專利名稱：一種梨莖尖組織培養快速繁殖方法
技術領域：
本發明屬于植物細胞工程技術領域，涉及一種梨莖尖組織培養快速繁殖方法。
背景技術：
梨(Pyrus spp.)是世界性的重要落葉果樹，我國梨樹栽培面積與產量僅次于蘋果和柑桔，為第三大果樹，在20多個省(區、市)均有分布。采用傳統育種手段，梨的許多性狀已經得到了改良，但現有的梨品種在遺傳上對來自生物的和非生物的脅迫以及對影響果實品質的生理病害存在著許多弱點。這些問題可通過栽培管理來緩解，但要從根本上解決問題必須依靠選配優異親本的常規育種和分子設計育種的改良途徑。與其他木本果樹一樣， 由于梨的高度雜合性以及童期較長等特點，使常規育種周期較長。隨著轉基因技術的不斷進展，縮短育種周期，定向引入有經濟價值的外源基因已經成為可能。近年來，組織培養技術在果樹快速育苗和培養無病毒苗方面均有廣泛的應用。目前，在梨組織培養方面主要存在著繁殖系數低、生根率低、葉片再生困難等問題。采用莖尖培養可以在短期內大大提高繁殖系數，還可用莖尖培養先期獲得試管梢，再取其葉片作為轉基因的受體材料。莖尖培養的主要目的是脫病毒和快速繁殖。梨樹病毒有20余種，如蘋果褪綠葉斑病毒、蘋果莖溝病毒等，普遍危害梨樹，導致產量和果實品質下降，甚至引起樹體急劇衰退，提早梏死而致絕收。國外雖然有許多關于西洋梨組織培養的文獻資料，但西洋梨與我國主栽的白梨、砂梨不同，他們之間的遺傳背景差異很大，無論是培養條件、對生長調節物質的需求還是植株再生的頻率等均有很大區別，所以對西洋梨的研究結果并不能直接應用到我國的主栽品種中。探索適宜我國特定種類直至主栽梨品種的組培條件，并進一步完善高效、穩定的快繁及再生體系是當前急待解決的關鍵問題，同時也是梨樹遺傳轉化的重要基礎。梨樹莖尖培養主要通過直接分化途徑完成分化，并獲得了完整植株，趙惠祥用‘錦豐’和‘早酥’實生苗的莖尖培養獲得植株。先后有錦豐、早酥、錦香、鴨梨、秋水梨、幸水、豐水、巴梨、秋子和金花等品種培養成功。但是，存在繁殖系數低，曾云英以‘金花’梨為試材增殖倍數只能達到
5.68，張玉嬌以‘黃冠’梨為試材增殖倍數也只能達到5. 1，這種情況下無法進行離體快繁，為了解決以上問題，完善組織培養技術體系和擴大轉化品種和轉化方法，我們以‘翠冠’、‘黃花’和‘早香脆’三個主要栽培品種為試材，通過梨組織培養的研究表明，三個品種在最適宜的培養條件下，增殖率均可達到100%，增值系數最高可以達到12. 8，為梨大規模擴繁提供理論依據，同時建立了梨離體快繁技術體系。

發明內容
本發明所解決的技術問題在于提供一種梨莖尖組織培養快速繁殖方法。本發明通過以下技術方案來解決上述技術問題一種梨莖尖組織培養快速繁殖方法，包括以下步驟I)外植體的準備取帶芽枝條剪成單芽莖段，消毒后去除鱗片，切取裸芽接種于誘導培養基上；所述誘導培養基成分為1/2MS+6-BA 0. 8 I. 2mg/L+IBA 0. 05 0. 3mg/L+GA1. 0 3. 0mg/L+2(T35g/L 蔗糖 +3 10g/L 瓊脂，培養基 pH 值為 5. 8-6. 0 ；2)叢生芽的誘導在誘導培養基培養l(T20d待芽長到0. 5^3cm,切取新梢轉接到新的誘導培養基上，30-40d新芽形成并生長，每3周在相同的培養基上繼代I次，5(T70d獲得大量叢生芽；培養過程中，光照強度1500-20001x，光照15 18h/d，溫度25_28°C ；3)繼代培養采用繼代培養基進行叢生芽繼代培養，每30-40d繼代增殖I次；培養條件為光照強度1500-20001X，光照16h/d，溫度25-28°C ;所述叢生芽繼代培養基為 1/2MS+6-BA1. 5mg/L+IBA 0. 05 0. 3mg/L+2(T35g/L 蔗糖 +3 10g/L 瓊脂，培養基 pH 值為5. 8~6. 0 4)生根培養切取1-1. 5cm生長健壯的新梢轉接到生根培養基上，暗處理5d后再轉光下培養，培養50-60d得到生根苗；培養條件為光照強度1500-20001X，光照16h/d，溫度25-28°C ;所述生根培養基為1/2MS+IBA0. 