專利名稱：基于RNAi技術(shù)的抗蟲制劑及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域和農(nóng)業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及基于RNAi技術(shù)防治鱗翅目害蟲的靶標基因，描述了將靶標基因合成為雙鏈RNA制劑并直接應(yīng)用于鱗翅目害蟲田間防治的方法。
背景技術(shù)：
亞洲玉米螟(Ostrinia furnacalis Guen6e)是重要世界性農(nóng)業(yè)害蟲,主要危害玉米、高粱、向日葵等重要的糧食經(jīng)濟作物，目前對亞洲玉米螟的防治，仍然是以化學(xué)防治為主，但是其對生態(tài)環(huán)境及糧食安全生產(chǎn)造成了巨大的損害。
化學(xué)防治技術(shù)的諸多問題已經(jīng)使得人們不得不尋求更好的害蟲治理辦法，生物防治雖然可以起到一定的防治作用，但是由于其見效緩慢，效果不明顯，受環(huán)境影響較大而得不到大眾認可，轉(zhuǎn)基因植物可以有效地防治害蟲，但是隨著單一轉(zhuǎn)基因作物的長期種植，會誘導(dǎo)害蟲抗性增加，非靶標害蟲危害增加，而且轉(zhuǎn)基因植物安全性目前還存在一些爭議，制約著該技術(shù)的發(fā)展。RNAi現(xiàn)象自從1991年發(fā)現(xiàn)以來迅速發(fā)展，研究表明，通過特異基因的RNAi，可以達到定向干涉物種的靶基因，出現(xiàn)某些生理現(xiàn)象，達到研究基因功能的目的，同時，這種現(xiàn)象有著極高的特異性，即同源基因的特定片段對不同物種所發(fā)揮的干涉效果并不相同，因此是一種理想的害蟲種類特異的防治體系。目前，利用RNAi技術(shù)進行害蟲防治已有報道，Baum等(2007)證明v-ATPase對玉米根螢葉甲(Western corn rootworm WCR, Diabrotica virgifera LeConte)有致死效果，可以用于田間防治；同年，Mao等通過將P450的dsRNA導(dǎo)入棉花中，可以導(dǎo)致棉鈴蟲(cotton bo I lworm Helicoverpa armigera)死亡；Tian證實通過飼喂的方法可以導(dǎo)致甜菜夜蛾(Spodoptera exigua Hiibner)的死亡,一系列的綜述文章都表明，RNAi技術(shù)作為一種新型的害蟲防治方法是完全可行的。但是，之前的研究也表明，基于RNAi技術(shù)的害蟲防治還有很多問題需要解決，如
I)如何快速高通量的發(fā)掘靶標基因；2)如何簡便的應(yīng)用于田間生產(chǎn)；3)抗性問題；4)安全性問題等等。要想利用RNAi技術(shù)進行害蟲防治，就需要解決以上問題，首先需要獲得足夠多的、有效的靶標基因，這樣，大量的靶標基因通過不同的組合方式，不同的時期使用不同的基因進行防治，可有效地避免害蟲抗性的出現(xiàn)。因此，利用RNAi技術(shù)的害蟲防治集中在靶標基因的獲得以及如何方便地應(yīng)用于田間這兩個急需解決的問題，本發(fā)明旨在解決這些問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供基于RNAi技術(shù)的抗蟲制劑及抗蟲方法。在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的多肽，該多肽選自下組(a) SEQ ID NO :43_52任一所示氨基酸序列的多肽；
(b)將SEQ ID NO :43-52任一所示氨基酸序列經(jīng)過一個或多個(如1_20個；較佳地1-15個；更佳地1-10個；更佳地1-5個；如3個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。 在本發(fā)明的另一方面，提供一種分離的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼如前所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，該多核苷酸選自下組的一種(a) SEQ ID NO :1-10, SEQ ID NO :33-42、SEQ ID NO :53_60，任一所示序列的多核 苷酸，或互補序列；(b)與(a)限定的序列在嚴格條件下雜交的任一多核苷酸或互補序列，其中有害生物對包含至少一條與所述多核苷酸互補的鏈的dsRNA的攝取，抑制所述有害生物的生長;(c)與(a)限定的序列具有至少70% (優(yōu)選至少75%、80%、85%、90%，更優(yōu)選至少95%、96%、97%、98%、99% )以上的序列一致性的任一多核苷酸或互補序列，其中有害生物對包含至少一條與所述多核苷酸互補的鏈的dsRNA的攝取，抑制所述有害生物的生長;(d)包含(a)限定的任一所示序列之至少17-21個連續(xù)核苷酸的序列或互補序列，其中有害生物對包含至少一條與所述多核苷酸互補的鏈的dsRNA的攝取，抑制所述有害生物的生長在本發(fā)明的另一方面，提供一種載體，它含有權(quán)所述的多核苷酸中的一種、二種或多種。在本發(fā)明的另一方面，提供一種遺傳工程化的宿主細胞，它含有所述的載體，或其基因組中整合有所述的多核苷酸中的一種、二種或多種。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的多核苷酸的用途，用于作為制備特異性干擾有害生物基因表達或抑制有害生物生長的干擾分子的抑制或沉默靶標，所述的有害生物基因選自LIM蛋白I基因、肌球蛋白3輕鏈基因、胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因、胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶Cl基因、胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶C3基因、羥丁酸脫氫酶基因、Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑I基因、脂肪酸結(jié)合蛋白I基因、羧肽酶4基因。