專利名稱：一種含有耐草甘膦基因的重組dna片段及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種 含有耐草甘膦基因的重組DNA片段及其應用，特別涉及一種根據玉米偏好密碼子設計并合成的含有耐草甘膦基因的重組DNA片段及其應用。
背景技術：
目前在植物轉基因育種中所應用的外源基因如Bt、EPSPS等，大多來自原核生物，由于原核生物基因自身的特點，如I) AT含量較高，超過60 %，造成基因表達的mRNA在植物體內極易被降解；2)存在類似真核基因的內含子切點、轉錄終止子序列，造成轉錄不完整、mRNA異常剪切等；3)密碼子與植物密碼子存在較大差異，造成蛋白翻譯效率降低；4)其結構與植物等真核生物差異顯著，如不含有真核生物基因的5’ -UTR序列和3’末端的PolyA加尾序列，導致基因在植物體內往往表達水平較低。例如，來自于蘇云金芽孢桿菌的野生型殺蟲蛋白基因在植物中的表達量非常低，其表達的毒蛋白只占總蛋白的0. 001%或者幾乎檢測不到。美國 Monsanto 公司的 Perlak(Perlak F J, Fuchs R L, Dean D A,et al. Modification of the coding SEQ ID NO. uence enhances plant expressingof insect control protein genes. Proc Natl Acad Sci USA,1991,88 :3324-3328)和 Iannacone 等(Iannacoe R, Grieco P D, Cellini F. Specific SEQ ID NO. uencemodification of a cry3B endotoxin gene result in high levels of expression andinsect resistance. Plant Mol Biol, 1997, 34 :485-496)在不改變毒蛋白氛基酸序列的前提下，分別對殺蟲蛋白基因和cryIII基因進行了改造，選用植物偏愛的密碼子，增加GC含量，并去除原序列中存在的polyA和富含AT的ATTTA序列等不穩定元件序列，使轉基因植株中毒蛋白的表達量增加了 30 100倍，高達可溶性蛋白的0. 02 1%，獲得了明顯的抗蟲效果。雜草是農作物生產的大害，自1942年出現近代雜草防治技術以來，化學除草劑有了很大的發展。草甘膦類除草劑是一種廣譜性、非選擇性除草劑，它通過抑制EPSPS (5-烯醇丙酮酰草酸-3-磷酸合酶，是植物體內芳香族氨基酸合成途徑中的一個重要酶)的活性，阻斷了植物莽草酸途徑的生物合成，強烈抑制細胞分裂，對許多一年生和多年生雜草都具有強烈的抑制作用。由于草甘膦易于被微生物分解，在土壤中無殘毒，對動物無毒害，自從1976年Roundup研制成功以來，得到了廣泛的應用。但是，由于玉米等禾本科作物對草甘膦敏感，使其應用受到限制。因此，將耐草甘膦基因轉入玉米，不但可以擴大草甘膦的使用范圍，而且可降低生產成本，保護玉米免受藥害，最終達到增產增收的目的。盡管耐草甘膦基因G2-aroA已在2004年被發現，并在宿主熒光假單胞菌G2及大腸桿菌中都能高效表達,表現高耐草甘膦的特性(Yichen Sun, Min Linand Yiping Wang. Novel AroA with high tolerance to Glyposate, encoded by a geneof Pseudomonas putida 4G—1 isolated from an extremeIypoIluted environment inChina. Aplied and environmental microbiology. 2005, 71 (8) :4771-4776),但其在植物,特別是重要的糧食作物中由于表達量較低而沒有被利用，因此急需對其在植物中的應用進行研究，如進行密碼子優化，以加速其應用到農業生產中。

發明內容
