色桔蚜飼養方法，其特征在于所述步驟⑴或步驟(3)中養蟲室的參數為溫度為25±2°C，光照黑暗為 14 10h。
全文摘要
本發明公開了一種用于傳毒分子機制研究的無毒褐色桔蚜的飼養方法，包括利用無毒柑桔苗進行繼代飼養得到無毒無翅褐色桔蚜，配制飼養液與滅菌，飼養室的制備及飼養。該方法通過調整無毒柑桔苗上無翅成蚜和下一代若蚜數，有效抑制了有翅成蚜的形成，實現了周年無毒無翅成蚜的獲得，保證了實驗試蟲的標準化。本發明的飼養液簡單易于配制，實現了無翅成蚜在脫離寄主植物后得以短期正常存活，并不影響傳毒效率，適用于蚜蟲傳播柑桔衰退病毒的分子機制研究的需求。
文檔編號A01K67/033GK102578047SQ20121004600
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月27日 優先權日2012年2月27日
發明者劉金香, 周常勇, 宋震, 李中安, 李玲娣, 王永江 申請人:中國農業科學院柑桔研究所