專利名稱：一種棉花抗旱相關基因GbMYB5的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種棉花抗旱相關基因GbMYB5，同時涉及GbMYB5基因在提高煙草抗旱能力中的應用。
背景技術：
MYB類轉錄因子屬于帶色氨酸簇的轉錄因子家族，含有一段保守的DNA結合區(DBD) MYB結構域的一類轉錄因子，DBD區一般包含1_3個不完全重復序列(R)，每個重復片段含有51-53個氨基酸，包含一系列高度保守的氨基酸殘基和間隔序列。這些高度保守的氨基酸殘基使得MYB區以成螺旋-轉角-螺旋(HTH)的形式與DNA大溝結合，這3個殘基間隔18-19個氨基酸，起疏水核心作用，對維持MYB的HTH構型有重要意義。根據重復片段R的個數，可以將MYB類轉錄因子分為單一 MYB結構域蛋白(R1/R2)、2R蛋白(R2R3)以及3R蛋白(R1R2R3)。Stracke等發現擬南芥中還存在4RMYB基因。近年來對MYB類轉錄因子的研究表明，MYB類轉錄因子廣泛參與植物發育和代謝的各個方面。組合調控是真核基因表達調控的重要方式，主要通過多種轉錄因子之間的相互作用來實現對靶基因的精密調控。MYB類轉錄因子與其它轉錄因子家族成員通過組合調控的方式來調節植物的形態建成、次生代謝，并對外界環境刺激、激素誘導及病蟲害等做出應答反應。在植物應答生物脅迫及非生物脅迫時，MYB基因的表達起重要作用。MYB基因被證實參與植物抗干旱脅迫、高鹽脅迫、高溫脅迫、低溫脅迫、UV輻射等，如厚葉旋蒴苣苔的BcMYBl能對PEG(干旱)、高鹽、低溫等脅迫產生一定程度的應答，擬南芥的AtMYB2及AtMYB60參與植物抗旱，水稻0smyb4高量表達能提高植物對干旱、高鹽、UV輻射的耐受性。擬南芥中，MYB5基因是R2R3MYB基因家族的成員。植物中R2R3MYB蛋白是一個龐大的家族，其功能也非常多樣。僅在擬南芥基因組中就至少有135個基因是編碼R2R3MYB轉錄因子的，而且其功能大部分是與調控細胞死亡、苯丙烷類代謝途徑、色氨酸合成途徑和抗旱等相關的。因此，這類基因具有比較廣泛的研究和應用前景。植物受病原菌侵染后，引發細胞程序化死亡，即過敏性反應(Hypersensitiveresponse, HR)，水楊酸(SA)在其中扮演重要角色，擬南芥中分離出的AtMyb30是R2R3MYB基因家族的成員，它能在HR早期瞬時表達的一個MYB轉錄因子，該基因的過量表達及抑制實驗證明，AtMYB30能夠參與SA的合成，從而調控細胞死亡。據統計表明，世界范圍內適于耕種的土地面積占陸地總面積的10%左右，而大部分陸地面積則處于干旱、鹽堿、沼澤等逆境下。隨著人口老齡化的加劇以及環境的不斷惡化，培育出適合在逆境環境下生長的作物勢在必行。一個轉錄因子可調控多個與同類性狀有關的基因，可通過調節關鍵因子來達到植物抗逆性的綜合性改變，因此應用轉錄因子提高植物的抗逆性已成為近年的研究熱點。棉花作為世界上最重要的農作物和經濟作物之一，從棉花中分離克隆出MYB轉錄因子有利于人們進一步認識和解析轉錄因子對于非生物脅迫等的調控機制，也有利于棉花品質改良和耐受性研究工作的進一步開展。

發明內容
本發明的目的是提供一個來源于棉花的與抗旱相關的MYB型轉錄因子。本發明利用陸地棉MaxxaBAC文庫中所獲得的一個BAC克隆進行測序分析過程中，發現了一個新的MYB類轉錄因子，并設計特異引物從海島棉品種H7124中克隆出GbMYB5，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示，該基因共編碼277個氨基酸，其氨基酸序列如SEQ IDNO. 2所示，屬于MYB轉錄因子。本領域技術人員可以根據本發明公開的氨基酸序列，在不影響其活性的前提下，取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸，得到所述蛋白的突變序列。因此，本發明蛋白還包括SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列經取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸，具有同等活性的由所述蛋白衍生得到的蛋白質。本發明基因包括編碼所述蛋白的核酸序列。此外，考慮到密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領域技術人員可 以根據需要使用適合特定物種表達的密碼子。
