專利名稱：人胰島素原c肽高產菌株的構建的制作方法
技術領域：
本發明屬于醫藥領域中的重組多肽藥物的生產方法。
背景技術：
人胰島素原C肽是人胰島素原中A鏈和B鏈之間的連接肽，含31個M 酸，人胰島素原經酶解形成等摩爾的胰島素和C肽。胰島素用于控制糖尿病 患者的血糖，C肽曾^皮認為無臨床價值，最新研究證明C肽能夠減少糖尿病 患者的最嚴重并發癥，如糖尿病性腎病、糖尿病性視網膜病變和糖尿病性神 經病變。采用胰島素與C肽聯合用藥可有效控制血糖和減少糖尿病并發癥的 發生。由于人胰島素原C肽具有巨大的治療價值和經濟價值，現在各國大力 開展其生產工藝和臨床前研究，目前全世界還沒有正式生產上市。
人胰島素原C肽是一種含31個氨基酸的內源性小肽，生產人胰島素原C 肽主要有三條工藝路線可供選擇化學合成法、生物組織提取法、基因工程 法。人胰島素原C肽含31個氨基酸，用化學合成法生產人胰島素原C肽存在 合成反應步驟多，總收率低，并有價格高昂以及環境污染的弊端，因而化學 合成法不可取。雖然人的血液中含有人胰島素原C肽，但含量極微，從人的 血液提取C肽不可能用于大規^莫生產。
對于人胰島素原C肽的生產來說，最有效和最直接的解決方法就是利用 基因工程的方法，通過構建表iiA胰島素原C肽的基因工程菌株，釆用微生 物發酵法生產。但由于人胰島素原C肽是一種小肽，利用基因工程來生產小 肽一直是一個難題，最主要體現在(1)在發酵表達方面，分子量小造成表 達量低(與相同摩爾數的大的蛋白質相比)，另外，分子量小還容易被宿主 細胞降解，從而造成多肽表達量進一步降低；(2)在分離純化方面，多tt 于分離純化，收率遠低于分子量大的蛋白質；(3)在電泳檢測方面，小肽的 分子量小容易擴散，用常規的蛋白質電泳不利于檢測分析。在這三個難題中， 小肽的分析檢測可以采用色譜和多肽電泳來彌補；小肽的分離純化工藝可以
通過不同的純化方法的優化，其收率一般可控制在30-40%;而難度最大的是 如何獲得高表達人胰島素原C肽的工程菌林。
目前，國內外提高C肽表達量的主要方式是將人胰島素原C肽基因進行 串聯表達。其基本原理由于人胰島素原C肽不含精氨酸和賴氨酸，先可用 這兩種堿性M酸將單拷貝的人胰島素原C肽基因串l沐來表達，然后通過 高純度的胰蛋白酶和羧肽酶B進行雙酶切，去除C肽之間的連接氨基酸，釋 放出天然的人胰島素原C肽。該方法的優點是可以在大腸桿菌或酵母中獲得 多聚(個)人胰島素原C肽串聯的融合蛋白的高表達工程菌抹，缺點是需要 昂貴的雙蛋白酶(胰蛋白酶和羧肽酶B)切割，同時增加了分離純化的步驟 以及受雙蛋白酶切效率的影響，最終降低了人胰島素原C肽的產率。該方法 已經分別由瑞典創新肽有限公司(中國專利申請公開CN1268141 )和上海新 藥研究開發中心(中國專利申請公開CN1606570 )各自申請了專利。

發明內容
本發明目的之一是提供一種胞內高表達人胰島素原C肽的方法。
本發明的另一目的是提供有關的人工合成的核酸分子、載體和宿主細胞。
本發明采用基因工程的方法，以畢赤酵母為宿主細胞，構建能高效胞內 表達人胰島素原c肽的工程菌林。
該工程菌主要由三個部分構成畢赤酵母宿主細胞GS115,畢赤酵母胞 內表達型栽體pPIC3K， 一種能夠編碼人胰島素原C肽的核酸分子。酵母宿主 細胞GS115以及畢赤酵母表達載體pPIC3K均購自美國Introgen Corporation (Carlsbad, CA， USA)，能夠編碼人胰島素原C肽的核酸分子是人工設計并 用化學法合成。
該工程菌的主要特點如下
(1) .宿主細胞選用的畢赤酵母宿主細胞是GS115， GS115可高密度 發酵，因而適合于外源蛋白表達。
(2) 表達載體選用的酵母表達載體是pPIC3K,可有效地胞內表iiA 胰島素原C肽。
