中國鱟素組成型畢赤酵母陽性表達菌株的制作方法
【專利摘要】一種中國鱟素組成型畢赤酵母陽性表達菌株，屬于生物【技術領域】。本發明菌株為中國鱟素組成型畢赤酵母陽性表達菌株，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏號為CGMCC?No.5462。本發明菌劑，其活性成分為中國鱟素組成型畢赤酵母陽性表達菌株，CGMCC?No.5462。本發明應用的兩個關鍵點在于：一是抗菌肽的高效表達。抗菌肽是動物的體內成分之一，是一類小分子短肽，具有安全、無殘留、無毒副作用的良好特性，是理想的安全抗菌制劑，無任何毒副作用，對多種病毒和細菌性疾病均有顯著的預防效果，同時具有改善畜禽生產生長性能、減少機體發病的作用，能有效替代飼用抗生素或化學合成藥物的使用，具有良好的推廣應用前景。二是酵母菌體蛋白。發酵產物富含生物活性蛋白、優質的維生素及促生長因子，可顯著提高機體免疫力和健康水平。具有天然酸、甜、酒曲、酵母芳香味，誘食效果佳，可顯著提高畜禽出欄重。
【專利說明】中國鱟素組成型畢赤酵母陽性表達菌株
【技術領域】
[0001 ] 本發明屬于生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]鱟是一種極其珍貴的海洋無脊椎動物，也是海洋動物界現存的“活化石”，其經濟價值和科研價值很高。鱟缺乏獲得性免疫系統，在抵抗病原侵襲的過程中形成了多種天然防御系統，在這些防御系統中，鱟素(tachyplesin)發揮了主要的抗病原作用。鱟素是一類存在于鱟血細胞中的具有抗菌活性的陽離子多肽，它的發現被醫學界稱為“抗生素”研究的一個里程碑，是后抗生素時代到來的標致。自1988年日本學者Nakamura T從東方鱟中分離提取鱟素以來，鱟素的研究引起了人們的廣泛關注，現己知道，鱟素是一種2.3Ku的陽離子抗菌肽，由17個氨基酸組成，形成2個二硫鍵，其羧基端帶有I個a精氨酰胺，1988年這種肽被命名為Tachyplesin I。研究表明，鱟素具有以下抗菌特性:(I)殺菌活力高，致死濃度均在U mo I/L級；⑵作用迅速，往往在幾秒或幾分鐘內可將99%以上的病原殺滅；(3)對真核生物細胞無毒性；(4)活性穩定，比較耐熱，100°C處理30min不喪失其抗菌活性；(5)在高鹽環境下同樣具有抗菌活性，這是海洋抗菌肽的一個重要特征。鱟素的抗微生物作用己遠遠超過目前抗生素藥物的作用范疇，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌及囊膜病毒均能產生有效的殺傷作用，且沒有耐 藥性問題，因此應用前景十分誘人。

【發明內容】

[0003]本發明的目的是提供一種中國鱟素組成型畢赤酵母陽性表達菌株。
[0004]本發明菌株為中國鱟素組成型畢赤酵母陽性表達菌株，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏號為CGMCC N0.5462。
[0005]本發明菌劑，其活性成分為中國鱟素組成型畢赤酵母陽性表達菌株，CGMCCN0.5462。
[0006]本發明中國鱟素組成型畢赤酵母陽性表達菌株在飼料添加劑中的應用。
[0007]本發明作為飼料添加劑的優勢在于:一是高效綠色，表達的抗菌肽可具有廣譜的抗細菌、抗病毒、抗霉菌等廣泛的生物學效應，且不產生耐藥性，無殘留；二是補充蛋白，酵母菌本身是高蛋白的飼料添加劑和胃腸道正常菌群的一部分，可以同時起調節胃腸菌群和補充營養的作用。用它表達的藥用蛋白不需進行大量的宿主安全性實驗，外源蛋白的分泌型表達使其純化更加簡便。三是兼顧抗生素，酵母菌由于對抗生素和抗菌藥具有抗性，解決了目前微生態制劑不能同時應用抗生素的弊端。而且，己報道陽離子抗菌肽與傳統抗生素聯合用藥時會產生協同作用。因此，基因工程抗菌肽酵母制劑是一種適合在畜牧業推廣應用的、有益于肉類產品質量和安全的新型飼料添加劑，具有廣闊的應用開發前景。