3 I. 0mg/L+50^70g/L蔗糖+3 10g/L瓊脂，培養基PH值為5. 8-6.0。I)外植體的準備優選將帶芽枝條剪成單芽莖段，用洗衣粉漂洗，再用自來水沖洗30min，而后在超凈工作臺上用75%的酒精消毒20s，再用0. 1%的升汞溶液消毒8_10min，最后用無菌水沖洗4-5次。用解剖刀去除鱗片，切取裸芽接種于誘導培養基上；所述誘導培養基成分為 1/2MS+6-BA I. Omg/L+IBA 0. 2mg/L+GA 2. 0mg/L+30g/L 蔗糖 +6g/L 瓊脂，培養基pH 值為 5. 8-6. O。3)繼代培養優選采用繼代培養基進行叢生芽繼代培養，每30-40d繼代增殖I次；培養條件為光照強度1500-20001X，光照16h/d，溫度25-28°C ;所述叢生芽繼代培養基為1/2MS+6-BA I. 5mg/L+IBA 0. 2mg/L+30g/L 蔗糖 +6g/L 瓊脂，培養基 pH 值為 5. 8-6. 0 ；4)生根培養優選切取1-1. 5cm生長健壯的新梢轉接到生根培養基上，暗處理5d后再轉光下培養，培養50-60d得到生根苗；培養條件為光照強度1500-20001X，光照16h/d，溫度25-28°C;所述生根培養基為1/2MS+IBA 0. 6mg/L+60g/L蔗糖+6g/L瓊脂，培養基PH值為 5. 8-6.0。有益效果本發明應用組織培養的手段，克服梨苗常規育種周期長，扦插繁殖系數低等特點，通過叢生芽的途徑進行梨組織培養能夠獲得大量遺傳性狀穩定的試管苗，保持良好的親本特性，而且取材容易，變異率低、增殖系數高，生根率達90%，大大提高了繁殖速度，且繁殖方法性能穩定，試驗重復性好，試管苗分化良好，投入少，周期短，60天就可以獲得大量的叢生芽。


圖I為‘早香脆’梨組織培養繁殖的試管苗；圖2為‘早香脆’梨組織培養繁殖的試管苗生根狀況。
具體實施例方式實施例I.黃花、早香脆、翠冠梨莖尖組織培養及快繁I.材料的處理
從田間選取生長健壯、無病蟲害的枝條，剪取幼嫩枝條做外植體。外植體用洗衣粉仔細漂洗，再用自來水沖洗30min，備用。2.外植體的消毒在超凈工作臺上將處理好的外植體用75%的酒精滅菌20s，再用0. 1%的升汞溶液滅菌8-10min，最后用無菌水沖洗4-5次。用解剖刀去除鱗片，切取裸芽接種于誘導培養基上，每瓶接種3個外植體。培養室溫度為25°C，光照時間16h/d，光照強度1500-20001x ;期間注意觀察，隨時剔除污染的材料，以免交叉感染。誘導培養基成分為1/2MS+6-BA I. Omg/L+IBAO. 2mg/L+GA 2. 0mg/L+30g/L 蔗糖 +6g/L 瓊脂，培養基 pH 值為 5. 8-6. O。3.叢生芽的誘導采用誘導培養基培養15d左右待芽長到Icm左右，切取新梢轉接到新的誘導培養 基上，30-40d新芽形成并生長，每3周在相同的培養基上繼代I次，60d獲得大量叢生芽。培養過程中，光照強度1500-20001x，光照16h/d，溫度25-28°C。4.繼代培養采用繼代培養基進行繼代培養；培養條件為光照強度1500-20001x，光照 16h/d，溫度 25-28°C。繼代培養基為 1/2MS+6-BA I. 5mg/L+IBA 0. 2mg/L+30g/L蔗糖+6g/L瓊脂，培養基pH值為5. 8-6. O。三個品種的無菌苗按照上述方法每3周繼代I次，共繼代4次。翠冠的增殖率為100%，平均增殖系數為12. 8 ;早香脆增殖率為100%，平均增殖系數為9. 8 ;黃花增殖率為100%，平均增殖系數為7.4 (增殖系數(％)=培養基中> Icm叢芽總數/接種芽總數；增殖率(％)=(增殖芽數接種芽總數)X 100%)。5.生根培養切取1-1. 5cm生長健壯的新梢轉接到生根培養基上，暗處理5d后再轉光下培養，培養50-60d得到生根苗；培養條件為光照強度1500-20001X，光照16h/d，溫度25-28°C。生根培養基為1/2MS+IBA 0. 6mg/L+60g/L蔗糖+6g/L瓊脂，培養基PH值為
