專利名稱：一種梨葉片誘導(dǎo)不定芽再生植株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物細(xì)胞工程領(lǐng)域，涉及一種梨葉片誘導(dǎo)不定芽再生植株的方法。
背景技術(shù)：
梨是薔薇科(Rosaeeae)梨亞科(Maloldeae)梨屬(Pyrus)植物，為喬木落葉果樹，共有20余種。分布在世界各國(guó)的梨可歸于兩個(gè)類型東方梨和西洋梨。東方梨起源于我國(guó)，也稱中國(guó)梨；西洋梨原產(chǎn)于歐、亞，是歐美國(guó)家的主要栽培品種。梨果不僅形美色艷、肉質(zhì)細(xì)軟或酥脆，汁液豐潤(rùn)、香甜爽口，而且具較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，梨果除可鮮食外，還可制作梨脯、梨膏、梨干、釀酒、制醋等，而且還有很高的醫(yī)療價(jià)值，其性寒味甘，具清熱潤(rùn)肺、止咳祛痰之功。另外，梨木質(zhì)地細(xì)膩堅(jiān)韌，花紋美觀，是建筑、制造家具和雕刻、印刷等的優(yōu)良用材，可作為用于家具制作和紡織業(yè)的工業(yè)原料。 梨是栽培歷史悠久的果樹之一，壽命長(zhǎng)、產(chǎn)量高、果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，而且具有止咳化痰、潤(rùn)肺清火、助消化、解瘡毒等醫(yī)療作用。梨同其它農(nóng)作物一樣，在生產(chǎn)中常會(huì)遇到病蟲侵襲，造成果實(shí)大量減產(chǎn)。目前，主要的病蟲害有梨火疫病、黑星病、白粉病、黃葉病、輪紋病等，妨礙了梨的發(fā)展，使梨的產(chǎn)量嚴(yán)重降低。生產(chǎn)上迫切需要抗性較強(qiáng)的砧木和品種。研究減少病蟲害損失成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重點(diǎn)。傳統(tǒng)上病蟲害防治主要采用化學(xué)試劑，化學(xué)試劑造成生態(tài)破壞、環(huán)境污染，并使各種病原產(chǎn)生了抗藥性，現(xiàn)已不能滿足要求。研究培育抗性品種，提高作物自身的抗病性是減輕病蟲危害的一個(gè)新途徑。但是木本果樹童期長(zhǎng)、自交不親和、雜合程度高，而且往往缺乏理想的親本資源，進(jìn)行常規(guī)雜交育種改良品種相當(dāng)困難。基因工程的興起為彌補(bǔ)傳統(tǒng)育種的不足提供了可能性。它是在體外定向地進(jìn)行基因重組和基因改造，通過離體再生實(shí)現(xiàn)基因從一物種向另一物種轉(zhuǎn)移，從而打破物種之間的天然屏障。且當(dāng)期望性狀引入現(xiàn)有品種的同時(shí)，不會(huì)出現(xiàn)基因的大量重組，也避免了童期的干擾。采用生物技術(shù)手段進(jìn)行果樹品種改良應(yīng)用最多的一是抗病基因的遺傳轉(zhuǎn)化，二是染色體組加倍培育多倍體。進(jìn)行這些工作的前提首先是體細(xì)胞不定器官再生已獲得成功。而且轉(zhuǎn)入有價(jià)值的外源基因成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是建立穩(wěn)定、高效的葉片不定梢再生體系。經(jīng)葉片再生植株一直是組培上的難題，葉片分化不定梢的報(bào)道極少。目前，僅在西洋梨和某些砧木上初步建立離體器官再生體系，東方梨再生體系的報(bào)道較少，迄今尚未見利用東方梨葉片再生植株的報(bào)道。但是，在西洋梨上，早在1988年，Laimer等用西洋梨康弗倫斯(Conference)試管苗葉片做實(shí)驗(yàn),在BA和IBA的配合下,部分愈傷組織能夠形成球狀結(jié)構(gòu)，但僅有少量球狀結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化成不定芽。此后，Abu-Qaoudt> Chevreau> Predierit等相繼以幾種梨試管苗葉片為材料并成功誘導(dǎo)出不定芽，但再生率不高。另外，梨的葉片培養(yǎng)與轉(zhuǎn)基因研究范圍較窄(主要集中于西洋梨梨)，轉(zhuǎn)化品種有限，因而，在西洋梨研究的基礎(chǔ)上，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)東方梨的研究。在培養(yǎng)方法、培養(yǎng)基設(shè)計(jì)上要利于不定梢的誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)與植株再生。雖然有部分報(bào)道葉片再生率較高，但葉片再生率普遍較低，仍是梨葉片組織培養(yǎng)急需解決的問題。砂梨作為我國(guó)南方的主要栽培品種不僅資源品種多，分布廣，而且早實(shí)性較強(qiáng)、抗熱、抗火疫病能力強(qiáng)。本發(fā)明旨在研究影響梨葉片不定芽再生的因素，為從梨葉片體細(xì)胞再生不定芽中篩選同質(zhì)多倍體及遺傳轉(zhuǎn)化改良品種奠定基礎(chǔ)。