在本發(fā)明的另一方面，提供一種核酸抑制物，選自(a)以所述的多核苷酸作為抑制或沉默靶標的dsRNA、反義核酸、小干擾RNA、微小RNA，其中有害生物攝取所述核酸抑制物，抑制所述有害生物的生長；或(b)以有害生物基因作為抑制或沉默靶標的dsRNA、反義核酸、小干擾RNA、微小RNA，其中有害生物攝取所述核酸抑制物，抑制所述有害生物的生長，所述的有害生物基因選自LIM蛋白I基因、肌球蛋白3輕鏈基因、胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因、胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶Cl基因、胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶C3基因、羥丁酸脫氫酶基因、Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑I基因、脂肪酸結(jié)合蛋白I基因、羧肽酶4基因；或(c)能表達或形成(a)、(b)所述dsRNA、反義核酸、小干擾RNA、微小RNA的構(gòu)建物。
在另一優(yōu)選例中，所述的核酸抑制物是所述的多核苷酸表達產(chǎn)生的dsRNA，其中有害生物攝取所述dsRNA，抑制所述有害生物的生長。在另一優(yōu)選例中，所述的dsRNA，其具有如下結(jié)構(gòu)
權(quán)利要求
1.一種分離的多肽，其特征在于，該多肽選自下組 (a)SEQ ID NO :43-52任一所不氨基酸序列的多肽； (b)將SEQID NO 43-52任一所示氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。
2.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組 (a)編碼如權(quán)利要求I所述多肽的多核苷酸； (b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
3.如權(quán)利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該多核苷酸選自下組的一種 (a)SEQ ID NO :1-10,SEQ ID NO :33-42、SEQ ID NO :53_60，任一所示序列的多核苷酸，或互補序列； (b)與(a)限定的序列在嚴格條件下雜交的任一多核苷酸或互補序列，其中有害生物對包含至少一條與所述多核苷酸互補的鏈的dsRNA的攝取，抑制所述有害生物的生長； (c)與(a)限定的序列具有至少70%以上的序列一致性的任一多核苷酸或互補序列，其中有害生物對包含至少一條與所述多核苷酸互補的鏈的dsRNA的攝取，抑制所述有害生物的生長； (d)包含(a)限定的任一所示序列之至少17-21個連續(xù)核苷酸的序列或互補序列，其中有害生物對包含至少一條與所述多核苷酸互補的鏈的dsRNA的攝取，抑制所述有害生物的生長。
4.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求2或3所述的多核苷酸中的一種、二種或多種。
5.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求4所述的載體，或其基因組中整合有權(quán)利要求2或3所述的多核苷酸中的一種、二種或多種。
6.權(quán)利要求2或3任一所述的多核苷酸的用途，用于作為制備特異性干擾有害生物基因表達或抑制有害生物生長的干擾分子的抑制或沉默靶標，所述的有害生物基因選自LIM蛋白I基因、肌球蛋白3輕鏈基因、胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因、胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶Cl基因、胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶C3基因、羥丁酸脫氫酶基因、Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑I基因、脂肪酸結(jié)合蛋白I基因、羧肽酶4基因。
7.—種核酸抑制物,選自 (a)以權(quán)利要求2或3任一所述的多核苷酸作為抑制或沉默靶標的dsRNA、反義核酸、小干擾RNA、微小RNA，其中有害生物攝取所述核酸抑制物，抑制所述有害生物的生長；或 (b)以有害生物基因作為抑制或沉默靶標的dsRNA、反義核酸、小干擾RNA、微小RNA，其中有害生物攝取所述核酸抑制物，抑制所述有害生物的生長，所述的有害生物基因選自LIM蛋白I基因、肌球蛋白3輕鏈基因、胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因、胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶Cl基因、胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶C3基因、羥丁酸脫氫酶基因、Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑I基因、脂肪酸結(jié)合蛋白I基因、羧肽酶4基因；或 (c)能表達或形成(a)、(b)所述dsRNA、反義核酸、小干擾RNA、微小RNA的構(gòu)建物。
8.如權(quán)利要求7所述的核酸抑制物，其特征在于，所述的核酸抑制物是權(quán)利要求2或3所述的多核苷酸表達產(chǎn)生的dsRNA，其中有害生物攝取所述dsRNA，抑制所述有害生物的生長。
9.如權(quán)利要求8所述的核酸抑制物，其特征在于，所述的dsRNA，其具有如下結(jié)構(gòu)
