專利名稱：杏黃兜蘭的繁殖方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域,具體地,涉及一種5 蘭屬(Paphiopedilum)杏黃5 蘭(P. armeniacum S. C. Chen et F. Y. Liu)種子繁殖方法。
背景技術：
5 蘭屬(Paphiopedilum)隸屬于蘭科杓蘭亞科(Cypripedioideae),目前總共有79個野生種類記錄在案，其中約1/3產自中國。就種類而言，中國是世界上兜蘭屬植物最為豐富的國家，總種類達到27種(劉仲健等，2009)。兜蘭屬的顯著特征之一即為唇瓣特化成兜狀或拖鞋狀，故又稱“拖鞋蘭”或“仙履蘭”(羅毅波等，2005)。蘭科兜蘭屬植物(Paphiopedilum)以花形奇特，花色艷麗而享譽世界，豐富的花色和盛長的花期而廣受蘭花 愛好者及園藝學家的關注與喜愛，具有巨大的觀賞價值和市場價值。杏黃5 蘭(P.armeniacum S. C. Chen et F. Y. Liu)是產于我國的5 蘭原生種之一，主要生長于云南西部，如碧江、瀘水、保山等地海拔1400-2100米的石灰巖壁積土處或多石而排水良好的北坡上。是兜蘭屬中罕見的黃花種類，其花色純黃，葉子具斑紋而被譽為“金兜”，是兜蘭中最引人注目的種類之一，與硬葉兜蘭(P.micranthum)并稱為“金童玉女”，一直受到人們的廣泛關注。80年代杏黃兜蘭在國際市場上的售價達到上百美元一株，到1992年為止，其已在美國蘭展會上70多次奪得大獎，是兜蘭中著名觀賞種。鑒于此種情況，杏黃兜蘭的野外種群被過度采集，受到嚴重破壞，再加上近年來生境破壞，其瀕危程度加劇，因此利用人工繁育方法提高杏黃兜蘭種苗繁殖率是解決杏黃兜蘭保護及商業化開發的重要技術。目前對于杏黃兜蘭常用的繁育方法是利用種子進行無菌萌發，從而獲得實生苗。然而，杏黃3 蘭的種子在成熟后萌發通常十分困難(Arditti, 1982 ;Rasmussen, 1995)。現有技術未解決杏黃兜蘭種子萌發最佳時期的技術問題，未提供一種杏黃兜蘭高效人工繁殖的方法和技術體系。

發明內容
本發明旨在克服現有技術的上述問題，提供了一種杏黃兜蘭種子繁殖的方法，利用形態解剖方法并結合種子無菌萌發技術，對杏黃兜蘭種子發育過程進行觀察，分析萌發率較高時的種子形態特征，依賴確定杏黃兜蘭種子萌發率最高時的最佳時間，選擇此期間的種子進行播種，從而克服種子萌發困難的技術難題，為建立杏黃兜蘭高效人工繁殖技術體系提供了技術基礎。本發明的上述目的是通過下述的技術方案加以實現的杏黃兜蘭的繁殖方法，包括定植、授粉、確定種子最佳萌發時間并播種，所述定植是將杏黃兜蘭成年植株定植，所述授粉是在杏黃兜蘭開花時將其唇瓣去除，將位于雄蕊上的花粉粒取下，涂抹到雌蕊柱頭上進行人工授粉，所述確定種子最佳萌發時間并播種是在杏黃兜蘭授粉時標記時間，將授粉50天后的杏黃兜蘭種子在顯微鏡下觀察，確定出杏黃兜蘭種子的最佳萌發時 間時進行播種。上述的杏黃兜蘭的繁殖方法，所述定植是將杏黃兜蘭成年植株定植于實驗溫室中，其栽培條件為日溫25°C，夜溫18°C，光照強度300 μ mo I JiT2s'光照時間12h，相對濕度為60%，每10天澆一次水，同時每30天施以自配的含有氮、磷、鉀I : I : I的營養液一次。上述的杏黃兜蘭的繁殖方法，所述確定杏黃兜蘭種子最佳萌發時間是將授粉50天后的杏黃兜蘭種子固定在改良的FAA固定液中，利用GMA混合液包埋聚合，通過切片，在顯微鏡下觀察，當種子胚發育的形態學特征表現為原胚體積增大，幾乎充滿整個胚囊，形成橢球形胚，胚柄由呈直線型排列的2-3個細胞組成時為杏黃兜蘭最佳萌發時間。上述的杏黃兜蘭的繁殖方法，所述改良FAA固定液其配方是38%的甲醛即福爾馬林5ml，冰醋酸5ml，50 %的酒精90ml。