專利名稱：分離的二酰甘油酰基轉移酶基因，其表達載體及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物基因工程領域，具體涉及轉移酶基因、含有該基因的酵母表達載體和植物表達載體，以及這些表達載體的轉化體。本發明還涉及上述基因在植物性狀改良上的應用。
背景技術：
傳統化石能源緊缺，將使生物柴油和燃料乙醇逐步替代石油，發展成為新的基礎產業和新的能源產業，以滿足人類在后石油時代對液體能源的大量需求。生物柴油是指以 油料作物、野生油料植物和工程微藻等水生植物油脂以及動物油脂、餐飲垃圾油等為原料油通過酯交換工藝制成的可代替石化柴油的再生性柴油燃料，與傳統的柴油相比，具有能量密度高、潤滑性能好、儲運安全、抗爆性好、燃燒充分等優良性能，是最具發展潛力的大宗生物基液體燃料。植物油含有豐富的還原態碳鏈，是同體積淀粉所含能量的8倍多。植物油不僅是人類營養需求的重要食用油，而且已經成為許多化工產品的重要環保原料，廣泛應用于肥皂、清潔劑、潤滑劑以及油漆等的生產。更重要的是植物脂肪酸還可作為生物柴油的原料。因此，利用基因工程技術，提高植物或油料作物中油脂含量，不僅對于應對日益嚴峻的能源形勢，舒緩能源消費結構矛盾；同時，對于改善人類使用油的質量，調整農業產業結構和增加農民收入，都具有重大的意義。植物種子中的貯藏物質主要有淀粉、蛋白質和脂類。植物種子中儲存的脂肪酸常以三酰甘油酯(TAGs)，即在甘油骨架上附連三個脂肪酸的形式存在。而脂肪酸成分主要是16至18碳或含一至三個雙鍵的脂肪酸，如硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸等。脂肪酸代謝主要是在質體和內質網中進行的，首先，合成脂肪酸的碳源主要是蔗糖，在種子中通過糖酵解途徑將其轉變成己糖，并氧化成乙酰CoA(乙酰輔酶A)。而TAG合成的骨架成分甘油3-磷酸也是通過糖酵解的中間產物合成的。隨后，在質體中經乙酰CoA羧化酶(ACC)將乙酰CoA合成為丙二酰單酰CoA。然后脂肪酸合成酶復合物(FAS)以丙二酸單酰CoA為底物進行連續的聚合反應，經過數次循環聚合反應后，脂肪酸的合成可在酰基-ACP硫酯酶或酰基轉移酶的作用下終止。而終止聚合后的不同碳鏈長度的酰基ACP，在酰基CoA合成酶的作用下合成酰基CoA，并從質體轉運到內質網或胞質中。最后利用貯存在胞質中的酰基CoA池，在內質網上通過三種不同的酰基轉移酶，即甘油3-磷酸酰基轉移酶(G3P-AT)、溶磷脂酸酰基轉移酶(LPA-AT)和二酸甘油酸基轉移酶(acyl CoA diacylglycerol acy I transferase,DGAT),分別在甘油上連接脂肪酸以合成三酰甘油酯和結構磷脂(Cahoon等，Curr OpinPlant Biol. 2007，10 :236_44)。目前的研究證明，要提高種子中的油脂含量，不僅需要增加游離酰基CoA的含量，更重要的是需要增加貯藏型的三酰甘油酯(TAGs)在種子中的含量。前人的研究(Shockey等，Plant Cell 2006，18 =2294-2313 ;Kroon 等，Phytochemistry2006,67 :1166_1176)發現，在發育的種子中，DGAT催化酰基CoA和二酰甘油酯合成TGA的最后一步，雖然對于多種酰基轉移酶之間的相互作用不清楚，但DGAT在油脂的合成中為關鍵限速步驟，直接影響種子中TAG的含量和成分已經明確。已經從蓖麻、擬南芥和花生等植物中克隆了編碼DGAT的基因，包括 DGATl 和 DGAT2 以及可溶性的 DGAT3。