5.8~6. O0三個品種的無菌苗在生根培養基中生根率最高，可達到90%，平均根數最高為7. 9(生根率(％)=(生根外植體數/接種外植體數)X 100)。以上實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。
權利要求
1.ー種梨莖尖組織培養快速繁殖方法，其特征在于該方法包括以下步驟 1)外植體的準備取帶芽枝條剪成單芽莖段，消毒后去除鱗片，切取裸芽接種于誘導培養基上；所述誘導培養基成分為1/2MS+6-BA O. 8 I. 2mg/L+IBA O. 05 O. 3mg/L+GA1. 0 3· 0mg/L+2(T35g/L 蔗糖 +3 10g/L 瓊脂，培養基 pH 值為 5. 8-6. O ； 2)叢生芽的誘導在誘導培養基培養l(T20d待芽長到O.5^3cm,切取新梢轉接到新的誘導培養基上，30-40d新芽形成井生長，每3周在相同的培養基上繼代I次，5(T70d獲得大量叢生芽；培養過程中，光照強度1500-20001x，光照15 18h/d，溫度25_28°C ； 3)繼代培養采用繼代培養基進行叢生芽繼代培養，每30-40d繼代増殖I次；培養條件為光照強度1500-20001x，光照16h/d，溫度25-28 °C ;所述叢生芽繼代培養基為1/2MS+6-BA1. 5mg/L+IBA O. 05 O. 3mg/L+2(T35g/L 蔗糖 +3 10g/L 瓊脂，培養基 pH 值為5. 8-6. O ； 4)生根培養切取1-1.5cm生長健壯的新梢轉接到生根培養基上，暗處理5d后再轉光下培養，培養50-60d得到生根苗；培養條件為光照強度1500-20001χ，光照16h/d，溫度25-280C;所述生根培養基為1/2MS+IBA0. 3 L 0mg/L+5(T70g/L蔗糖+3 10g/L瓊脂，培養基PH 值為 5. 8-6. O。
2.根據權利要求I所述的ー種梨莖尖組織培養快速繁殖方法，其特征在于I)外植體的準備將帶芽枝條剪成單芽莖段，用洗衣粉漂洗，再用自來水沖洗30min，而后在超凈工作臺上用75%的酒精消毒20s，再用O. 1%的升汞溶液消毒8-10min，最后用無菌水沖洗4-5次。用解剖刀去除鱗片，切取裸芽接種于誘導培養基上；所述誘導培養基成分為1/2MS+6-BAI. 0mg/L+IBA0. 2mg/L+GA 2. 0mg/L+30g/L 蔗糖 +6g/L 瓊脂，培養基 pH 值為 5. 8-6. O。
3.根據權利要求I所述的ー種梨莖尖組織培養快速繁殖方法，其特征在于3)繼代培養采用繼代培養基進行叢生芽繼代培養，每30-40d繼代増殖I次；培養條件為光照強度1500-20001x，光照16h/d，溫度25_28°C ;所述叢生芽繼代培養基為1/2MS+6-BA I. 5mg/L+IBA O. 2mg/L+30g/L 蔗糖 +6g/L 瓊脂，培養基 pH 值為 5. 8-6. O。
4.根據權利要求I所述的ー種梨莖尖組織培養快速繁殖方法，其特征在于4)生根培養切取1-1. 5cm生長健壯的新梢轉接到生根培養基上，暗處理5d后再轉光下培養，培養50-60d得到生根苗；培養條件為光照強度1500-20001x，光照16h/d，溫度25_28°C ;所述生根培養基為1/2MS+IBA O. 6mg/L+60g/L蔗糖+6g/L瓊脂，培養基PH值為5. 8-6. O。
全文摘要
本發明屬于植物細胞工程技術領域，公開了一種梨莖尖組織培養快速繁殖方法。本發明采用1/2MS為基本培養基，在對外植體消毒之后，依次經過芽的誘導、叢生芽的增殖培養與繼代、以及生根培養，獲得再生植株。本發明的方法操作簡單，取材方便，成本低，可以在短時間內獲得大量遺傳性狀一致的無性系繁殖苗，有效地解決梨自根苗快繁的技術問題，同時也為梨遺傳轉化奠定了基礎，具有重大的實用價值。
文檔編號A01H4/00GK102648698SQ201210162238
公開日2012年8月29日 申請日期2012年5月23日 優先權日2012年5月23日
發明者吳俊 , 張紹鈴, 薛亞男, 陶書田, 齊開杰 申請人:南京農業大學