本發明的基因和蛋白質可以從海島棉中克隆或分離得到，或者通過DNA或肽合成的方法得到。將發明基因與表達載體連接，得到能夠表達本發明蛋白的重組載體，進而可以通過諸如農桿菌介導法、花粉管通道法等轉基因方法，將所表述表達載體導入宿主細胞，得到轉GbMYB5基因的轉化體。本發明通過將外源GbMYB5基因整合到煙草基因組，轉基因植株的抗旱能力增強，其生長未受到干旱脅迫的顯著影響。表明GbMYB5可用于提高煙草對干旱脅迫的抗性。本發明的提供了所述棉花基因GbMYB5在煙草品種選育中的應用。提供了所述棉花基因GbMYB5在提高煙草抗旱能力中的應用。


圖I :GbMYB5基因在棉花不同部位表達的RT-PCR分析。圖2 GbMYB5基因在非生物脅迫下表達分析。圖3:煙草的遺傳轉化A.愈傷組織培養；B.篩選培養；C.生根培養；D.再生植株。圖4 :再生煙草的PCR檢測I =Marker DS 2000 2-21 :再生煙草PCR結果。圖5 :轉基因煙草的RT-PCR檢測I :Marker DS 2000 2_15 :轉基因煙草RT-PCR結果。圖6 :卡那霉素篩選轉基因煙草。圖7 :25 % PEG6000模擬干旱下葉片生長狀況。圖8 :2 % PEG6000培養基模擬干旱下植株生長狀況。圖9 :2% PEG6000培養基模擬干旱前，植株的生長狀況。圖10 2% PEG6000培養基模擬干旱2周后，植株的生長狀況。圖11 :2% PEG6000培養基模擬干旱3周后，植株的生長狀況。圖12 :2% PEG6000培養基模擬干旱3周后，植株的生長情況(去除培養基)。圖13 :2% PEG6000培養基模擬干旱4周后，植株的生長情況。圖14 :2% PEG6000培養基模擬干旱4周后，植株的生長情況(去除培養基)。
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特殊說明均為常規方法。I.本發明所用的生物材料海島棉(Gossypiumbarbadense) 7124、煙草(Nicotiana tabacum) K326 (CharlesS. Johnson, Jeremy A. Pattison, Elizabeth M. Clevinger et al. Clarifying the sourceof black shank resistance in flue-cured Tobacco. Plant Health Progress.Doi 10. 1094/PHP-2008-0618-02-RS)和擬南芥(Arabidopsis thaliana)哥倫比亞型(ZHANGJian, XU Jin-Xiang, KONG Ying-Zhen et al. Generation of chemical-inducibleactivation tagging insertion lines of Arabidopsis thaliana. Acta GeneticaSinica. 2005,32(10) : 1082-1088)、植物表達載體pCAMBIA2301 (Peter Hajdukiewicz，ZoraSvab,Pal Maliga. The small,versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectorsfor plant transformation. Plant Molecular Biology. 1994,25:989-994)以及根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404購自寶生物工程(大連)有限公司。BAC克隆購自 Clemson University Genomics Institute。2. GbMYB5基因的克隆根據獲得的BAC克隆中含有MYB結構域的序列設計特異引物BamMYB19 :5; ACTGGATCCACATGGGTCGAGCTCCTTGCTGT3' (SEQ ID NO. 3),KpnMYBl122 5/ TCCAGGTACCTTGTCTCTTGCTACATAGGGTAACC3' (SEQ ID NO. 4)。引物分別添加 BamH I 和 Kpn I 酶切位點。CTAB 法提取海島棉 RNA,用 TransScript First-Strand cDNA SynthesisSuperMix (北京全式金生物技術有限公司產品)制備cDNA第一鏈。以cDNA第一鏈為模板，引物BamMYB19和KpnMYBl 122，PCR擴增GbMYB5基因，PCR擴增程序為94°C預變性3分鐘，94 °C變性30秒，59 °C退火50秒，72°C延伸I分20秒，共36個循環，最后72°C延伸10分鐘。電泳檢測得到I. IKb大小的PCR產物片段，將此PCR產物純化后克隆到pEASY-T3載體(北京全式金生物技術有限公司)，構建中間載體T-GbMYB5，測序工作由上海英駿生物有限公司完成。測序結果表明，該外源片段全長為1105bp，有一個長為832bp的開放式閱讀框，編碼277個氨基酸，命名為GbMYB5，在GenBank的登錄號為JF820389。