[0008]本發明應用的兩個關鍵點在于:一是抗菌肽的高效表達。抗菌肽是動物的體內成分之一，是一類小分子短肽，具有安全、無殘留、無毒副作用的良好特性，是理想的安全抗菌制劑，無任何毒副作用，對多種病毒和細菌性疾病均有顯著的預防效果，同時具有改善畜禽生產生長性能、減少機體發病的作用，能有效替代飼用抗生素或化學合成藥物的使用，具有良好的推廣應用前景。二是酵母菌體蛋白。發酵產物富含生物活性蛋白、優質的維生素及促生長因子，可顯著提高機體免疫力和健康水平。具有天然酸、甜、酒曲、酵母芳香味，誘食效果佳，可顯著提高畜禽出欄重。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1是溫度和糖濃度對表達上清影響的二維響應面圖；
圖2是溫度和pH值對表達上清影響的三維響應面圖；
圖3是糖濃度和pH值對表達上清影響的三維響應面圖；
圖4是自控罐發酵操作各因素曲線圖；
圖5是搖瓶和發酵罐發酵產物Tricine-Glycerol-SDS-PAGE結果比較；
圖6是薄層掃描比較分析結果；
圖7是表達上清凍干粉Tricine-SDS-PAGE鑒定；
圖8是表達上清凍干粉；
圖9是表達上清的質譜分析結果；
圖10是鱟素高效液相色譜標準曲線；
圖11是高效液相色譜分析TP I表達上清。
【具體實施方式】
[0010]本發明菌株為中國鱟素組成型畢赤酵母陽性表達菌株，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏號為CGMCC N0.5462。
保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號 保藏日期:2011年11月16日 保藏編號:CGMCC N0.5462 分類命名:巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris。
[0011]本發明菌劑，其活性成分為中國鱟素組成型畢赤酵母陽性表達菌株，CGMCCN0.5462。
[0012]本發明中國鱟素組成型畢赤酵母陽性表達菌株在飼料添加劑中的應用。
[0013]菌株
pGAPZ a A-TP I為構建的中國當素組成型畢赤酵母陽性表達菌株；Escherichia coliATCC25922和Staphyloccocus aureus ATCC25923用于檢測發酵產物抑菌活性的指示菌株。
[0014]主要試劑
Zeocin抗生素為Invitrogen公司產品；Peptone、D-葡萄糖、YNB(無游離氨基酸酵母含氮堿基)、山梨醇、生物素、組氨酸等均為上海生物工程試劑公司產品。Tris、Tricine,SDS> 過硫酸銨、P -mercaptoethanol、TEMED 均為 Sigma 公司產品；蛋白 Marker (116.0、66.2,45.0,35.0,25.0,18.4,14.4kD)為 Fermentas (MBI)公司產品；BM201 型低分子量蛋白質 Marker (66000、45000、35000、27000、20000、14400、9500、6500、4100Da)為美國 BBI 公司產品；MH培養基(Mueller hinton agar)為英國Oxoid公司產品。[0015]主要儀器
Bioflo 115?型臺式生物發酵系統，總容積7.5升，含pH控制器、溶氧控制器、溫度控制器、攪拌控制器、空氣混合器、補料進樣系統等，控制軟件為Bio Command Track and Trend發酵過程專用數據采集與管理軟件，美國New Brunswick Scientific公司；Minim? II型切向流過濾系統，美國PALL公司！Advantage型凍干機，美國VIRTIS公司。