(3).人胰島素原C肽的核酸序列根據人胰島素原C肽的氨基酸序列， 人工設計并化學合成一種能編碼人胰島素原C肽的核酸分子，其序列見SEQ ID NO: 1。
本發明研究人員按照本發明工程菌構建方法已經獲得高效胞內表達人胰 島素原C肽的工程菌林，并將其2008年10月6日保藏到中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC),保藏號是No.2686,分類命名為巴氏 畢赤酵母(Pichia pastoris)。
本發明的實驗技術路線 (1)目的基因的合成
根據人胰島素原C肽的氨基酸序列，采用化學合成的方法，合成人胰島 素原C肽基因。人胰島素原C肽含有31個氨基酸，用化學合成法合成人胰島 素原C肽全長基因序列，并在目的基因的兩端引入限制性酶切位點。
(2 )獲得正確構建的重組表達載體
在DM連接酶作用下，將化學合成的人胰島素原C肽基因與表達載體 pPIC3K進行連接，將連接產物轉化大腸桿菌DH5oc感受態細胞，最后將該感 受態細胞涂布于含氨千青霉素的LB平板上，獲得大量單菌落。用PCR方法初 步篩選陽性克隆，將陽性克隆進行DM測序，從而獲得含人胰島素原C肽基 因的重組表達載體。
(3 )將上述重組載體導入酵母菌
提取該重組栽體并進行線性化處理，用電穿孔將該線性化的重組載體導 入畢赤酵母中，將菌液涂布于MD選擇性培養基上，獲得了大量的轉化子，并 對轉化子進行PCR鑒定。
(4)高產菌抹的獲得
將上述(3)獲得的轉化子涂布在含不同濃度的G418平板上進行篩選。 利用蛋白質電泳檢測人胰島素原C肽的表達量，經過大規模篩選，已經獲得 了高表達人胰島素原C肽的工程菌抹。同時確定了搖瓶試驗的培養和誘導表 達條件，包括可能的最優的培養基、培養溫度、無機鹽的種類和濃度、誘導 表達時間等。在搖瓶培養條件下，重組人胰島素原C肽的表達水平達到 100mg/L。
(2 )建立了高密度和高表達的小試發酵工藝。在搖瓶的培養和誘導表達 條件基礎上，將酵母工程菌在5L Minifors(瑞士 INFORS公司)全自動發酵罐 進行培養，對發酵過程中的溶氧量、pH值、溫度、攪拌轉速等參數進行測定 和控制，優化和量化了 pH值、溶氧量、攪拌速度等參數，酵母工程菌獲得高 密度發酵，人胰島素原C肽獲得穩定高效表達。
本發明采用基因工程的方法來生產人胰島素原C肽，可以大規4莫生產， 成本低廉。


圖1是含人胰島素原C肽基因工程菌的PCR產物的核酸電泳圖，從左到右 電泳泳道-M:是核酸分子量標準Lamda DNA/HindlH; 電泳泳道-工程菌含人胰島素原C肽的工程菌林做沖莫板，出現人胰島 素原C肽的重組載體的PCR產物以及宿主菌體染色體的特異產物。
圖2是含人胰島素原C肽基因工程菌的SDS-PAGE電泳圖，從左到右 電泳泳道1:工程菌破碎樣品，在3KDa附近有人胰島素原C肽條帶； 電泳泳道M : 蛋白質分子量標準，從上往下，分別是
2. 5KDa， 6. 5KDa， 10KDa， 16KDa。
具體實施例方式
本發明設計的實驗操作和相關試劑的配方主要參考畢赤酵母操作手冊 (the/7c力/a expression Kit Instruction Manual , Introgen Corporation, Carlsbad, CA， USA)，分子克隆實驗指南(第三版，黃培堂翻譯，科學出版 社)，以及試劑廠家的說明書。
本發明主要涉及的培養基成分如下(除另有說明外均為質量分數)
LB培養基蛋白胨1%，酵母提取物0.5 %,氯化鈉O. 5 °/。；
種子培養基(YPD):蛋白胨2 %，酵母提取物l %，葡萄糖2 %;固體培養 基中加入l. 5%的瓊脂粉。
