專利名稱：一種誘導鐵皮石斛試管開花的方法
技術領域：
本發明涉及一種鐵皮石斛試管開花方法，屬于農業植物生物技術領域。
背景技術：
鐵皮石斛officinaleKimura i/Zgo)又稱黑節草,屬氣生蘭科草本植物。鐵皮石斛是石斛中的極品，因其表皮呈鐵綠色而得名，是著名的觀賞兼藥用蘭花。因其對生境條件要求苛刻，難開花，在栽培條件下，從種子萌發到開花通常需要3 4 年[1]。而應用植物生物技術誘導鐵皮石斛開花，具有操作簡單、生長條件可控，重復性強，周期短的特點，并可為研究植物開花機理和生理研究，提供了更精準的研究手段和良好的實驗系統。因此，鐵皮石斛試管花的誘導對提高植物開花機理研究具有非常重要的意義。植物生長調節劑中，細胞分裂素既能促進花芽分化，又可促進營養芽分化，所以研究中通常應考慮使用不同種類和濃度的細胞分裂素。鄭立明[2]、朱國兵M等人對蘭花試管開花研究表明，6-BA可以誘導花芽形成，但是易產生畸形花。石斛屬植物開花過程中內源激素變化，以及植物生長調節劑如GA，BA等對開花的誘導與調控等等亦有一些研究[4_13]。目前對于在對鐵皮石斛試管開花的研究報道中，多采用6-BA、NAA等不同濃度激素，或添加一定量的PP333、TDZ等進行誘導，雖可獲得一定的開花誘導率[1’14’15]，但是植株生長較弱， 葉片卷曲，花朵較小，且常出現花器官不完整的花朵。

發明內容
本發明提供了一種鐵皮石斛試管開花的方法，誘導鐵皮石斛開花，從而提高鐵皮石斛成花率。本發明的目的是通過以下技術方案實現
本發明提供的一種鐵皮石斛試管開花的方法，包括以下步驟
(1)壯苗培養階段采用鐵皮石斛莖段離體培養的原球莖為試驗材料，以1/2MS為基本培養基，蔗糖3%，添加NAA0. 5-1. 0 mg/L和6-BA I. 5-2. 5 mg/L，采用LED光源，在光照強度 35 — 55//mo I. HT2. s—1，波長 600 690 nm，光照時間12 -16 h/d，培養溫度 25±2°C 的條件下進行壯苗培養50-80 d ；
(2)誘導開花階段I:培養基I為1/2 MS基本培養基+PP333 0 . 50 - I. 50 mg/L+ABA
0.5-1. 0 mg/L,另在培養基I中附加體積比為10%-20%的香蕉汁、0. 1%-0. 5%活性炭，采用 LED光源，在光照強度50 - 75// mol. m—2. s—1，波長600 690 nm，培養溫度26±2°C的條件下，培養20-30 d ；
(3)誘導開花階段II:誘導開花階段I完成后，進入誘導開花階段II，培養基II為 1/2 MS 基本培養基+TDZ 0. 05-1. 00 mg/L + 6-BA 0.5-1.0 mg/L,另在培養基 II 中附加體積比為10%-20%的香蕉汁、0. 1%-0. 5%活性炭，采用LED光源，在光照強度50 — 75// mol. nT2. s—1，波長490 590 nm，培養溫度15±2°C的條件下，培養20_30d，進入誘導開花階段I ;
所述1/2 MS基本培養基，指的是大量元素減半，其余含量不變；
3通過上述(2)與(3)即誘導開花階段I-誘導開花階段II-誘導開花階段I的交替培養誘導后，進入開花培養階段；
(4)開花培養階段以MS為基本培養基，添加6-BA 0. 5-1.5 mg/L和馬鈴薯100-200 g/ L，采用LED光源，在光照強度65 — 85//mol. nT2. s—1，光照時間12 -16 h/d，波長600 690 nm，培養溫度26±2°C的條件下進行開花培養。本發明的誘導鐵皮石斛開花的方法，可以準確有效地誘導鐵皮石斛花芽的形成，以及調控鐵皮石斛試管開花率；在鐵皮石斛花芽形成的最關鍵階段，通過溫度刺激、 以及PP333, ABA, TDZ和BA的共同協同調節作用，顯著激活鐵皮石斛試管苗開花的關鍵因子，從而提高鐵皮石斛成花率。本發明的方法可誘導健壯植株，花型大，其開花誘導率為 90. 5%-96. 7%，花器官完整的花朵高達98. 5% — 100%。