Jako 等(Plant Physiol 2001，126 861-874)在擬南芥種子中特異超表達DGAT基因，不僅增加了種子重量，而且增加了種子含油量，表明在植物種子特異表達DGAT基因是能夠提高油脂含量的。但是，并不是所有在植物中表達的DGAT基因都能提高油脂含量(Oakes等，PlantPhysiology 2011，155 :1146-1157)，這主要取決于DGAT基因的來源與類型。我們從微生物中克隆了幾種不同的DGAT基因，來源酵母中克隆脂肪酸合成相關的DGAT基因，并將其導入釀酒酵母和煙草中，在種子中特異超表達以增加種子貯藏TGA的合成，最終達到提高植物種子種含油量的目的，從而在農業生產中創造更大的經濟效益和社會效益。

發明內容
本發明的目的在于提供一種分離的二酰甘油酰基轉移酶基因，其具有SEQID NO. I所示的核苷酸序列(1563bp，其中第1561-1563位bp為終止密碼子)，將所述二酰甘油酰基轉移酶基因構建成表達載體，應用于植物的性狀改良中，能有效地提高植物種子的油脂含量。本發明的所述的分離的二酰甘油酰基轉移酶基因編碼具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列(520aa)。本發明的另一個目的在于提供一種含有權利要求I所述基因的表達載體，所述表達載體選自酵母表達載體或植物表達載體中的一種。具體地，所述表達載體為具有圖2所示結構的酵母表達載體，或具有圖6所示結構的植物表達載體。本發明的另一個目的在于提供一種包含權利要求I所述基因的轉化體。本發明的另一個目的在于提供一種含有權利要求I所述基因的轉基因植物的制備方法，包括以下步驟I)將權利要求I所述基因可操作地插入表達載體中，構建植物表達載體；2)用步驟I獲得的植物表達載體轉化宿主，獲得轉化體；3)將步驟2獲得的轉體轉化植物，獲得轉基因植物。本發明還提供了提高植物種子含油量的方法，所述方法通過在植物種子中特異表達一種具有SEQ ID NO. I所示核苷酸序列的二酰甘油酰基轉移酶基因，以增加植物種子中TAG的量，最終達到提高植物種子含油量的目的。本發明也提供二酰甘油酰基轉移酶基因在植物性狀改良上的應用。試驗結果證明，將解脂酵母二酰甘油酰基轉移酶基因(YlDGAT)在酵母中表達后，酵母油脂含量比野生型酵母增加了 2. 5倍。同時，在煙草的種子中特異表達該二酰甘油酰基轉移酶基因(YlDGAT)后，轉基因煙草種子的含油量最高可提高25%。本發明方法簡便易行，效果顯著，不僅能提高油料作物的食用價值，而且能為生物能源提供原料，產生巨大的經濟效益。


圖I :解脂酵母二酰甘油酰基轉移酶基因(YlDGAT)酵母表達載體的構建流程圖。
其中，pUCm-T為上海生工生物技術公司產品，pENTR和pYES-DEST52為Invitrogen公司產品。圖2 :解脂酵母二酰甘油酰基轉移酶基因(YlDGAT)釀酒酵母表達載體的結構圖。其中，Ampicillin，氨芐青霉素抗性基因；pUC ori，在大腸桿菌中高拷貝復制位點；2 μ origin,在酵母中高拷貝復制位點；V5 epitope, V5抗體檢測位點；6x His,多聚組氨酸位點；CYCl TT，CYC1終止子；P GALl，GALl誘導型啟動子；f I origin，單鏈DNA復制位點；URA3，乳清酸脫羧酶基因。圖3 :黃曲霉二酰甘油酰基轉移酶基因(AflDGAT)酵母表達載體的構建流程圖。其中，pUCm-T為上海生工生物技術公司產品，pENTR和pYES-DEST52為Invitrogen公司產品。圖4 :煙曲霉二酰甘油酰基轉移酶基因(AfuDGAT)酵母表達載體的構建流程圖。pUCm-T為上海生工生物技術公司產品，pENTR和pYES_DEST52為Invitrogen公司
