專利名稱：一種通過發根農桿菌介導提高棗樹對棗瘋病抗性的方法
技術領域：
本發明涉及ー種通過發根農桿菌介導提高棗樹對棗瘋病抗病性的方法。
背景技術：
率瘋病(Jujubewitches’ broom disease, JWB)是由植原體(Phytoplasma)引起的毀滅性檢疫病害。棗瘋病在整個植株上表現為叢枝、黃化和花、葉、根的畸變。病枝癥狀表現為叢生、纖細、節間縮短，叢枝是由于患病后芽的異常萌發和花器返祖所致。棗瘋病發病時，一般從花期開始先在局部枝條上表現癥狀，然后逐步擴展至全株。棗樹發病后很快失去結果能力，大部分3年左右即整株枯死。全國毎年因棗瘋病死樹逾千萬株，年直接經濟損失高達數億元。棗瘋病已成為危及棗產業發展的重大問題，迫切需要解決。
棗瘋病的防治可以采取選育抗病品種、刨除病樹、手術治療、藥物治療、防治傳病 昆蟲、熱處理莖尖組織培養脫毒等多種措施。其中，選育抗病品種是防治棗瘋病最經濟有效的措施。然而，棗花小、人工去雄難、坐果率低且胚敗育現象嚴重，開展傳統的雜交育種困難重重。隨著生物技術的不斷發展，基因工程日益成為現代植物改良育種的有效手段。農桿菌介導法是目前使用最多、機理最清楚、技術最成熟、成功實例最多的ー種遺傳轉化系統，也是植物基因工程中最重要的一種轉化系統。前期研究表明，感染棗瘋病的病樹和病枝中生長素(IAA)含量明顯少于健樹和健枝，細胞分裂素(CK)的含量顯著高于健樹和健枝，提出CK/IAA比值高低與棗瘋病發病程度密切相關，CK/IAA比值小時棗樹表現正常，過大則表現瘋長，人為改變CK/IAA比值可以使棗瘋病癥狀表現出“康復”現象。而發根農桿菌的農桿堿型め·質粒TR-DNA上有生長素合成基因tmsl和iffis么指導生長素IAA的合成。本專利巧妙利用發根農桿菌侵染感染棗瘋病的棗樹組培苗(以下簡稱瘋組培苗)，使得瘋組培苗自身可以更多的產生IAA，從而降低瘋組培苗體內的CK/IAA，最終轉為正常苗。

發明內容
本發明建立了ー種通過發根農桿菌介導提高棗樹對棗瘋病抗性的方法。本發明解決其技術問題所采用的技術方案是以感染瘋組培苗的莖段為材料，用發根農桿菌進行侵染，在再生出的組培苗中篩選轉健組培苗，然后繼續培養脫菌，對轉健組培苗進行分子檢測確定轉化苗，利用微嫁接技術對轉化苗的抗病性進行檢測驗證，最終得到對棗瘋病抗病性顯著提高的棗樹抗性苗。本發明的具體內容，即通過發根農桿菌介導提高棗瘋病抗性的具體方法如下 ⑴發根農桿菌侵染瘋組培苗將瘋組培苗嫩莖剪成長約Icm的莖段，用0D_為
O. 6-1. O的發根農桿菌侵染5-15min，然后轉入共培養基MS+5. 5g/L瓊脂+30g/L蔗糖+200 μ Mこ酰丁香酮(ム5)( !1值5.8)中共培養3-7(1，再轉入培養基1^+5· 5g/L瓊脂+30g/L蔗糖+100mg/L頭孢曲松鈉(CRO) (pH值5. 8)中，在25±2°C，光照/黑暗為14/10h的條件下培養60d，篩選出棗瘋病癥狀消失的轉健苗；
⑵轉健苗的脫菌繼代將轉健苗轉入添加CRO 50-100mg/L的MS+5. 5g/L瓊脂+30g/L蔗糖+0. 2mg/L BA+0. lmg/L IBA (pH值5. 8)培養基中繼續培養，每20d換一次培養基，并逐漸降低CRO的濃度，直到最后轉健苗完全脫除發根農桿菌，獲得脫菌轉健苗；
⑶脫菌轉健苗的分子檢測提取脫菌轉健苗的基因組DNA進行rWC、rolD、tms基因PCR檢測和棗瘋病病原體的檢測，篩選出攜帶發根農桿菌tms基因而不攜帶棗瘋病病原體的發根農桿菌轉化苗；
⑷發根農桿菌轉化苗對棗瘋病的抗性鑒定采用組培反向劈接微嫁接方法，即在超凈工作臺上，將待鑒定轉化苗莖段的下端劈開，插入作為砧木的瘋組培苗中，使砧木和接穗的形成層貼合，嫁接口外部綁縛滅過菌的鋁箔，使之固定，隨后將嫁接苗轉入嫁接培養基上進行培養，嫁接苗培養基為MS+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂(pH值5. 8)，觀察嫁接苗生長和發病情況，不發病的轉化苗說明其抗性得到了提高，即為抗性苗。本發明專利的有益效果是，通過發根農桿菌的侵染，最終獲得了抗病性提高的棗組培苗。方法簡單并且容易操作，可在幾個月內就獲得抗病性提高的棗組培苗，和大田育種需要多年才能獲得抗病性植株相比，試驗不受環境條件的影響，可控性強，省時省力。