具體地，杏黃兜蘭的繁殖方法中，定植是將杏黃兜蘭成年植株定植于實驗溫室中，其栽培條件為日溫25°c，夜溫18°C，光照強度300 μ mo I JiT2iT1,光照時間12h，相對濕度為60%，每10天澆一次水，同時每30天施以自配的含有氮、磷、鉀I : I : I的營養液一次；所述確定杏黃兜蘭種子最佳萌發時間并播種是將授粉50天后的杏黃兜蘭種子固定在配方為38 %的甲醛即福爾馬林5ml，冰醋酸5ml，50 %的酒精90ml的改良的FAA固定液中，利用GMA混合液包埋聚合，通過切片，在顯微鏡下觀察，當種子胚發育的形態學特征表現為原胚體積增大，幾乎充滿整個胚囊，形成橢球形胚，胚柄由呈直線型排列的2-3個細胞組成時也就是授粉后90-110天為杏黃兜蘭最佳萌發時間時播種。


圖I 杏黃兜蘭種子胚發育過程，圖中 a 50DAP, b 70DAP, c 90DAP, d 110DAP, e 130DAP, f 140DAP, g 160DAP, h 180DAP ；em :胚細胞，fs :胚柄；圖2杏黃兜蘭授粉后天數與萌發率的關系。
具體實施例方式下面結合本發明的附圖，通過本發明的具體實施例子進一步來說明本發明的實質性內容,但并不以此來限定本發明。實施例I :確定杏黃兜蘭種子的最佳萌發時間的方法,杏黃兜蘭的繁殖方法I.材料和方法I. I研究材料杏黃覽蘭(P. armeniacum S. C. Chen et F. Y. Liu):分布在云南西部，生于海拔1400-2100米的石灰巖壁積土處或多石而排水良好的草坡上。具細長而橫走的地下根狀莖，直徑2-3_，5-7枚葉，花純黃色，花葶15-28cm，唇瓣深囊狀，近橢圓狀球形或寬橢圓形，花期2 4月，果實成熟期為8-9月。其種植于中國科學院昆明植物所蘭花溫室內。溫室內栽培條件為日溫25°C，夜溫18°C，光照強度300 μ molmpisp—1，光照時間12h，相對濕度為60%。每10天澆一次水，同時每30天施以自配的含有氮、磷、鉀(1:1: I)的營養液一次。
I. 2果莢采集2011年3月-5月期間，對開花的杏黃兜蘭進行授粉，先將其唇瓣去除，用尖頭鑷子將位于雄蕊上的花粉粒取下，涂抹到雌蕊柱頭上，分別于授粉后50天、70天、90天、110天、130天、140天、160天、180天，隨機摘取果莢(每種2_3個)作為實驗材料，且分別記為50DAP (授粉后的天數)、70DAP、90DAP、11ODAP、130DAP、140DAP、160DAP、180DAP。I. 3胚發育過程的形態觀察
從杏黃兜蘭授粉后各個時期的果莢中取部分種子，浸泡于改良的FAA固定液，其配方是38%的甲醛(福爾馬林)5ml，冰醋酸5ml，50%的酒精90ml中24h以上，將種子按以下濃度順序置于50%、70%、80%、90%酒精溶液中各浸泡30min，在100%的無水乙醇溶液中浸泡lh，其后再換一次無水乙醇，繼續浸泡Ih ;之后在GMA(乙二醇甲基丙烯酸酯)混合液中浸透并包埋，該混合液含GMA90毫升，過氧化苯甲酰O. 18克，PEG-400(聚乙二醇-400)，置于60°C溫箱中聚合10h。用LEICARM2126RT轉輪式切片機切片，切片厚度為5 μ m0I. 4無菌播種用肥皂水刷洗果莢，其后用75%酒精溶液浸泡I分鐘，無菌水沖洗3次，用O. 1%升汞溶液處理8分鐘后，無菌水沖洗5次，用滅菌手術刀將果莢小心地劃開，將種子播種于基本培養基為改良的Harvais培養基(見表一)(黃家林等，2000)，再加入2%的葡萄糖，5%的土豆提取物，O. 8%的瓊脂粉及lmg/L的激動素(KT)組成的播種培養基上，于25°C暗中培養。每個時期的果莢播種5瓶。播種80天后，從培養基上隨機取出2個IcmX Icm的瓊脂塊，統計萌發率，用SPSS16.0軟件(SPSS Inc.，Chicago, USA)進行統計分析，并用sigmaplotlO. O (Systat SoftwareInc.，city, USA)軟件作圖。表一改良Harvais培養基組成