Allegra6R低溫離心機，美國Beckman公司；SW_CJ-1F凈化工作臺，蘇州蘭林凈化設備有限公司；TGL_16G振蕩培養箱，哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；Min1-PROTEAN Tetra MP4型電泳槽，Powerpac Basicl64_5050型電泳儀，Bio-Rad公司；M200型多功能酶標儀，德國QIAGEN公司；DYY-1II型SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳垂直電泳槽，北京六一儀器廠；PYX-DHS型恒溫培養箱，上海市躍進醫療器械廠；MDF-290A型_80°C超低溫冰柜，SANYO公司；CS_9000型薄層掃描儀，日本島津；Counter Mat Flash型全自動菌落成像分析系統,西班牙IUL公司；LC-2010型高效液相分析儀，日本島津SHIMADZU ；Hypersi1-ODS C18型色譜柱，美國Thermo公司；API4000型液相色譜-質譜/質譜聯用儀，配有電噴霧源(ESI)，美國ABI公司。
[0016]試劑配制
(I)基礎鹽培養基(Basal salt medium, BSM) =CaSO4 ? 2H200.93g/L, K2S0418.2g/L,MgSO4 ? 7H2014.9g/L，檸檬酸三鈉 1.47g/L, Glycerol40g/L, (NH4) 2S0410g/L, PTMJ mL/L,磷酸鉀緩沖液(pH6.0)0.1M ;其中微量元素(PTMl)配方=CuSO4 ? 5H206g/L, K10.08g/L,MnSO4 ? H203.0g/L, (NH4)6Mo7O24 ? 4H200.2g/L, H3BO30.02g/L, CaSO4 ? 2H200.5g/L, ZnS0420g/L，&H2S045mL/L，FeS04 ? 7H2065g/L, CoCl2 ? 6H200.5g/L, Biotin0.2g/L。
[0017](2) MH 培養基(MueIIer-Hinton agar):稱取本品 42.0g,加熱溶解于 1000mL 蒸懼水中，121°C高壓滅菌15m in。
[0018]響應面法優化X33-GAP-TP I的表達
響應面分析法(Response surface methodology, RSM)是對響應面等值線的分析來尋求最優工藝參數，采用多元二次回歸方程來擬合影響因素與響應值之間函數關系的一種統計方法，采用響應面法對X33-GAP-TP I的培養基進行整體優化，為下一步放大生產深層發酵奠定基礎。根據畢赤酵母組成型表達的限制因素，對三個發酵條件關鍵因素(A培養溫度、B葡萄糖含量和C初始pH)進行響應面分析優化，選適當濃度作為實驗中心點，得到最優發酵條件。使用Design_Expert8.0.6軟件進行Central Composite Desing響應面優化。發酵培養基在基礎培養基:酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L的基礎上進行優化。
[0019]采用中心旋轉組合設計法，在最大響應區內對影響TP I活性及產量的因素進行研究和探索。重組酵母菌培養48h后測定發酵液中TP I的活性。中心旋轉組合實驗的因素和水平見表1。
[0020]表1中心旋轉組合設計各因素水平表<img/
按上述優化后的條件，發酵5批，以Staphyloccocus aureus ATCC25923為指示菌,用平板打孔法進行抑菌活性檢測，并計算平均值和誤差，來考察所建立的模型是否正確。
[0021]發酵罐種子菌的培養
取己鑒定表達活性高低的X33-GAP-TP I單菌落，加入到IOmL YTO培養液(種子培養基)中，30°C，250r/min震蕩培養16~24h ;取ImL培養物加入到500mLYPD培養液中，30°C，250r/min震蕩培養24h左右，OD600約為10作為發酵罐種子菌。
[0022]發酵罐高密度發酵
按Bioflo 115?:發酵罐操作說明書對發酵罐的PH計、溶氧計及蠕動泵的流量進行校準。