10.如權(quán)利要求7所述的核酸抑制物，其特征在于，所述的核酸抑制物是構(gòu)建物，所述構(gòu)建物含有以下結(jié)構(gòu) Seq正向Ueq反向； 其中， Seqi^是權(quán)利要求2或3任一所述的多核苷酸或它們的序列片段,或包含與選自權(quán)利要求2或3中所限定序列的核苷酸序列之至少一部分互補的核苷酸序列； Seqfi^1為與Seq1^1基本上互補的序列； X為位于Seqtt和Seq&^^間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seqtt和Seqg不互補。
11.一種宿主細胞，其包含權(quán)利要求7-10任一所述的核酸抑制物。
12.權(quán)利要求7-10任一所述的核酸抑制物或權(quán)利要求5或11所述的宿主細胞的用途，用于制備防治有害生物的制劑。
13.一種防治有害生物的制劑，其包含 安全有效量選自以下的物質(zhì)權(quán)利要求7-10任一所述的核酸抑制物或權(quán)利要求5或11所述的宿主細胞；以及； 農(nóng)藥學(xué)上可接受的載體。
14.權(quán)利要求12或13中任一項的制劑，其還包含至少一種選自以下的殺蟲劑化學(xué)殺蟲劑、馬鈴薯糖蛋白、蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白、致病桿菌殺蟲蛋白、光桿狀菌殺蟲蛋白、側(cè)孢芽孢桿菌殺蟲蛋白和球形芽孢桿菌殺蟲蛋白。
15.一種防治有害生物的方法，其特征在于，干擾有害生物基因表達，所述的有害生物基因選自LIM蛋白I基因、肌球蛋白3輕鏈基因、胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因、胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶Cl基因、胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶C3基因、羥丁酸脫氫酶基因、Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑I基因、脂肪酸結(jié)合蛋白I基因、羧肽酶4基因。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述方法包括將權(quán)利要求7-10任一所述的核酸抑制物或權(quán)利要求5或11所述的宿主細胞喂食和/或噴灑有害生物。
17.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述方法包括在植物體內(nèi)表達特異性干擾有害生物基因表達的干擾分子；所述的昆蟲基因選自LIM蛋白I基因、肌球蛋白3輕鏈基因、胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶基因、胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶Cl基因、胰凝乳蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶C3基因、羥丁酸脫氫酶基因、Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑I基因、脂肪酸結(jié)合蛋白I基因、羧肽酶4基因。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述方法包括將權(quán)利要求7-10任一所述的核酸抑制物導(dǎo)入到植物中。
19.一種植物或其種子，其特征在于，所述植物由權(quán)利要求2或3所述的多核苷酸轉(zhuǎn)化獲得。
20.如權(quán)利要求19所述的植物，其特征在于，所述多核苷酸在植物細胞中表達為dsRNA。
21.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，或權(quán)利要求7或8所述的核酸抑制物，或權(quán)利要求6或12所述的用途，或權(quán)利要求13所述的制劑，或權(quán)利要求15-17所述的方法，其特征在于，所述有害生物是選自昆蟲、螨、真菌、酵母、霉菌、細菌、線蟲、雜草和寄生蟲以及腐生植物。
22.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，或權(quán)利要求7或8所述的核酸抑制物，或權(quán)利要求6或12所述的用途，或權(quán)利要求13所述的制劑，或權(quán)利要求15-17所述的方法，其特征在于，所述的有害生物是昆蟲有害生物，包括但不限于鱗翅目有害生物、鞘翅目有害生物、半翅目有害生物、以及雙翅目有害生物。
23.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，或權(quán)利要求7或8所述的核酸抑制物，或權(quán)利要求6或12所述的用途，或權(quán)利要求13所述的制劑，或權(quán)利要求15-17所述的方法，其特征在于，所述的昆蟲有害生物選自鱗翅目昆蟲，優(yōu)選為玉米螟或棉鈴蟲。
全文摘要
本發(fā)明涉及基于RNAi技術(shù)的抗蟲制劑及方法。揭示了一些對于防治鱗翅目昆蟲有用的靶標基因(片段)，基于這些靶標基因的核酸序列制備核酸抑制物或表達核酸抑制物的宿主法，可有效地殺滅鱗翅目昆蟲。本發(fā)明還揭示了所述核酸抑制物或表達核酸抑制物的宿主的施用方法。
文檔編號A01P3/00GK102675438SQ20121007300
公開日2012年9月19日 申請日期2012年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月18日
發(fā)明者張 浩, 李海超, 王玉冰, 苗雪霞, 黃勇平 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院