專利名稱：采用病毒唑脫除馬鈴薯病毒的方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及一種采用病毒抑制劑脫除植物病毒的方法，特別涉及一種采用病毒唑脫除幾種常見的馬鈴薯病毒的方法。
背景技術：
馬鈴薯栽培分布較廣，是世界上第四大栽培作物。中國則為馬鈴薯栽培面積最大的國家，馬鈴薯在我國的工農業生產中占有重要地位，發展我國的馬鈴薯種植業則具有重要的戰略意義。然而，馬鈴薯作為無性繁殖作物，它易感染各種病毒。通過研究發現，危害馬鈴薯生長發育的病毒主要有30余種，其中在我國普遍存在而且危害嚴重的有馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)，馬鈴薯Y病毒(PVY)，馬鈴薯X病毒(PVX)，馬鈴薯A病毒(PVA)，馬鈴薯S 病毒(PVS)，馬鈴薯M病毒(PVM)，馬鈴薯類病毒(PSTVd)等病毒或類病毒。馬鈴薯體內病毒的積累可使品系種性退化，品質與質量降低，對其生長造成嚴重危害。只有采用現代生物技術將種薯內的病毒去掉，恢復馬鈴薯品種本身的生理功能和生產特性，才能防止馬鈴薯的退化，使之達到育種家培育之初品種的商品性狀和產量。目前，常用的馬鈴薯病毒脫除方法包括以下三種(I)物理方法。利用一些物理因素如X射線，紫外線，超短波和高溫或冷凍處理等處理種薯使病毒鈍化，可以達到脫除病毒獲得脫毒種薯的目的。其中以熱處理鈍化病毒的方法最為有效，在35°C下處理56天，或在36°C處理39天，可以除去某些馬鈴薯品種塊莖中的PLRV。其優點是操作簡單，短時間內處理大批種薯。缺點是對大多數病毒不能根除，有很大的局限性，而且脫毒效果不理想，同時會造成材料干枯或者死亡。(2)莖尖分生組織脫毒技術。目前應用最廣泛而且在農業生產和商業生產中取得巨大成功的植物脫毒技術，是生物技術中的植株莖尖分生組織培養脫毒技術。根據脫毒難易的程度可排列為PLRV < PVA < PVY < PAMV < PVM < PVX < PVS < PVTVd0但是該方法操作難度大，技術含量高。(3)化學方法。最近研究表明，一些化學藥劑能有效地脫除正在生長的植物體內的病毒，其原理為病毒抑制劑在三磷酸狀態下會阻止病毒RNA帽子結構形成，從而影響病毒RNA的復制，干擾病毒的正常生長，達到除去病毒的目的。目前常見的病毒抑制劑有三氮唑核苷(病毒唑)，5-二氫尿嘧啶(DHT)，雙乙酰-二氫-5-氮尿嘧啶(DA-DHT)等。在實際應用中，人們往往將這些藥物直接加到正常植株生長的培養基上，用以預防病毒感染植物本身。然而，這些病毒抑制劑的加入對植株本身也產生了毒害，即使在非常低的濃度條件下，植株的生長發育也會受到嚴重影響。因此，采用病毒抑制劑提前預防正常植株感染病毒的方法顯得很不科學。

發明內容
鑒于現有技術的不足，發明人通過綜合研究各種脫毒方法的優缺點，提供了一種采用病毒唑脫除馬鈴薯病毒的方法。該方法能有效脫除多種常見的馬鈴薯病毒，且脫毒植株內病毒含量長時間不會出現恢復現象，同時簡單易行，操作方便，可廣泛應用于馬鈴薯脫毒后的無毒種植與生產。本發明的目的是這樣實現的一種采用病毒唑脫除馬鈴薯病毒的方法，其特征在于將感染病毒的馬鈴薯苗接種于含有病毒唑的培養基上培養45-135天，且病毒唑在所述培養基中的濃度為75-150mg/ L0優選地，所述采用病毒唑脫除馬鈴薯病毒的方法，將感染病毒的馬鈴薯苗接種于含有病毒唑的培養基上培養90-135天。優選地，所述采用病毒唑脫除馬鈴薯病毒的方法，病毒唑在所述培養基中的濃度為 75-100mg/L。優選地，所述采用病毒唑脫除馬鈴薯病毒的方法，所述培養基的成分為MS+病毒唑。優選地，所述采用病毒唑脫除馬鈴薯病毒的方法，所述的培養條件為光照強度為 50-80mol/m2/s，光照時間為16h/D，培養溫度為20°C。進一步優選地，所述的病毒選自如下的一種或多種馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)，馬鈴薯Y病毒(PVY)，馬鈴薯X病毒(PVX)，馬鈴薯A病毒(PVA)，馬鈴薯S病毒(PVS)，馬鈴薯 M病毒(PVM)和馬鈴薯類病毒(PSTVd)。與現有技術相比，本發明創造性地采用病毒唑脫除馬鈴薯病毒，通過大量試驗摸索出了病毒唑的最佳使用濃度，可以大批量有效脫除幾種常見的馬鈴薯病毒，病毒脫除率高，且脫毒植株內病毒含量長時間不會出現恢復現象，同時簡單易行，操作方便，可廣泛應用于馬鈴薯脫毒后的無毒種植與生產。