女口
廣叩ο圖5 :解脂酵母二酰甘油酰基轉移酶基因(YlDGAT)植物種子特異表達載體的構建流程圖。其中，Km，卡那霉素抗性基因；Amp，氨芐青霉素抗性基因；35S，來源于花椰菜花葉病毒的植物組成性啟動子；gus: :npt, β -葡萄糖酸苷酶與新霉素磷酸轉移酶的融合基因；poly A，35S終止子；Napin，Napin種子特異啟動子；LB，T-DNA左邊界；RB，T-DNA右邊界。P3載體，以pBI121為骨架改造的植物表達載體，具有35S啟動子調控下的⑶S和NPT II基因，便于在植物遺傳轉化的過程中對轉化子進行GUS染色的篩選。圖6 :解脂酵母二酰甘油酰基轉移酶基因(YlDGAT)植物種子特異表達載體結構圖。其中，Km，卡那霉素抗性基因；35S，來源于花椰菜花葉病毒的植物組成性啟動子；gus::npt, β -葡萄糖酸苷酶與新霉素磷酸轉移酶的融合基因；poly A,35S終止子；Napin,Napin種子特異啟動子；LB，T-DNA左邊界；RB，T-DNA右邊界。圖7 :轉基因酵母中YlDGAT、AfuDGAT和AflDGAT表達蛋白的檢測結果圖。其中，從左到右依次為轉入YlDGAT基因未誘導的釀酒酵母總蛋白、誘導48h后的酵母總蛋白；轉入AflDGAT基因未誘導的釀酒酵母總蛋白、誘導48h后的酵母總蛋白；轉入AfuDGAT基因未誘導的釀酒酵母總蛋白、誘導48h后的酵母總蛋白。其電泳結果證實，在誘導表達48h后，3組轉基因酵母分別表達出相應的目的蛋白。紅色箭頭標注出了目的蛋白。圖8 :轉化三種微生物DGAT基因后酵母的脂質含量測定結果圖。其中，將解脂酵母、黃曲霉、煙曲霉DGAT基因轉化至釀酒酵母INVScl。應用誘導培養基誘導轉基因酵母表達相應的目的蛋白，利用索氏抽提器提取酵母菌體的脂質。實驗結果顯示轉化YlDGAT基因的轉基因酵母脂質含量是野生型酵母脂質含量的3. 5倍。轉化了 AflDGA及AfuDGAT基因的轉基因酵母脂質含量高分別是野生型酵母脂質含量的2. O倍和I. 9倍。轉化幾種微生物源DGAT基因后，酵母的脂質含量均有大幅提高，方差分析顯示，脂質含量的增加均達到極顯著(P < O. 01)水平。圖9 :轉化幾種不同來源的DGAT基因后酵母脂質中脂肪酸成分測定圖。其中，應用氣相色譜串聯質譜(GC-MS)分別分析野生型㈧釀酒酵母、轉化YlDGAT、基因酵母(B)、轉化AflDGAT酵母(C)和AfuDGAT酵母(D)脂質成分的檢測峰圖。圖10:Real time RT-PCR分析TO代不同轉基因株系煙草種子中YlDGAT基因的表達圖。其中，YlDGAT基因在野生型煙草中無表達；在19個轉基因株系中表達程度不同，0_13#中的表達量高(A) ;0-8#中的表達最低，其余株系中該基因的表達在這兩個株系之間。WT，野生型對照。圖11 T0代不同轉基因煙草株系種子千粒重和油脂含量比較圖。 其中，通過測定野生型和22個轉基因株系種子中的油脂含量，結果發現所有轉基因株系種子的油脂含量均高于野生型。野生型煙草種子的脂質含量為38. 32%，轉化YlDGAT基因的轉基因TO代煙草種子的脂質含量均在40%以上，其中最低為40. 49%，最高為47. 89 %。相比與野生型脂質含量，轉基因植株絕對提高量達2. 2 % 9. 6 %，相對提高量在5. 7% 25. 0%之間。轉基因煙草其千粒重呈現波動變化，但是總體略低于野生型種子千粒重。圖12 Τ0代轉基因煙草種子脂肪酸成分分析圖。其中，選擇部分具有代表性的TO代轉基因煙草，測定其種子脂肪酸成分Α E :依次為野生型、0-13#、0-14#、0-19#煙草植株種子脂肪酸成分及含量GC-MS檢測峰圖。