圖I冬棗瘋組培苗
圖2冬棗瘋組培苗莖段的再生瘋苗(作為對照)
圖3冬棗瘋組培苗的莖段經過發根農桿菌侵染后再生出的轉健苗 圖4分子檢測后得到的不攜帶棗瘋病病原體的轉化冬棗苗 圖5以冬棗健康苗為接穗、冬棗瘋組培苗為砧木的微嫁接驗證(作為對照)
圖6對照在微嫁接45d后表現瘋癥，叢枝、莖變細弱、葉片變黃圖7以不攜帶棗瘋病病原體的冬棗轉化苗為接穗、冬棗瘋組培苗為砧木，進行微嫁接驗證其抗病性
圖8微嫁接45d后，作為接穗的不攜帶棗瘋病病原體的冬棗轉化苗仍保持健康苗狀態。
具體實施例方式以冬棗瘋組培苗為試材，將其嫩莖剪成長約Icm的莖段，用0D_為O. 6-1. O的發根農桿菌30148侵染5-15min，然后轉入共培養基MS+5. 5g/L瓊脂+30g/L蔗糖+200 μ M乙酰丁香酮(AS)中共培養3-7d，再轉入培養基MS+5. 5g/L瓊脂+30g/L蔗糖+100mg/L頭孢曲松鈉(CRO)中，在25±2°C，光照/黑暗為14/10h的條件下培養60d，篩選出棗瘋病癥狀消失的轉健苗。將轉健苗轉入添加CRO 50-100mg/L的MS+5. 5g/L瓊脂+30g/L蔗糖+O. 2mg/L BA+0. lmg/L IBA (pH值5. 8)培養基中繼續培養，每20d換一次培養基，培養10代使轉健苗完全脫菌后，提取轉健苗的基因組DNA進行rolC、rolD、tms基因的PCR檢測和棗瘋病病原體的檢測。最終篩選出了攜帶發根農桿菌じrWガ、基因而不攜帶棗瘋病病原體的轉化苗，轉化率達到10.6%。然后利用組培微嫁接技術對轉化苗進行棗瘋病抗性的檢測，砧木選取生長健壯的冬棗瘋組培苗，接穗選取長勢良好的轉化苗，并選取健康冬棗的組培苗接穗作為對照。微嫁接培養45d后發現，対照的冬棗健康苗已經表現出明顯的棗瘋病 癥狀，葉片變黃、莖變得細弱、出現叢枝，而轉化苗仍保持健康苗的狀態，即為抗性苗。
權利要求
1. 一種通過發根農桿菌介導提高棗樹對棗瘋病抗性的方法，其特征在于包括以下步驟 (1)發根農桿菌侵染與轉健苗的獲得將感染棗瘋病的棗組培苗嫩莖剪成長約Icm的莖段，用OD6tltl為0. 6-1. 0的發根農桿菌侵染5-15min，然后轉入pH值5. 8的共培養基MS+5. 5g/L瓊脂+30g/L蔗糖+200ii M乙酰丁香酮中共培養3_7d，再轉入pH值5. 8的篩選培養基MS+5. 5g/L瓊脂+30g/L蔗糖+100mg/L頭孢曲松鈉中，在25±2°C，光照/黑暗為14/10h的條件下培養60d，篩選出棗瘋病癥狀消失的轉健苗； (2)轉健苗的脫菌繼代將轉健苗轉入添加頭孢曲松鈉50-100mg/L、pH值5.8的MS+5. 5g/L瓊脂+30g/L蔗糖+0. 2mg/L BA+0. lmg/L IBA培養基中繼續培養，每20d換一次培養基，并逐漸降低頭孢曲松鈉的濃度，直到轉健苗完全脫除發根農桿菌，獲得脫菌轉健苗； (3)脫菌轉健苗的檢測提取脫菌轉健苗的基因組DNA進行rolC、rolD、tms基因的PCR檢測和棗瘋病病原體的檢測，篩選出攜帶發根農桿菌rolC、rolD、tms基因而不攜帶棗瘋病病原體的轉化苗； (4)轉化苗對棗瘋病抗性的鑒定采用組培微嫁接方法，將待鑒定的轉化苗嫁接到瘋組培苗上，嫁接苗在pH值5. 8的MS+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂培養基中進行培養，觀察嫁接苗生長和發病情況，不發病的轉化苗說明其抗性得到了提高，即為抗性苗。
全文摘要
一種通過發根農桿菌介導提高棗樹對棗瘋病抗性的方法，以感染棗瘋病的棗樹組培苗的莖段為材料，用發根農桿菌進行侵染，在再生出的組培苗中篩選轉健組培苗，然后繼續培養脫菌，對轉健組培苗進行分子檢測確定不攜帶棗瘋病病原體的轉化苗，利用微嫁接技術對轉化苗的抗病性進行檢測驗證，最終得到對棗瘋病抗病性顯著提高的棗樹抗性苗。該方法簡單易行，可在幾個月內就獲得對棗瘋病抗性顯著提高的棗組培苗。
文檔編號A01H5/00GK102676577SQ20121016219
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月24日 優先權日2012年5月24日
發明者劉孟軍, 趙錦, 郝征 申請人:河北農業大學