本發明的目的是提供一種重組DNA片段。本發明所提供的重組DNA片段包括如下I)-3)的元件I)啟動子；2)由所述啟動子啟動轉錄的耐草甘膦基因；所述耐草甘膦基因(命名為mG2-aroA)的核苷酸序列為下述a)或b)
a)序列表中序列2 ；b)與序列表中序列2至少具有98%的同一性，且編碼序列9所不蛋白質(命名為G2-aroA 蛋白)；3)終止序列?？捎糜诒景l明的啟動子包括但不限于組成型啟動子，組織、器官和發育特異的啟動子，和誘導型啟動子。如花椰菜花葉病毒的組成型啟動子35S ;西紅柿蛋白酶抑制劑II啟動子(PIN2)或LAP啟動子(均可用茉莉酮酸甲酯誘導)；熱休克啟動子；四環素誘導型啟動子；種子特異性啟動子，如谷子種子特異性啟動子PF128，種子貯存蛋白質特異的啟動子(例如，菜豆球蛋白、nap in, oleosin和大豆beta conglycin的啟動子等。在本發明的一個實施例中，所述啟動子為Ubi啟動子，來源于玉米，為組成型表達啟動子，其序列具體為序列表中序列5，或與序列5至少具有80%的同一性，且具有啟動子功能。可用于本發明的轉錄終止子包括但不限于農桿菌胭脂堿合成酶終止子(N0S終止子)、花椰菜花葉病毒CaMV 35S終止子、tml終止子、豌豆rbcS E9終止子和胭脂氨酸和章魚氨酸合酶終止子。所述轉錄終止序列具體為T-NOS雙終止序列，如序列表中序列8的第216-491位所示，或與序列8的第216-491位至少具有80%的同一性，且具有轉錄終止功能的序列。在本發明的一個實施例中，所述重組DNA片段還包括OMK序列。所述OMK序列由Q序列和Kozak序列順次連接組成，其序列具體為序列表中序列6，或與序列6至少具有80%的同一性，且具有增強子功能。所述Q序列和Kozak序列來源于煙草花葉病毒，為增強子，負責增強所述耐草甘勝基因的表達。在本發明的一個實施例中，所述重組DNA片段還包括葉綠體導肽(CTP)序列，其序列具體為序列表中序列7，或與序列7至少具有80%的同一性，且具有信號肽功能。所述葉綠體導肽(CTP)序列來源于玉米，為信號肽序列，能使所述耐草甘膦基因表達的蛋白(G2-aroA蛋白)轉運到葉綠體中去。在本發明的一個實施例中，所述重組DNA片段由所述Ubi啟動子、所述OMK序列、所述葉綠體導肽序列、所述耐草甘膦基因和所述轉錄終止序列順次連接組成，命名為Ubi-0MK-CTP-mG2aroA_PoIyA-T-NOS ;其序列具體如序列表中序列10所不。其中，序列2由1338個核苷酸組成，其末尾處為兩個終止密碼子。序列2的第1-1335位為編碼序列，編碼序列表中序列9所示的G2-aroA蛋白。序列5由2010個和核苷酸組成。序列6由67個核苷酸組成。序列7由141個核苷酸組成。序列8由491個核苷酸組成。序列9由444個氨基酸組成。序列10由4058個核苷酸組成，其中第1-2010位為Ubi啟動子序列，第2022-2088位為OMK序列，第2089-2229位為葉綠體導肽(CTP)序列，第2230-3567位為mG2_aroA序列，第3568-4058位為轉錄終止序列。含有所述重組DNA片段的重組細胞系、轉基因植物或轉基因微生物也屬于本發明的保護范圍。所述重組細胞系可以為真核細胞，也可以為原核細胞，如植物細胞系。在本發明的一個實施例中，所述轉基因植物(如玉米)包括種子、愈傷組織、完整植株和細胞。所述轉基因微生物為轉入所述重組DNA片段的農桿菌LBA4404。所述重組DNA片段在培育耐草甘膦轉基因玉米中的應用也屬于本發明的保護范圍。所述轉基因玉米包括種子、愈傷組織、完整植株和細胞。本發明針對原核生物耐草甘膦基因G2-aroA在植物中表達較低的問題，在保持原氨基酸序列不變的前提下，采用玉米偏好性密碼子對其進行優化，去除影響RNA穩定性的結構(如polyA、重復序列、AT和GC串聯重復、RNA 二級結構、核糖體結合位點等)，增加GC含量。同時在其5’端添加Q序列和Kozak序列序列是衍生于植物病毒衣殼蛋白質基因編碼區的翻譯增強序列，由67bp組成，富集TTAAC序列，在蛋白質合成的翻譯過程中構成核糖體和rRNA結合位點。