圖IPVX病毒唑處理135天病毒含量及后期恢復情況PVX試管苗1、2、3表示經病毒唑處理135天及這3棵試管苗第一節接種到普通MS 培養基中繼代培養3次后的馬鈴薯試管苗。圖2PVM病毒唑處理135天及后期恢復病毒含量情況PVM試管苗1、2、3表示經病毒唑處理135天及這3棵試管苗第一節接種到普通MS 培養基中繼代培養3次后的馬鈴薯試管苗。圖3PVS病毒唑處理135天及后期恢復病毒含量情況PVS試管苗1、2、3表示經病毒唑處理135天及這3棵試管苗第一節接種到普通MS 培養基中繼代培養3次后的馬鈴薯試管苗。圖4PLRV病毒唑處理135天及后期恢復病毒含量情況PLRV試管苗1、2、3表示經病毒唑處理135天及這3棵試管苗第一節接種到普通 MS培養基中繼代培養3次后的馬鈴薯試管苗。圖5PVA病毒唑處理135天及后期恢復病毒含量情況PVA試管苗1、2、3表示經病毒唑處理135天及這3棵試管苗第一節接種到普通MS 培養基中繼代培養3次后的馬鈴薯試管苗。
具體實施例方式以下是本發明的具體實施例，對本發明的技術方案做進一步作描述，但是本發明的保護范圍并不限于這些實施例。凡是不背離本發明構思的改變或等同替代均包括在本發明的保護范圍之內。實施例I病毒唑脫除PVX將感染PVX的馬鈴薯試管苗接種到含一定濃度(0mg/L、75mg/L、100mg/L、150mg/ L、200mg/L)的病毒唑的MS培養基中，在光照強度為50-80mol/m2/S，光照時間為16h/D，培養溫度為20°C的培養室中進行培養，一個培養周期為45天，一周期后將植株頂端接種到下一同濃度培養基中進行下一周期的培養，剩下植株部分進行ELISA檢測及植株株高、鮮重測定(結果見表I)。結果表明單獨感染PVX的毒源植株在濃度為75mg/L-150mg/L時處理 90天，病毒脫除率可達到100% (結果見表6)。表I病毒唑處理侵染PVX的馬鈴薯試管苗不同濃度的株高、鮮重
處理株高平均數顯著性差異鮮重平均數顯著性差異(cm)0.05(g)0.050 mg/L8.8208a1.1738a75 mg/L3.8541b1.1125b100 mg/L3.5600b0.0804C150 mg/L2.9000b0.0585C200 mg/L2.2000b0.0530C標注表格中a、b、c用來表示各數據間的顯著性差異。實施例2病毒唑脫除PVM將復合侵染MSY的馬鈴薯試管苗接種到含一定濃度(0mg/L、75mg/L、100mg/L、 150mg/L、200mg/L)的病毒唑的MS培養基中，在光照強度為50-80mol/m2/s,光照時間為 16h/D，培養溫度為20°C的培養室中進行培養，一個培養周期為45天，一周期后將植株頂端接種到下一同濃度培養基中進行下一周期的培養，剩下植株部分進行ELISA檢測及植株株高、鮮重測定(結果見表2)。對于復合侵染MSY的馬鈴薯試管苗，處理45天時各濃度對PVM 的脫除率在50% -100%之間，對PVS、PVY的脫除率為0% ;處理90天時，各濃度對PVM的脫除率在50% -100%之間，對PVS的脫除率在40% -67%之間，對PVY的脫除率為0%;處理135天時，各濃度對PVM、PVS的脫除率為100%，對PVY的脫除率為33% (結果見表7)。表2病毒唑處理復合侵染YSM的馬鈴薯試管苗不同濃度的株高、鮮重處理株高平均數顯著性差異鮮重平均數(g)顯著性差異(cm)0.050.050 mg/L7.6407a0.1533a75 mg/L6.6414a0.1459ab100 mg/L5.4400b0.1110be150 mg/L2.5133C0.0871C200 mg/L1.9625C0.0568C標注表格中a、b、c用來表示各數據間的顯著性差異。