具體實施例方式實施例I
首先以鐵皮石斛莖段為外植體離體培養原球莖(MS+1.0 mg T1 6-BA+1. 0 mg T1 NAA+30 g L—1蔗糖+7. 0 g L—1瓊脂，pH為5. 4的培養基，進行原球莖的誘導與增殖)，然后將原球莖進行如下培養與誘導
(I)壯苗培養階段以1/2 MS為基本培養基，蔗糖3% (w/v)，添加NAA0. 5 mg/L和 6-BA 2. 0 mg/L的培養條件,在光照強度40//mol. m_2. s'波長600 nm，光照時間12 h/d,培養溫度25°C的條件下進行壯苗培養60 d。(2)誘導開花階段I :以1/2 MS為基本培養基，添加PP333L 00 mg/L+ABA 0. 5 mg/ L,在光照強度60// mol. m_2. s'波長600nm，培養溫度26°C，附加香蕉汁14% (v/v)，活性炭0.15%的培養條件下，培養23 d后，進入誘導階段II。(3)誘導開花階段II :以1/2 MS為基本培養基，添加TDZ 0. 06 mg/L +BA 0.8 mg/ L,在光照強度65// mol. m_2. s-1，波長530 nm,培養溫度15。。，附加香蕉汁13% (v/v)，活性炭0.35%的培養條件下，培養22 d后，進入誘導階段I。通過上述(2)與(3)即誘導開花階段I--誘導開花階段II--誘導開花階段I 的交替培養誘導后，進入開花培養階段。(4)開花培養階段以MS為基本培養基，添加6-BA 0. 55 mg/L和馬鈴薯120 g/L， 在光照強度75// mol. m_2. s'光照時間14 h/d,波長630 nm,培養溫度26°C條件下進行開花培養。開花誘導率為93. 5%，花器官完整的花朵高達98. 5%。實施例2
采用鐵皮石斛莖段離體培養的原球莖進行如下培養與誘導
(I)壯苗培養階段以1/2 MS為基本培養基，蔗糖3% (w/v)，添加NAA0. 8 mg/L和 6-BA I. 7 mg/L的培養條件,在光照強度35//mol. m_2. s—1,波長650 nm，光照時間14 h/d,培養溫度24°C的條件下進行壯苗培養55 d。(2)誘導開花階段I :以1/2 MS為基本培養基，添加PP333O- 80 mg/L+ABA 0. 8 mg/ L,在光照強度55// mol. nT2. s—1，波長660 nm,培養溫度25°C，附加香蕉汁10% (v/v)，活性炭0.3%的培養條件下，培養25 d后，進入誘導階段II。(3)誘導開花階段II :以1/2 MS為基本培養基，添加TDZ 0. 05mg/L +BA I. 0 mg/L,在光照強度55// mol. m_2. s-1，波長490 nm,培養溫度14。。，附加香蕉汁20% (v/v)，活性炭0. 15%的培養條件下，培養25 d后，進入誘導階段I。通過(2)、(3)交替培養誘導后，進入開花培養階段。(4)開花培養階段以MS為基本培養基，添加6-BA I. 0 mg/L和馬鈴薯150 g/L, 在光照強度68// mol. m_2. s'光照時間15 h/d,波長600 nm,培養溫度28°C條件下進行開花培養。開花誘導率為95. 5%，花器官完整的花朵高達99. 5%。實施例3
采用鐵皮石斛莖段離體培養的原球莖進行如下培養與誘導