具體實施例方式以下結合附圖對本發明進行進一步的詳細說明，但以下說明并不對本發明進行限定，任何對本發明的變形和改變，只要不脫離本發明的精神，均應屬于本發明所附權利要求所定義的范圍。本發明實例中的試劑藥品未做具體說明的均為普通市售，材料方法未做具體說明的均參考《分子克隆實驗指南》(Sambrook和Russell, 2001)。實施例II. DNA 的提取提取真菌DNA方法首先用液體培養基培養真菌；待培養好真菌后，抽濾菌絲，用液氮速凍研磨；收集研磨后的粉末加入配制好的真菌DNA提取緩沖液3ml (O. 2mol/LTris -HCl (pH7. 5), O. 5mol/L NaCl，0. Olmol/L EDTA, 1% (ff/V) SDS)和 β -巰基乙醇 0. lml，搖勻 8000rpm 5min 常溫離心，離心后取上清液；用氯仿抽提2次(每次加入3ml氯仿，8000rpm 5min常溫離心，離心后取上清液);加入上清液2/3體積的異丙醇和1/10的NaAc (pH5. 2)于_20°C冷凍過夜；過夜后IOOOOrpm 5min常溫離心，去掉上清液；用300 μ L TE溶解沉淀；用堿酚氯仿異戍醇(25 24 I)混合液與上述TE溶解的混合液等體積混合抽提一次(13000rpm Imin常溫離心，取上清液)；加入等體積的氯仿異戊醇渦旋后13000rpm Imin常溫離心，取上清液；繼續13000rpm 9min常溫離心，取上清液；加入3倍體積的冷凍乙醇將DNA沉淀；冷凍20-30min后棄上清液，將沉淀在離心管中干燥；將干燥的DNA溶于100 μ L TE中待用。提取植物DNA方法選取煙草、油菜等植物幼葉O. 5-lg,在液氮中迅速研磨成粉,加入3mL 65°C預熱的 CTAB 提取液(100mmol/L Tris-HCl (pH8. 0), 20mmol/L EDTA(ρΗ8· 0)，I. 5mol/L NaCl,2% CTAB (ff/V), 4 % PVP40 (ff/V)和2%巰基乙醇(V/V)，PVP和巰基乙醇使用前加入)，快速振蕩混勻。65°C水浴30min,然后加入ImL 5mol/LKAc,冰浴20min后,用等體積的氯仿異戊醇(24 I)抽提I次(10，000r/min，4°C離心5min)，取上清，加入2/3倍體積的-20°C預冷異丙醇，混勻，靜置約30min，用玻棒挑出絮狀沉淀，用75%的乙醇反復漂洗數次，再用無水乙醇漂洗I次，吹干，重懸于500 μ L TE中。加入IyL RNaseA(10mg/mL)，37°C處理Ih0再用酚(pH8. O)氯仿異戊醇(25 24 I)和氯仿異戊醇(24 I)各抽提I次(10，000r/min，4°C離心5min)，取上清，乙醇沉淀。沉淀用75 %的乙醇漂洗，風干，溶于200 μ L TE中，-20°C保存備用。