經與NCBI上注冊登錄的基因進行BLAST分析，GbMYB5基因與模式植物擬南芥(登錄號AAC83600)和櫓豆MYB71(登錄號ABH02912)的同源基因相似性在51 %左右，是新基因。3.GbMYB5基因在不同組織中的表達根據海島棉GbMYB5基因全長序列，利用Primer5軟件設計一對特異引物 MYBFrt :5 ' AGGCTTCTAATGGAAACCCTAACC3 ' (SEQ ID NO.5), MYBRrt 5' TCCATTGGTTGAAGAACAGAAGT3' (SEQ ID NO. 6)。分別提取海島棉 7124 的莖、葉、蕾、絮和未成熟種子的總RNA，以反轉錄獲得的cDNA作為PCR模板進行擴增，預實驗確定RT-PCR條件。以海島棉cDNA為模板，MYBFrt, MYBRrt為引物進行RT-PCR擴增，結果表明，GbMYB5基因在這些器官均有表達，但在營養器官的表達量明顯高于生殖器官的表達量，尤以在葉子中的表達最高，其次在莖中也有較高的表達量，而在絮和蕾中僅有輕微的表達(見圖1，其中Histone為對照)。
4. GbMYB5基因在不同脅迫處理下的表達分析海島棉脫絨種子直接播種于營養土，待幼苗長至2 3片真葉時，分別對幼苗進行重金屬、干旱、脫落酸和赤霉酸誘導處理。重金屬處理用5ml的IOuM的CuSO4溶液直接噴灑棉株；干旱處理用5ml濃度為20%的PEG6000澆灌棉株；脫落酸(ABA)處理用5ml的15mg/L的ABA溶液直接噴灑植株；赤霉酸(GA)處理用5ml的IOppm的赤霉酸溶液直接噴灑棉株。以上所有處理時間一致，分別取處理后24h、48h和未誘導的植物葉片(CK)，迅速置于液氮中，_70°C存放備提取總RNA用。在重金屬(CuSO4)處理后，GbMYB5基因表達量與對照相比明顯下降，但在處理48h后，表達量比對照略有上升。PEG模擬干旱處理下，GbMYB5基因表達在24h時稍有提高，在48h時急速增加。ABA和GA激素誘導處理在24h內可顯著提高GbMYB5基因的表達，但隨時間推移，GbMYB5對兩者的響應不同，ABA處理48h后，GbMYB5基因表達量還維持在24h時的高水平，而GA處理48h后，GbMYB5基因表達量迅速下降。這表明GbMYB5基因對重金屬、干旱、ABA和GA誘導均有響應，可能與植物抗逆有關(見圖2，其中Histone為對照)。5.重組載體的構建以及煙草轉化用BamH I和Kpn I酶切中間載體T_GbMYB5，得到I. I. Kb大小的目的片段，與經同 樣雙酶切處理后的PCAMBIA2301質粒連接，獲得重組表達載體pCAMBIA2301_GbMYB5，采用凍融法將pCAMBIA2301-GbMYB5轉化農桿菌LBA4404，轉化子經PCR驗證后保存備用。本實驗采用葉盤共培養法轉化煙草。侵染將消毒好的外植體煙草葉片剪成Icm2大小，置于含有重組質粒的農桿菌LBA4404/pCAMBIA2301-Gb (OD6tltl = O. 3-0. 4)浸染液中浸泡5_6min,然后用滅菌后的濾紙吸干。共培養于MS共培養培養基上暗處理48h。篩選培養48h后將浸染的葉片轉移至含有卡那霉素和利福平的篩選培養基上。繼代培養每隔IOd左右換一次培養基。生根培養篩選出生根苗，將篩選出的生根幼苗轉移到生根培養基上。移栽生根苗長2-3周時，煉苗后移栽至土壤中。所用培養基見下表。表煙草轉化所用培養基
權利要求
1.SEQ ID NO. I所示的棉花基因GbMYB5在煙草品種選育中的應用。
2.SEQ ID NO. I所示的棉花基因GbMYB5在提高煙草抗旱能力中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種與植物抗旱相關的棉花GbMYB5基因，同時涉及GbMYB5基因在提高煙草抗旱能力中的應用。本發明棉花抗旱基因GbMYB5具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。該轉錄因子是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQIDNO.2；2)將序列表中SEQIDNO.2的氨基酸殘基序列經過一或幾個氨基酸殘基的取代，缺失或添加且具有調控植物抗旱性功能的蛋白質。本發明的蛋白及其編碼基因對于植物抗旱性機制的研究，以及提高植物的抗旱性狀的改良具有重要的理論和實際意義，將在植物的抗旱基因工程改良中發揮重要作用，應用前景廣闊。
文檔編號A01H5/00GK102643830SQ201210077310
公開日2012年8月22日 申請日期2012年3月22日 優先權日2012年3月22日
發明者周璐, 張保龍, 楊郁文, 胡雪虹, 郭佳茹, 陳天子, 馬飛 申請人:南京師范大學