培養基組成成分用量Ca(NO3)2 · 4H20 4 00mg/LKH2PO4200mg/L
MgSO4· 7H20200mg/L
KNO3200mg/L
KCllOOmg/L
豐寧檬酸鐵銨25mg/L
MnSO4· 4H202.03mg/L
H3BO30. 5mg/L
ZnSO4 · 7H200. 5mg/L
權利要求
1.杏黃兜蘭的繁殖方法，包括定植、授粉、確定種子最佳萌發時間并播種，所述定植是將杏黃兜蘭成年植株定植，所述授粉是在杏黃兜蘭開花時將其唇瓣去除，將位于雄蕊上的花粉粒取下，涂抹到雌蕊柱頭上進行人工授粉，所述確定種子最佳萌發時間并播種是在杏黃兜蘭授粉時標記時間，將授粉50天后的杏黃兜蘭種子在顯微鏡下觀察，確定出杏黃兜蘭種子處于最佳萌發時間時進行播種。
2.如權利要求I所述的杏黃兜蘭的繁殖方法，其特征在于所述定植是將杏黃兜蘭成年植株定植于實驗溫室中，其栽培條件為日溫25°C，夜溫18°C，光照強度300iimol JiT2S'光照時間12h，相對濕度為60%，每10天澆一次水，同時每30天施以自配的含有氮、磷、鉀1:1:1的營養液一次。
3.如權利要求I所述的杏黃兜蘭的繁殖方法，其特征在于所述確定杏黃兜蘭種子最佳萌發時間是將授粉50天后的杏黃兜蘭種子固定在改良的FAA固定液中，利用GMA混合液包埋聚合，通過切片，在顯微鏡下觀察，當種子胚發育的形態學特征表現為原胚體積增大，幾乎充滿整個胚囊，形成橢球形胚，胚柄由呈直線型排列的2-3個細胞組成時為杏黃兜蘭最佳萌發時間。
4.如權利要求I所述的杏黃兜蘭的繁殖方法，其特征在于所述的改良FAA固定液其配方是38 %的甲醛即福爾馬林5ml，冰醋酸5ml，50 %的酒精90ml。
5.如權利要求I所述的杏黃兜蘭的繁殖方法，其特征在于所述定植是將杏黃兜蘭成年植株定植于實驗溫室中，其栽培條件為日溫25°C，夜溫18°C，光照強度300iimol JiT2S'光照時間12h，相對濕度為60%，每10天澆一次水，同時每30天施以自配的含有氮、磷、鉀1:1: I的營養液一次；所述確定杏黃兜蘭種子最佳萌發時間并播種是將授粉50天后的杏黃兜蘭種子固定在配方為38 %的甲醛即福爾馬林5ml，冰醋酸5ml，50 %的酒精90ml的改良的FAA固定液中，利用GMA混合液包埋聚合，通過切片，在顯微鏡下觀察，當種子胚發育的形態學特征表現為原胚體積增大，幾乎充滿整個胚囊，形成橢球形胚，胚柄由呈直線型排列的2-3個細胞組成時也就是授粉后90-110天為杏黃兜蘭最佳萌發時間時播種。
全文摘要
杏黃兜蘭的繁殖方法，先將杏黃兜蘭成年植株定植，在杏黃兜蘭開花時進行人工授粉，授粉時標記時間，取授粉90天-110天的杏黃兜蘭蒴果種子進行播種。近年，杏黃兜蘭的野外種群被過度采集，受到嚴重破壞，瀕臨滅絕，需要通過人工繁育方法解決其保護及商業化開發的間題。杏黃兜蘭種子成熟后萌發較困難，本發明利用種子形態特征觀察及無菌萌發方法，確定杏黃兜蘭種子在授粉90天后，種子胚細胞形態特征表現為橢球形胚形成，胚柄呈現出由2-3個直線排列的細胞組成的性狀時，其種子萌發率最高，此方法可以確定杏黃兜蘭種子最佳萌發時間，為杏黃兜蘭高效人工繁殖技術體系的建立奠定了技術基礎。
文檔編號A01G1/00GK102630464SQ20121011894
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月23日 優先權日2012年4月23日
發明者嚴寧, 張娟娟, 胡虹 申請人:中國科學院昆明植物研究所