2. RNA 的提取選取約Ig新鮮煙草材料，在液氮中迅速磨成精細粉末，裝入IOmL離心管，加入3mL65°C預熱的 RNA提取液(2% CTAB (W/V) ,2% PVP (ff/V)，lOOmmol/LTris-HCl (ρΗ8· O)，O. 5g/LSpermidine, 2, Omol/L NaCl，2%巰基乙醇(V/V，使用前加入))，顛倒混勻。65°C水浴3 lOmin，期間混勻2 3次。氯仿異戊醇(24 I)抽提2次(10，000r/min，室溫，5min)。取上清，加入1/4體積lOmol/L LiCl溶液，4°C放置6h，以氯仿異戊醇(24 I)抽提I次(10，000r/min,室溫，5min)。加2倍體積的無水乙醇，在_70°C冰箱沉淀30min以上。12，000r/min，4°C離心20min，棄上清。沉淀用100 μ L的DEPC處理水溶解。酚(ρΗ4· 5)氯仿異戊醇(25 24 I)、氯仿異戊醇(24 I)各抽提I次(10，000r/min，室溫，5min)。加1/10體積3mol/L NaAc溶液和2. 5倍體積的無水乙醇，在_70°C冰箱沉淀30min以上。12，000r/min,4°C離心20min,棄上清。沉淀用70%的酒精漂洗一次,風干。加50 μ L的DEPC處理水溶解、備用。3.基因組序列的PCR擴增
IOxEx PCR buffer (Mg2+ free) 2.5 μΕ2.5 mmol/L dNTPs2 μ ^25 mmol/L· MgCl22 μ ^「 ^上游引物(5 μπιοΙ/L)I μL
下游引物(5 μπιοΙ/L) I pL Ex Taq DNA 聚合酶 I U 基因組 DNA_^_60 ng
25 μL的擴增體系擴增程序為94°C，5min;94°C，30sec，56°C，30sec，72°C，I. 5min，35 個循環；72°C延伸IOrnin04.DNA片段回收，連接，轉化大腸桿菌DH5a紫外燈下用潔凈的刀片切下含目的片段的瓊脂糖凝膠塊，然后按DNA片段回收試劑盒說明書(Roche公司)中的步驟，回收目的DNA片段，最后用適量的TE溶解即得到目的片段。回收的片段與pUCm-T (上海生工)載體建立如下連接體系10xT4 DNA連接緩沖液 I pL 載體DNA片段I pL外源連接產物DNA片段I pL
T4 DNA連接酶I pL
用效蒸豕pL的連接體系載體DNA片段與外源連接產物DNA片段摩爾比為I : 3，16°C連接12h。之后將連接產物轉化大腸桿菌DH5 α。實施例2I.解脂酵母DGAT基因克隆根據解脂酵母DGAT基因序列(GenBank登錄號ΧΜ_504700)，設計引物(序列3，4)，從解脂酵母的基因組中PCR擴增獲得一個I. 5kbp左右的片段。將擴增DNA片段克隆后測序分析表明為解脂酵母DGAT基因。然后，再設計特異引物(序列5)對獲得的解脂酵母DGAT基因進彳丁改造，最后得到序列I所不的YlDGAT基因序列。2.黃曲霉DGAT基因克隆根據黃曲霉DGAT基因序列(GenBank登錄號XM_002378082)，設計引物(序列8，9)，從黃曲霉cDNA中體外擴增獲得一個I. 4kbp左右的片段。將擴增DNA片段克隆后測序，結果得到序列12分析表明為黃曲霉DGAT基因(AflDGAT)。3.煙曲霉DGAT基因克隆根據煙曲霉DGAT基因序列(GenBank登錄號XM_750079)設計引物(見序列10和11)，從煙曲霉cDNA中擴增獲得一個I. 5kbp左右的片段。將擴增DNA片段克隆后測序，結果得到序列13分析表明為煙曲霉DGAT基因(AfuDGAT)。4. Napin種子特異啟動子的克隆根據甘藍型油菜的napin基因的啟動子序列(GenBank登錄號J02798. I)，設計napin特異引物(序列16，17)，從油菜基因組中擴增獲得一個I. Ikb左右的片段。將擴增DNA片段克隆后測序分析表明為油菜napin啟動子，見序列18。5.釀酒酵母誘導表達載體的構建載體構建流程見圖I。所有限制性內切酶購自Roche公司，按照使用說明書操作。實施例3I.