三

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種梨葉片不定芽再生誘導(dǎo)的方法，直接用試管苗葉片作為外植體，取材簡(jiǎn)單方便。梨葉片不定芽再生誘導(dǎo)的方法，通過如下步驟實(shí)現(xiàn)(I)選取試管苗健康幼嫩的葉片，用無(wú)菌刀片垂直于葉片中脈橫切2 4個(gè)傷 口，葉片背面朝下接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)2(T32天后轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度25±2°C ;所述的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為NN69+TDZ I. 0 3. Omg/L+IBA 0. 2 0. 5mg/L+蔗糖30 50g/L+ 瓊脂 5. 0 6. 5g/L, PH 值為 5. 8 ；(2)待葉片長(zhǎng)出不定芽后，將不定芽轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上，在光照強(qiáng)度1500-20001x,光照iri8h/d，溫度25±2 °C的培養(yǎng)條件促進(jìn)其抽莖生長(zhǎng)，從而獲得莖干粗壯的試管苗；所述的增殖培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA1. 0 2. 0mg/L+IBA0. 2 0. 5mg/L+GA3I. 5 3. Omg/L+ 蔗糖 25 40g/L+ 瓊脂 5. 0 6. 5g/L，培養(yǎng)基 pH 值為 5. 8 ；(3)待試管苗長(zhǎng)到2. 5 3. 5cm將苗接到生根培養(yǎng)基中，暗處理疒IOd后再轉(zhuǎn)光下培養(yǎng)，50-60天后得到生根苗；所述的光下培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度1500-20001X，光照14 18h/d，溫度 25 ±2 °C;生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0. 5 0. 9mg/L+ 蔗糖 50 70g/L+ 瓊脂 5. 0 6. 5g/L，培養(yǎng)基pH值為5.8。步驟(I)優(yōu)選選取試管苗健康幼嫩的葉片，用無(wú)菌刀片垂直于葉片中脈橫切2 4個(gè)傷口，葉片背面朝下接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)2(T32天后轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度25±2°C;所述的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為NN69+TDZ 2. Omg/L+IBA 0. 3mg/L+蔗糖40g/L+瓊脂 6. 0g/L, PH 值為 5.8。步驟(2)優(yōu)選待葉片長(zhǎng)出不定芽后，將不定芽轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上，在光照強(qiáng)度1500-20001x，光照16h/d，溫度25±2°C的培養(yǎng)條件促進(jìn)其抽莖生長(zhǎng)，從而獲得莖干粗壯的試管苗；所述的增殖培養(yǎng)基為l/2MS+6-BAl. 5mg/L+IBA 0. 2mg/L+GA32. 0mg/L+ 蔗糖 30g/L+瓊脂6. Og/L,培養(yǎng)基pH值為5. 8 ;步驟(3)優(yōu)選待試管苗長(zhǎng)到2. 5^3. 