實施例3病毒唑脫除PVS將感染PVS的馬鈴薯試管苗接種到含一定濃度(0mg/L、75mg/L、100mg/L、150mg/ L、200mg/L)的病毒唑的MS培養基中，在光照強度為50-80mol/m2/S，光照時間為16h/D，培養溫度為20°C的培養室中進行培養，一個培養周期為45天，一周期后將植株頂端接種到下一同濃度培養基中進行下一周期的培養，剩下植株部分進行ELISA檢測及植株株高、鮮重測定(結果見表3)。結果表明單獨侵染處理90天時，其脫除率可達到75%以上；處理135 天時，各個濃度均可以將PVS完全脫除(結果見表6)。表3病毒唑處理侵染PVS的馬鈴薯試管苗不同濃度的株高、鮮重
處理株高平均數 (cm)顯著性差異鮮重平均數(g)顯著性差巳 升0.050.050 mg/L15.3381a0.3385a75 mg/L7.9750a1.1723b100 mg/L5.4046a0.1087C150 mg/L2.9000a0.0916C200 mg/L————————標注表格中a、b、c用來表示各數據間的顯著性差異。實施例4病毒唑脫除PLRV將感染PLRV的馬鈴薯試管苗接種到含一定濃度(0mg/L、75mg/L、100mg/L、150mg/ L、200mg/L)病毒唑的MS培養基中，在光照強度為50-80mol/m2/s，光照時間為16h/D，培養溫度為20°C的培養室中進行培養，一個培養周期為45天，一周期后將植株頂端接種到下一同濃度培養基中進行下一周期的培養，剩下植株部分進行ELISA檢測及植株株高、鮮重測定(結果見表4)。結果表明單獨侵染PLRV的毒源植株在處理90天時，濃度為75mg/L， 100mg/L的病毒唑對該病毒的病毒脫除率為33%，濃度為150mg/L可以完全脫除PLRV ;當處理135天時，75mg/L, 100mg/L的病毒唑對PLRV的脫除率達到100% (結果見表6)。表4病毒唑處理侵染PLRV的馬鈴薯試管苗不同濃度的株高、鮮重
權利要求
1.采用病毒唑脫除馬鈴薯病毒的方法，其特征在于將感染病毒的馬鈴薯苗接種于含有病毒唑的培養基上培養45-135天，且病毒唑在所述培養基中的濃度為75-150mg/L。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于將感染病毒的馬鈴薯苗接種于含有病毒唑的培養基上培養90-135天。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于病毒唑在所述培養基中的濃度為 75-lOOmg/L。
4.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述培養基的成分為MS+病毒唑。
5.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述的培養條件為光照強度為 50-80mol/m2/s，光照時間為16h/D，培養溫度為20°C。
6.根據權利要求1-5任一項所述的方法,其特征在于所述的病毒選自如下的一種或多種PVX、PVY、PVM, PVS, PLRV、PSTVd 和 PVA0
全文摘要
采用病毒唑脫除馬鈴薯病毒的方法，本發明涉及一種采用病毒抑制劑脫除植物病毒的方法，包括將感染病毒的馬鈴薯苗接種于含有病毒唑的培養基上培養45-135天，且病毒唑在所述培養基中的濃度為75-150mg/L。本發明方法簡單易行，操作方便，對常見的幾種馬鈴薯病毒均具有極高的脫除效率，可以在生產過程中使用，便于大批量處理材料，是一種高效的馬鈴薯病毒脫除技術。
文檔編號A01H4/00GK102599057SQ20121007817
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月22日 優先權日2012年3月22日
發明者宋波濤, 楊立杰, 柳俊 申請人:華中農業大學