Kozak序列是促進外源基因在植物細胞內翻譯過程的編碼核糖體結合蛋白質的序列)。啟動子選用組成性啟動子Ubi啟動子。再則，在編碼序列的3’端設計了 2個連續的終止密碼子，以及加入人工合成的PolyA+T-NOS雙終止序列。其中，PolyA具有維持mRNA穩定等作用，T-NOS終止序列確保了翻譯的準確終止。另外，根據植物耐草甘膦的特殊機制，在5’起始密碼子ATG前加入葉綠體導肽CTP，使目的基因表達的蛋白(即G2-aroA蛋白)轉運到葉綠體中，以更好的發揮mG2-aroA基因的抗性效果。通過上述設計，使G2-aroA蛋白在玉米中高效穩定表達。實驗證實，與轉入原始G2-aroA基因的重組DNA片段的玉米植株相比，轉入本發明所提供的含有mG2-aroA的重組DNA片段(序列10)的陽性玉米植株，其G2_aroA蛋白的表達量明顯提高，每克葉片G2-aroA蛋白的表達量中可達15. 057 y g，遠高于原始G2_aroA基因轉基因玉米的3. 735 Ug0同時，與轉入原始G2-aroA基因的重組DNA片段的玉米植株相t匕，轉入本發明所提供的含有mG2-aroA的重組DNA片段(序列10)的陽性玉米植株對草甘膦的耐受性也明顯提高，轉入本發明所提供的含有mG2-aroA的重組DNA片段(序列10)的T6代植株在玉米5葉期噴施800ml/畝農達后，無明顯的藥害，表現正常，后期的生長期內均無藥害反應；而轉入含有G2-aroA基因的重組DNA片段的T6代植株，在800ml/畝農達處理后，藥害非常嚴重，植株均表現黃化、畸形，后期植株生長期內大部分表現雄穗不分化、雌穗不吐絲或者植株矮小。


圖I為載體pUC19-UG2的質粒圖譜。圖2為載體pCAMBIA3300的質粒圖譜。 圖3為載體pS3300的質粒圖譜。圖4為重組表達載體pS3300-UG2的質粒圖譜。
圖5為重組表達載體pS3300-UMG2的質粒圖譜。圖6為重組載體pS3300-UG0的質粒圖譜圖7為T6代G2_aroA轉基因玉米的PCR鑒定圖譜。其中，泳道I為陽性對照；泳道2為DNA Marker (D2000);泳道3為空白對照組；泳道4為未轉基因的玉米植株(陰性對照2);泳道5-15為11株轉入G2-aroA基因的T6代轉基因玉米植株。圖8為T6代mG2-aroA轉基因玉米的PCR鑒定圖譜。其中，泳道I為陽性對照；泳道2為DNA Marker (D2000);泳道3為空白對照組；泳道4為未轉基因的玉米植株(陰性對照2);泳道5-24為20株轉入mG2-aroA基因的T6代轉基因玉米植株。圖9為T6代G2_aroA轉基因玉米植株和T6代mG2_aroA轉基因玉米植株的草甘膦耐性田間鑒定圖。其中，A為mG2-aroA轉基因玉米植株、空載體轉基因植株和未轉基因植株；B為mG2-aroA轉基因玉米植株和G2_aroA轉基因玉米植株。A和B中，I所示一行玉米為mG2-aroA轉基因玉米植株；2所示一行玉米為G2_aroA轉基因玉米植株；3所示一行玉米為空載體轉基因玉米植株；4所示一行玉米為未轉基因的玉米植株。圖10為雙抗夾心ELISA檢測G2_aroA蛋白濃度的標準曲線。圖11為純化后G2_aroA蛋白SDS-PAGE電泳鑒定圖。其中，泳道I為蛋白Marker，自上到下依次為72KD、45KD、32KD、14. 4KD ;泳道2_4均為原核重組表達載體pET-28a-G2_aroA中表達后純化所得的G2-aroA蛋白，上樣量分別為5 ill、10 ill、15 ill。圖12為SDS-PAGE檢測純化后單克隆抗體的純度。其中，泳道I為蛋白Marker ；泳道2為純化后的單克隆抗體，較大的目的條帶為重鏈，較小的目的條帶為輕鏈。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例I、密碼子優化型耐草甘膦基因的獲得本實施例根據G2_aroA基因(中國專利，申請號03826892. 2，授權公告號CN100429311 C)的氨基酸序列(核苷酸序列如序列表中序列I所示)，在保證氨基酸序列不變的前提下，首先采用玉米偏好密碼子對G2-aroA基因進行人工優化改造。盡量避免使用玉米稀有密碼子，并調整了密碼子的使用頻率(表I)，使G2-aroA蛋白的密碼子使用頻率與玉米中的使用頻率接近(表I)。在此基礎上，去除DNA序列中存在的典型的造成植物基因轉錄本不穩定的富含AT序列，并去除了發夾結構，得到的新的核苷酸序列為序列表中序列