生長培養基(BMGY):酵母氮源威基l. 34 %，生物素(4 x10 - 5) %，蛋 白胨2 %,酵母提取物l %， 0.1 mo1/ L磷酸鹽緩沖液pH 6.0, 1%甘油；
誘導培養基(B固Y):酵母氮源堿基l. 34 %，生物素(4 x 10 -%，蛋 白胨2 %,酵母提取物l %， 0.1 mo1/ L磷酸鹽緩沖液pH 6.0， 1 % (v/v)曱 醇；
實例1含人胰島素原C肽的重組表達載體的構建過程
人胰島素原C肽基因的化學合成根據人胰島素原C肽的氨基酸序列(SEQ ID NO: 2)，合成兩個互補的核普酸序列。
正向的核苷酸序列含有下列序列(5 ' —3 ' ): gaggccgaagattta cag gta ggacaagttgagttgggaggaggcccaggggcaggctcgctacagcccttggccttggaaggc tcactgcag.，
反向的核苷酸序列含有下列序列(5 ' — 3 '):
ctgcagtgagccttccaaggccaagggctgtagcgagcctgcccctgggcctcctccc aaxtcaacttgtcctacctgtaaatcttcggcctCo 正向和反向的核苷酸序列的5 '端均設計了限制性內切酶EcoR I。 兩個互補的核苷酸序列通過退火即得到人胰島素原C肽基因。將上述核酸 產物和表達栽體pPIC3K分別用EcoR I酶切后，用DNA連接酶進行連接，并轉化 大腸桿菌DH5oc，在含氨千青霧素的LB培養基中培養，篩選轉化子，最后通過 測序鑒定獲得含人胰島素原C肽基因的正確連接的重組表達載體。
提取上述重組表達載體，用Sal I酶切后，酶切產物轉化酵母受體菌 GS115，涂布于MD平板上。培養48小時后，將一定的轉化子細胞涂布于 YPD-G418平板上，G418濃度梯度是0. 25mg/mL， 0. 50mg/mL, 0. 75mg/ mL, 1. Omg/ mL， 1.5mg/mL， 2. 0mg/ mL， 4. 0mg/mL，在30° C培養,2-5天后長 出G418抗性菌落。將此抗性菌落用PCR方法進行DM鑒定，引物用pPIC3K 的通用測序引物A0X1，結果如圖l所示。
結果表明人胰島素原C肽^皮轉化到酵母受體菌GS115中。
實例2搖瓶表達人胰島素原C肽情況
從固體平板上挑選一個單菌落，接種到裝有25 mL BMGY的250 mL搖并瓦中， 30。 C, 220 rpm，過夜培養至0D咖-4。
將上述25mL培養液接種到lL BMGY中，繼續擴增至菌體濃度006。。=6。
5000 rpm，室溫離心5min，收獲菌體。用新鮮的無菌B固Y懸浮菌體，至 菌液OD柳-l. 0， 30° C， 220 rpm誘導表達人胰烏素原C肽。每隔24h取樣，并 補充100%曱醇至終濃度1.5%。誘導培養120h結束，離心收獲菌體。將菌體通 過蛋白質電泳分析，結果如圖2所示，結果表明人胰島素原C肽在畢赤酵母 中獲得表達。
搖瓶培養，分析人胰島素原C肽表達情況。通過大量篩選轉化子，獲得 高表達人胰島素原C肽的工程菌抹。本發明獲得的人胰島素原C肽工程菌林 的搖瓶表達量可達200mg/L以上。
實例3發酵表達人胰島素原C肽情況
從固體平板上挑選一個單菌落，接種到裝有25 mL BMGY的250 mL搖瓶中， 30° C， 220 rpm，過夜培養至0D柳-4。
將上述25mL培養液接種到250mL BMGY中，繼續擴增至菌體濃度006。。=6， 將培養液接種到2L BSM發酵培養基中，調整pH-4. 0-7. 5，溫度在28° C， DO=40%，轉速500rpm，培養一段時間后，DO迅速升到100y。以上，表明培養基 中甘油消耗完畢，開始緩慢加入50°/。甘油，甘油流加速度30 mL/h，并維持DO 在35°/。以上，甘油補充時間4 h。