大量誘導轉基因酵母(I)接種含有PYES-DEST52的單克隆菌落至15ml SC-U酵母缺陷篩選培養基(O. 67% YNB, I X氨基酸、腺嘌呤，2%葡萄糖)，28°C 200rpm搖菌過夜；(2)測定0D600，并根據該OD值計算出最終接種到IOOml酵母半乳糖誘導表達培養基(0.67% YNB，1X氨基酸、腺嘌呤，2%半乳糖糖，10%棉籽糖)中的菌液量。接種原則是使酵母誘導培養基的初始OD值為O. 4 ;(3)將第二步計算好的數量的原始菌液接菌至IOOml酵母誘導培養基；共接菌10組，總體積IL。(4) 280C 200rpm搖菌20h后抽濾菌液，收集菌體；2.酵母菌體蛋白提取
(I)重懸新 鮮或冷凍的細胞于 500 μ L breaking buffer,離心(4°C 1500g 5min),
棄上清液，收集細胞；(2)將細胞重懸于 breaking buffer 中，使 OD6OO 達到 5O 100 ；(3)加入等體積的酸洗玻璃珠；(4)渦旋混合30s，然后置于冰上30s，4min中內反復4次，溶解細胞，細胞被剪力溶解，可以在顯微鏡下檢測細胞碎片；(5)將包含玻璃珠的樣品離心(常溫13200rpm IOmin)，取上清液；(6)將上清液轉移至一個新的離心管，上清液即為酵母菌體的蛋白質。3. DGAT基因在酵母中表達的蛋白質電泳鑒定參照汪家政(2000)的方法，采用不連續垂直板電泳系統。按照下表的比例配制SDS-PAGE凝膠，其中，濃縮膠濃度為5. 6%，分離膠濃度為12. 0%，凝膠厚度為O. 75mm。將蛋白樣品與1/3體積的4 X SDS樣品緩沖液混合，100 V加熱IOmin進行樣品的前處理。SDS-PAGE電泳結束后，凝膠在染色液中染色30min，然后室溫下脫色過夜，觀察照相。
權利要求
1.一種分離的二酰甘油酰基轉移酶基因，其具有SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列。
2.含有權利要求I所述二酰甘油酰基轉移酶基因的表達載體。
3.權利要求2所述的表達載體，其中所述載體為酵母表達載體或植物表達載體。
4.如權利要求3所述的表達載體，其特征在于，所述表達載體為具有圖2所示結構的酵母表達載體。
5.如權利要求3所述的表達載體，其特征在于，所述表達載體為具有圖6所示結構的植物表達載體。
6.含有權利要求2所述的表達載體的轉化體。
7.一種含有權利要求I所述基因的轉基因植物的制備方法，包括以下步驟 1)將權利要求I所述的基因可操作地插入表達載體中，構建植物表達載體； 2)用步驟I獲得的植物表達載體轉化宿主，獲得轉化體； 3)將步驟2獲得的轉化體轉化植物，獲得轉基因植物。
8.權利要求I所述的分離的二酰甘油酰基轉移酶基因在制備轉基因植物中的應用。
9.一種提高植物種子含油量的方法，包括將權利要求I所述的二酰甘油酰基轉移酶基因整合進入植物構建轉基因植物，并使得所述二酰甘油酰基轉移酶基因在植物種子中表達的步驟。
10.權利要求I所述的基因在改良植物品種中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種分離的二酰甘油酰基轉移酶基因及其表達載體，該基因可用于提高植物種子含油量。
文檔編號A01H5/10GK102634528SQ201210059920
公開日2012年8月15日 申請日期2012年3月8日 優先權日2012年3月8日
發明者侯磊, 周慶璋, 宋水清, 張丹丹, 張瑞芝, 李先碧, 李德謀, 梁愛敏, 羅小英, 羅明, 肖月華, 裴炎, 金丹 申請人:西南大學