2。序列2與G2-aroA基因(序列I)同源性只有84%，而G+C含量由原來的64. 83%降低到62. 07%。序列2所示基因即為密碼子優化型耐草甘膦基因，將其命名為mG2-aroA。密碼子在玉米、G2-aroA基因和mG2-aroA基因中的使用頻率見表I。為方便克隆，發明人在序列2的5’端引入BamH I酶切位點，在3’端引入Kpn I酶切酶切位點，最終序列如序列表 中序列3所示。序列3的第7-1344位即為序列2。序列I、序列2的第1-1335位，以及序列3的第7-1341位均編碼序列，均編碼序列表中序列9所示蛋白，將該蛋白命名為G2-aroA蛋白。表I玉米優選密碼子標準
權利要求
1.重組DNA片段，包括如下1)-3)的元件 1)啟動子； 2)由所述啟動子啟動轉錄的耐草甘膦基因；所述耐草甘膦基因的核苷酸序列為下述a)或 b): a)序列表中序列2； b)與序列表中序列2至少具有98%的同一性，且編碼序列9所不蛋白質； 3)轉錄終止序列。
2.根據權利要求I所述的重組DNA片段，其特征在于所述啟動子為Ubi啟動子。
3.根據權利要求2所述的重組DNA片段，其特征在于所述Ubi啟動子的序列為序列表中序列5，或與序列5至少具有80%的同一性，且具有啟動子功能。
4.根據權利要求1-3中任一所述的重組DNA片段，其特征在于所述轉錄終止序列如序列表中序列8的第216-491位所示，或與序列8的第216-491位至少具有80%的同一性，且具有轉錄終止功能。
5.根據權利要求1-4中任一所述的重組DNA片段，其特征在于所述重組DNA片段還包括OMK序列；所述OMK序列由Q序列和Kozak序列順次連接組成。
6.根據權利要求5所述的重組DNA片段，其特征在于所述OMK序列為序列表中序列6，或與序列6至少具有80%的同一性，且具有增強子功能。
7.根據權利要求1-6中任一所述的重組DNA片段，其特征在于所述重組DNA片段還包括葉綠體導肽序列；所述葉綠體導肽序列為序列表中序列7，或與序列7至少具有80%的同一性，且具有信號肽功能。
8.根據權利要求1-8中任一所述的重組DNA片段，其特征在于所述重組DNA片段由所述Ubi啟動子、所述OMK序列、所述葉綠體導肽序列、所述耐草甘膦基因和所述轉錄終止序列順次連接組成；所述重組DNA片段的序列具體為序列表中序列10。
9.含有權利要求1-8中任一所述重組DNA片段的重組細胞系、轉基因植物或轉基因微生物。
10.權利要求1-8中任一所述的重組DNA片段在培育耐草甘膦轉基因玉米中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種含有耐草甘膦基因的重組DNA片段及其應用。本發明所提供的重組DNA片段包括如下1)-3)的元件1)啟動子；2)由所述啟動子啟動轉錄的耐草甘膦基因；所述耐草甘膦基因的核苷酸序列為下述a)或b)a)序列表中序列2；b)與序列表中序列2至少具有98％的同一性，且編碼序列9所示蛋白質；3)轉錄終止序列。與轉入含有原核生物耐草甘膦基因G2-aroA的重組DNA片段的轉基因玉米相比，轉入本發明所提供的重組DNA片段的轉基因玉米，其G2-aroA蛋白的表達量明顯提高；同時對草甘膦的耐受性也明顯提高。
文檔編號A01H5/00GK102643840SQ20121010719
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月12日 優先權日2012年4月12日
發明者劉素霞, 姜付坤, 李雪峰, 殷亮, 鄧德芝, 韓庚辰 申請人:北京奧瑞金種業股份有限公司