專利名稱：一種轉基因棉花胚性愈傷分化培養基的制作方法
技術領域：
本發明涉及轉基因棉花組織培養領域，具體是一種轉基因棉花胚性愈傷分化培養基。
背景技術：
棉花轉基因的目的是將外源目的基因轉入常規棉花中，利用組織培養生物技術，培育具有抗病、抗蟲、耐逆性強和品質優良等目的的棉花新種質資源，其常規組織培養方法為首先，利用攜帶外源目的基因的農桿菌侵染受體棉花下胚軸，共培養48小時后，經過愈傷誘導，愈傷誘導成胚狀體(胚性愈傷)，胚性愈傷分化生成再生株(胚性愈傷分化成苗)，再生株移植等步驟。其中，在整個培養過程中，胚性愈傷分化成苗是最為關鍵步驟，其常規培 養基制作方法有兩種，一種為添加MS大量元素、微量元素、葡萄糖，調整pH至6. 8，添加固化劑Phytagel (吉蘭糖膠)，所述的固化劑Phytagel的濃度為2. 0 2. 5g/L ;另一種為添加MS大量元素、微量元素、葡萄糖,調整pH至6. 8,添加固化劑Phytagel,所述的固化劑Phytagel的濃度為2. (T2. 5g/L，該培養基表面添加有滅菌濾紙。培養方法為用透氣膜包扎封口培養基，高壓滅菌，接種轉基因棉花胚性愈傷組織或處于分化萌芽狀態的愈傷組織，培養間常規培養。一般情況下，愈傷誘導分化的胚性愈傷很多，但胚性愈傷分化成苗率較低。造成此結果的原因為采用第一種培養基培養，分化成苗玻璃化程度較高(卷曲畸形，透明質脆，生長不良)，導致胚性愈傷分化成苗率較低；采用第二種培養基培養，易分化，但分化成苗玻璃化程度也較高，且易產生污染現象(滅菌濾紙上易形成霉菌或其他雜菌)，尤其在夏季多雨季節,導致胚性愈傷分化成苗率較低。為了解決上述技術難點，迫切需要研究出一種適宜胚性愈傷分化成苗率較高，且分化成苗程度較低的轉基因棉花胚性愈傷分化培養基。

發明內容
本發明為了解決現有轉基因棉花胚性愈傷分化成苗率較低的問題，提供了一種轉基因棉花胚性愈傷分化培養基。本發明是通過以下技術方案實現的一種轉基因棉花胚性愈傷分化培養基，其制作方法為添加MS大量元素、微量元素、葡萄糖，調整pH值至6. 8，添加固化劑PhytagelJf述的固化劑Phytagel的濃度為4. (T4. 5g/L。本發明所述的MS大量元素、微量元素、葡萄糖的種類和添加量，以及調整pH的方法為本領域技術人員公知常識。所述的固化劑Phytagel的濃度單位g/L，為質量體積比，其體積為添加固化劑Phytagel之前的培養基的總體積。轉基因棉花胚性愈傷分化培養基由于通常采用常規固化劑Phytagel使用濃度為
2.(T2. 5g/L，玻璃化現象較嚴重，即使培養基表面添加滅菌濾紙，玻璃化程度也較高，且易污染。引起分化成苗玻璃化現象的原因至今不明，比較統一的觀點是細胞內含物如原生質體等得不到充分發育，液泡內水分含量過大，細胞內充滿水分。針對玻璃化現象控制的主要方法是調節培養基水分含量制作培養基時增加固化劑用量，提高培養基凝固程度，降低培養基中的水勢，達到在水份釋放時以一種較緩慢的速度供給胚性愈傷生長發育的需要。以轉基因棉花組織培養理論為基礎，根據轉基因棉花胚性愈傷分化對營養物質的需求，所以需要在常規固化劑Phytagel使用濃度基礎上提高固化劑Phytagel使用濃度，但是如何掌握適宜的Phytagel使用濃度,并無相關的研究資料可以直接借鑒。若采用的Phytagel使用濃度太低，則胚狀體細胞內的水份較高，其玻璃化現象較嚴重；若采用的Phytagel使用濃度太高，則培養基過硬，培養基中的營養物質難以擴散到培養物中。本發明經過大量的實驗篩選出適宜的固化劑Phytagel濃度,大膽的打破了常規的固化劑Phytagel使用濃度,顯著提高了固化劑的使用濃度，用于轉基因棉花胚性愈傷分化的培養，使培養基對培養物(愈傷組織)之間產生水分脅迫，降低了胚性愈傷組織細胞內水份含量，可有效地控制玻璃化與污染等現象，提高胚性愈傷分化成苗率。另外，固化劑Phytagel濃度的提高，加大了對培養基中水份的束縛，有效的減少了由于培養基中水份蒸發后在瓶口及瓶壁冷凝回流對培養基造成的污染現象。本發明所述的轉基因棉花胚性愈傷分化培養基通過顯著提高固化劑Phytagel的 濃度，不易產生污染現象，有利于胚性愈傷的生長發育，可有效的改善分化幼苗的玻璃化現象，從而顯著提高了胚性愈傷分化的成苗率。