(I)壯苗培養階段以1/2 MS為基本培養基，蔗糖3% (w/v)，添加NAA1.0 mg/L和 6-BA 2. 5 mg/L的培養條件,在光照強度55//mol. m_2. s'波長690 nm，光照時間16 h/d,培養溫度27°C的條件下進行壯苗培養80 d。(2)誘導開花階段I :以1/2 MS為基本培養基，添加PP333I- 50 mg/L+ABA I. 0 mg/ L,在光照強度75// mol. nT2. s—1，波長690 nm,培養溫度28°C，附加香蕉汁20% (v/v)，活性炭0.5%的培養條件下，培養30 d后，進入誘導階段II。(3)誘導開花階段II :以1/2 MS為基本培養基，添加TDZ 1.00 mg/L +BA 0.5 mg/ L，在光照強度75//mol. nT2. s—1，波長590 nm，培養溫度16°C，附加香蕉汁15% (v/v)，活性炭0. 5%的培養條件下，培養28 d后，進入誘導階段I。通過(2)、(3)交替培養誘導后，進入開花培養階段。(4)開花培養階段以MS為基本培養基，添加6-BA I. 5 mg/L和馬鈴薯200 g/L, 在光照強度85// mol. nT2. s—1，光照時間16 h/d,波長690 nm,培養溫度24°C條件下進行開花培養。開花誘導率為96. 5%，花器官完整的花朵高達100%。參考文獻
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1.一種鐵皮石斛試管開花的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)壯苗培養階段采用鐵皮石斛莖段離體培養的原球莖為試驗材料，以1/2MS為基本培養基，蔗糖3%，添加ΝΑΑ0. 5-1. O mg/L和6-BA I. 5-2. 5 mg/L，采用LED光源，在光照強度 35 — 55//mo I. πΓ2. s—1，波長 600 690 nm，光照時間12 -16 h/d，培養溫度 25±2°C 的條件下進行壯苗培養50-80 d ；(2)誘導開花階段I:培養基I為1/2 MS基本培養基+PP333 O. 50 一 I. 50 mg/L+ABA O. 5-1. O mg/L,另在培養基I中附加體積比為10%-20%的香蕉汁、O. 1%-0. 5%活性炭，采用 LED光源，在光照強度50 - 75// mol. πΓ2· s—1，波長600 690 nm，培養溫度26±2°C的條件下，培養20-30 d ；(3)誘導開花階段II:誘導開花階段I完成后，進入誘導開花階段II，培養基II為 1/2 MS 基本培養基+TDZ O. 05-1. 00 mg/L + 6-BA O. 5-1. O mg/L,另在培養基 II 中附加體積比為10%-20%的香蕉汁、O. 1%-0· 5%活性炭，采用LED光源，在光照強度50 — 75// mol. πΓ2. s—1，波長490 590 nm，培養溫度15±2°C的條件下，培養20-30d，進入誘導開花階段I ;其中1/2 MS，指的是大量元素減半，其余含量不變；通過上述(2)與(3)即誘導開花階段I-誘導開花階段II-誘導開花階段I的交替培養誘導后，進入開花培養階段；(4)開花培養階段以MS為基本培養基，添加6-BAO. 5-1.5 mg/L和馬鈴薯100-200 g/ L，采用LED光源，在光照強度65 — 85//mol. πΓ2. s—1，光照時間12 -16 h/d，波長600 690 nm，培養溫度26±2°C的條件下進行開花培養。
全文摘要
本發明涉及一種鐵皮石斛試管開花方法，屬于農業植物生物技術領域。該方法包括以下步驟采用鐵皮石斛莖段離體培養的原球莖為試驗材料，進行壯苗培養50-80d；再經過誘導開花階段I--誘導開花階段II--誘導開花階段I的交替培養誘導后，進入開花培養階段。本發明的誘導鐵皮石斛開花的方法，可以準確有效地誘導鐵皮石斛花芽的形成，以及調控鐵皮石斛試管開花率；本發明的方法可誘導健壯植株，花型大，其開花誘導率為90.5%-96.7%，花器官完整的花朵高達98.5%-100%。
文檔編號A01H4/00GK102577963SQ20121004925
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月29日 優先權日2012年2月29日
發明者劉狄, 劉生財, 吳高杰, 林玉玲, 賴鐘雄, 陳發興 申請人:福建農林大學