[0023]7.5L發酵罐中加入5L基礎鹽培養基，罐體經121°C，30min高壓滅菌。待培養基冷卻到室溫后，用氨水調節培養基的pH值，火焰消毒法，加入2mL PTMl微量元素、0.5mL生物素貯存液和200mL發酵罐種子菌開始發酵培養，發酵罐參數設置為:攪拌速度500r/min，罐內壓力lOpsi，溫度28.5°C，控制均為P-1-D，維持DO(溶解氧)值在20%以上。葡萄糖的補料流加方法為:1L的50%葡萄糖中含12mL的PTMl微量元素，以18.2mL/h/L的補料速率加入到發酵罐中。當罐內出現較多泡沫時，可滴加2~3滴市售豆油消泡。發酵過程中固定間隔由計算機自動在線記錄檢測D0、pH、溫度和攪拌速度等數值，根據實驗設計在一定的發酵時間點取樣，鏡檢、測0D_值、細胞濕重、并對上清進行抑菌活性和蛋白電泳分析。
[0024]細胞干重測定
取ImL發酵液，40C，12000r/min,離心5min，雙蒸水清洗菌體沉淀三次，105°C干燥12h，準確稱重。
[0025]鱟素飼料添加劑制備一濃縮凍干法
酵母表達產物，經12000r/min離心lOmin，取上清液用真空冷凍干燥機凍干，粉碎，得凍干粉，按農業部《柞蠶素暫行質量標準》中測定抗菌肽活性的方法，測定凍干粉抑菌活性，單位為U/g，并計算發酵利率，并進行Tricine-Glycerol-SDS-PAGE檢測。
[0026]重組鱟素的MALD1-T0F-MS定性檢測
質譜條件:電噴霧(ESI)離子源，正離子模式，多反應監測(MRM)掃描方式；電噴霧電壓(is):5500V;離子源溫度(TEM):500°C ;輔助氣I壓力(GSl): 139kPa，輔助氣2壓力(GS2):206.7kPa ;氣簾氣壓力(CUR):103.4kPa ;碰撞氣(CAD):41.3kPa ;入口電壓(EP)和出口電壓(CXP):10V。
[0027]重組鱟素的高效液相色譜法的定量檢測 1.高效液相色譜條件
色譜柱 Hypersil-ODS C18 柱(250mmX 2.1mm 1.d, 5 u m),流動相:A 為 0.1 %三氟乙酸(TFA) ；B為乙腈。柱溫為35°C，檢測波長為220nm。線性梯度洗脫程序:20min內流動相B由25%線性梯度增加到50% ;進樣量IOii L ;體積流量為1.0mL/min。
[0028]2.標準曲線建立
梯度稀釋鱟素，分別制得200、100、50、25、12.g/mL標準液，IOii L進樣，用各樣品的
峰面積與質量濃度計算回歸所得方程。
[0029]3.高效液相色譜檢測重組鱟素表達量
對不同批次的發酵液上清經0.45 U m濾器過濾后，按照1.2.4.1條件進行液相檢測，用
1.2.4.2所得公式計算表達量。
[0030]響應面法優化重組鱟素酵母菌發酵工藝 中心組合設計及結果
以影響組成型表達的關鍵因素溫度、糖濃度及PH值作為中心旋轉組合實驗的設計因素，以基礎培養基相關參數值為實驗中心點，按表2的實驗設計進行20組實驗，每組重復3次，以發酵液上清的抑菌圈直徑為響應值，取3次重復平均數，來尋找上述三因素的最優水平，結果如表2所示。
[0031]表2中心組合設計及結果
【權利要求】
1.菌株為中國鱟素組成型畢赤酵母陽性表達菌株，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏號為CGMCC N0.5462。
2.一種菌劑，其活性成分為中國鱟素組成型畢赤酵母陽性表達菌株，CGMCC N0.5462。
3.中國鱟素組成型畢赤酵母陽性表達菌株在飼料添加劑中的應用。
【文檔編號】A23K1/16GK103710276SQ201210051423
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2012年3月1日 優先權日:2012年3月1日
【發明者】韓文瑜, 馮新, 雷連成, 宋戰昀, 刁昱文, 趙紅蕾, 高宇 申請人:吉林大學