甲醇誘導階段停止補充甘油后，DO迅速升到100%以上，饑餓一段時間 后，開始緩慢補充曱醇，曱醇流加速度3-7 mL/h，隨著DO值上升，可將甲 醇流加速度加快。如果DO值低于35%,停止加入曱醇，待DO值持續升到35%, 才補充甲醇。每隔4 h，取菌體進行檢測人胰島素原C肽的含量，發酵持續 96 h，收獲發酵菌體。在整個發酵過程中，DO值應控制在20%-40%。酵母濕 菌體達到300g/L以上，C肽的含量達到1000mg/L以上。SEQUENCE LISTING
< 110〉 西藏射果科技有限公司 北京航空航天大學
西藏自治區特色農牧業工程技術研究開發中心
<120>人胰島素原C肽高產菌林的構建 <130>沒有案巻參考號
<160> 2
<170> Patentln version 3. 3
<210> 1
<211> 93
<212> DM
<213> Artificial
<220>
<223> 編碼人胰島素原C肽 <220>
<221> CDS <222> (l)..(")
<400> 1
gag gcc gaa gat tta cag gta gga caa gtt gag ttg gga gga ggc cca 48 Glu Ala Glu Asp Leu Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 15 10 15
ggg gca ggc teg cU cag ccc Ug gcc Ug gaa ggc tea ctg cag 93 Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin 20 25 30
<210> 2 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Construct <400> 2
Glu Ala Glu Asp Leu Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro 15 10 15
Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin 20 25 30
權利要求
1. 一種能夠表達人胰島素原C肽的核酸分子，其序列為SEQ ID NO:1。
2. —種能胞內表達人胰島素原C肽的重組載體，其特征為選用的表達 載體是畢赤酵母胞內表達載體pPIC3K, pPIC3K與權利要求1所述的人胰島素 原C肽的核酸分子形成重組栽體。
3. —種能高效胞內表達人胰島素原C肽的畢赤酵母菌林，其含有權利要 求2所述的重組栽體。
4. 如權利要求3所述的畢赤酵母菌林，其特征在于選用的畢赤酵母宿主 細胞是GS115。
5. —種能夠高效胞內表達人胰島素原C肽的畢赤酵母菌林，其保藏編號 為CGMCC No.2686。
6. —種胞內表達人胰島素原C肽的方法，其特征在于采用權利要求3-5 中任一畢赤酵母菌林胞內表達獲得。
全文摘要
本發明公開了一種用畢赤酵母表達人胰島素原C肽的方法，該方法首先合成人胰島素原C肽基因，然后將該基因與畢赤酵母表達載體進行重組，獲得的重組表達載體轉入到畢赤酵母中，最后通過大量篩選轉化子并獲得高效胞內表達人胰島素原C肽的工程菌株。
文檔編號C12R1/84GK101381727SQ200810167200
公開日2009年3月11日 申請日期2008年10月8日 優先權日2008年10月8日
發明者王福清, 王秀云, 權 鄭 申請人:西藏金稞科技有限公司;北京航空航天大學;西藏自治區特色農牧業工程技術研究開發中心