5cm將苗接到生根培養(yǎng)基中，暗處理7 IOd后再轉(zhuǎn)光下培養(yǎng)，50-60天后得到生根苗；所述的光下培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度1500-20001X，光照14 18h/d，溫度25±2°C ;所述的生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0. 6mg/L+蔗糖60g/L+瓊脂6g/L，培養(yǎng)基pH值為5.8。有益效果組織培養(yǎng)技術(shù)的成功不僅取決于植物本身的遺傳特性，還需要適宜的培養(yǎng)基種類、激素種類及濃度、以及適宜的培養(yǎng)溫度、光照等條件；不同植物品種對(duì)組織培養(yǎng)條件的要求不同，本發(fā)明是通過多年試驗(yàn)研究，通過對(duì)比MS、1/2MS、NN69三種基本培養(yǎng)基(NN69基本培養(yǎng)基最適宜于梨葉片誘導(dǎo)再生，再生率為66. 67%)、不同激素組合(對(duì)比了 BA、IBA、TDZ、NAA這幾種激素對(duì)葉片再生的影響，其中TDZ與IBA組合對(duì)葉片誘導(dǎo)最佳)、不同蔗糖濃度(設(shè)蔗糖濃度0、30、40、50、60g/L，其中蔗糖濃度為40g/L時(shí)，葉片再生率最高，為33. 0%)及暗培養(yǎng)時(shí)間(暗培養(yǎng)0、7、14、21、28天，其中暗培養(yǎng)21天，葉片再生率最高，可達(dá)31. 7%)對(duì)梨葉片誘導(dǎo)再生的影響，從而優(yōu)化了梨葉片不定芽誘導(dǎo)再生植株的條件和培養(yǎng)基，成功的實(shí)現(xiàn)梨葉片不定芽誘導(dǎo)再生植株。該方法取材方便，操作簡(jiǎn)單，可以有效提高梨組織培養(yǎng)獲得再生植株的效率，快速的建立起穩(wěn)定、高效的葉片再生體系，有效的解決了梨葉片不定芽再生誘導(dǎo)的技術(shù)問題，從而為通過抗病基因的遺傳轉(zhuǎn)化和染色體組加倍培育多倍體這兩種手段達(dá)到改良果樹品種提供前提條件。


圖1A、B為外植體誘導(dǎo)的叢生芽；A 3周左右后少部分葉片切口處開始出現(xiàn)不定芽；B :4周左右大部分葉片切口出現(xiàn)不定芽。圖2為外植體誘導(dǎo)的叢生芽；增殖培養(yǎng)中，不定芽迅速生長(zhǎng)情況。圖3為誘導(dǎo)不定芽生根。A :不定芽生根得到的完整植株；B :暗培養(yǎng)一周左右轉(zhuǎn)光·下培養(yǎng)5周得到粗壯的根。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I(I)選取試管苗健康幼嫩的葉片，在超凈工作臺(tái)上，用無(wú)菌刀片垂直于葉片中脈橫切2 4個(gè)傷口，切口深達(dá)主脈，葉片背面朝下接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，先暗培養(yǎng)25天后轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)，5天后，邊緣向葉背面卷曲呈筒狀，葉片逐漸變?yōu)辄S綠色，25天后在葉脈及其周圍切口上形成少量白色、疏松愈傷組織；置于光下培養(yǎng)后，愈傷組織逐漸變?yōu)闇\綠色，接種30-35天產(chǎn)生不定芽(圖I )，統(tǒng)計(jì)不定芽分化率為66. 67% ；誘導(dǎo)培養(yǎng)基為NN69+TDZ 2. Omg/L+IBA 0. 3mg/L+ 蔗糖 40g/L+ 瓊脂 6g/L，pH 值為5. 8 ;培養(yǎng)溫度25±2°C。(2)待葉片長(zhǎng)出不定芽后，將不定芽轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上，以促進(jìn)其抽莖生長(zhǎng)，從而獲得莖干粗壯的試管苗(圖2);培養(yǎng)條件光照強(qiáng)度1500-20001X，光照16h/d，溫度25±2°C。增殖培養(yǎng)基為l/2MS+6-BAI. 5mg/L+IBA 0. 2mg/L+GA32. Omg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂6g/L，培養(yǎng)基pH值為5. 8 ;(3)待苗長(zhǎng)到2cm左右將苗接到生根培養(yǎng)基中，暗處理5d后再轉(zhuǎn)光下培養(yǎng)，培養(yǎng)50-60d得到生根苗(圖3);培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度1500-20001x，光照16h/d，溫度25±2°C。生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0. 6mg/L+蔗糖60g/L+瓊脂6g/L，培養(yǎng)基pH值為5. 8。