圖I為固化劑Phytagel的濃度為2. 0 g/L的胚狀體的生長狀況。圖2為固化劑Phytagel的濃度為2. 5 g/L的胚狀體的生長狀況。圖3為固化劑Phytagel的濃度為2. 0 g/L且培養基表面添加滅菌濾紙的胚狀體的生長狀況。圖4為固化劑Phytagel的濃度為2. 5 g/L且培養基表面添加滅菌濾紙的胚狀體的生長狀況。圖5為固化劑Phytagel的濃度為4. 0 g/L的胚狀體的生長狀況。圖6為固化劑Phytagel的濃度為4. 5 g/L的胚狀體轉化再生株的生長狀況。
具體實施例方式—種轉基因棉花胚性愈傷分化培養基，其制作方法為添加MS大量兀素、微量兀素、葡萄糖，調整pH值至6. 8,添加固化劑Phytagel,所述的固化劑Phytagel的濃度為4.0g/L,4. 05 g/L,4. 10 g/L,4. 15 g/L,4. 20 g/L,4. 25 g/L,4. 30 g/L,4. 35 g/L,4. 40 g/L、4. 45 g/L、4. 5 g/L。I.材料與方法
I.I試驗材料
選用轉基因棉花胚性愈傷組織為實驗材料。I. 2轉基因棉花胚性愈傷分化培養基的制作
I.2. I實驗一
MS大量元素、微量元素(MS大量元素以及微量元素均為常規用量),葡萄糖30g/L ；10%K0H 調整 pH 至 6. 8 ;
固化劑Phytagel的用量分別設置14組對比試驗2. 0g/L、2. 5 g/L,2. 8 g/L,3. O g/L、
3.3 g/L、3. 5 g/L、3. 8 g/L、4. O g/L、4. 2 g/L、4. 5 g/L、4. 8 g/L、5.0 g/L、5. 2 g/L、5. 5 g/L0I. 2. 2 實驗二
MS大量元素、微量元素(MS大量元素以及微量元素均為常規用量),葡萄糖30g/L ； 10%K0H調整pH值至6. 8 ；
固化劑Phytagel的用量分別設置2組對比試驗2. 0g/L、2. 5 g/L ；
培養基表面添加有滅菌濾紙。I. 3培養方法
兩實驗的培養基均用透氣膜包扎封口培養基，高壓滅菌，接種轉基因棉花胚性愈傷組織，培養間常規培養。2.結果
表I為實驗一的結果顯示，培養基中固化劑Phytagel的用量影響胚狀體的生長。選用常規的固化劑Phytagel使用濃度(2. (T2. 5g/L)時，分化成苗玻璃化現象較嚴重，胚性愈傷分化成苗率較低。當固化劑Phytagel的濃度逐漸升高時,分化成苗玻璃化現象逐漸減少，胚性愈傷分化成苗率逐漸增加。當固化劑Phytagel的濃度超過4. 5g/L，會逐漸表現為培養基硬度增加，造成培養基中營養物很難被胚性愈傷組織吸收，導致胚性愈傷組織生長緩慢甚至死亡的現象發生。在4. (T4. 5g/L之間的范圍，分化成苗玻璃化現象程度相對較低，胚性愈傷分化成苗率相對較高。因此，固化劑Phytagel濃度在4. (T4. 5g/L之間時，更適宜轉基因棉花胚性愈傷分化的培養。 表I培養基表面不添加滅菌濾紙的情況下胚狀體的生長狀況
權利要求
1.ー種轉基因棉花胚性愈傷分化培養基，其制作方法為添加MS大量元素、微量元素、葡萄糖，調整pH值至6. 8,添加固化劑Phytagel,其特征在于,所述的固化劑Phytagel的濃度為 4. 0 4· 5g/L。
全文摘要
本發明涉及轉基因棉花組織培養領域，具體是一種轉基因棉花胚性愈傷分化培養基，解決了現有轉基因棉花胚性愈傷分化成苗率較低的問題，其制作方法為添加MS大量元素、微量元素、葡萄糖，調整pH值至6.8，添加Phytagel固化劑，所述的固化劑Phytagel的濃度為4.0~4.5g/L。本發明所述的轉基因棉花胚性愈傷分化培養基通過顯著提高固化劑Phytagel的濃度，不易產生污染現象，有利于胚性愈傷的生長發育，可有效的改善分化幼苗的玻璃化現象，從而顯著提高了胚性愈傷分化的成苗率。
文檔編號A01H4/00GK102648697SQ20121010646
公開日2012年8月29日 申請日期2012年4月12日 優先權日2012年4月12日
發明者上官小霞, 原輝, 吳霞, 崔婷, 張相斌, 李燕娥, 段曉康, 王霞, 韓青龍, 馬冬菊, 馬燕斌 申請人:山西省農業科學院棉花研究所