權(quán)利要求
1.梨葉片不定芽再生誘導(dǎo)的方法，其特征在于通過如下步驟實(shí)現(xiàn) (1)選取試管苗健康幼嫩的葉片，用無(wú)菌刀片垂直于葉片中脈橫切2 4個(gè)傷ロ，葉片背面朝下接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)2(Γ32天后轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度25±2°C ;所述的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為NN69+TDZ I. 0 3· Omg/L+IBA O. 2 O. 5mg/L+蔗糖30 50g/L+ 瓊脂 5. 0 6· 5g/L, PH 值為 5. 8 ； (2)待葉片長(zhǎng)出不定芽后，將不定芽轉(zhuǎn)接到増殖培養(yǎng)基上，在光照強(qiáng)度1500-20001X，光照iri8h/d，溫度25±2°C的培養(yǎng)條件促進(jìn)其抽莖生長(zhǎng)，從而獲得莖干粗壯的試管苗；所述的增殖培養(yǎng)基為l/2MS+6-BAl. 0 2· Omg/L+IBAO. 2 O. 5mg/L+GA3l. 5 3. Omg/L+ 蔗糖25 40g/L+瓊脂5. 0 6· 5g/L，培養(yǎng)基pH值為5. 8 ; (3)待試管苗長(zhǎng)到2.5^3. 5cm將苗接到生根培養(yǎng)基中，暗處理7 10d后再轉(zhuǎn)光下培養(yǎng)，50-60天后得到生根苗；所述的光下培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度1500-20001x，光照iri8h/d，溫度 25 ±2 °C;生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA O. 5 O. 9mg/L+ 蔗糖 50 70g/L+ 瓊脂 5. 0 6. 5g/L，培養(yǎng)基PH值為5.8。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的梨葉片不定芽再生誘導(dǎo)的方法，其特征在于步驟(I)選取試管苗健康幼嫩的葉片，用無(wú)菌刀片垂直于葉片中脈橫切2 4個(gè)傷ロ，葉片背面朝下接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)2(Γ32天后轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度25±2°C ;所述的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為NN69+TDZ 2. Omg/L+IBA O. 3mg/L+ 蔗糖 40g/L+ 瓊脂 6. Og/L, PH 值為 5. 8。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的梨葉片不定芽再生誘導(dǎo)的方法，其特征在于步驟(2)待葉片長(zhǎng)出不定芽后，將不定芽轉(zhuǎn)接到増殖培養(yǎng)基上，在光照強(qiáng)度1500-20001X，光照16h/d，溫度25±2°C的培養(yǎng)條件促進(jìn)其抽莖生長(zhǎng)，從而獲得莖干粗壯的試管苗；所述的増殖培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA1. 5mg/L+IBA O. 2mg/L+GA32. Omg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6. Og/L,培養(yǎng)基 pH 值為5· 8ο
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的梨葉片不定芽再生誘導(dǎo)的方法，其特征在于步驟(3)待試管苗長(zhǎng)到2. 5^3. 5cm將苗接到生根培養(yǎng)基中，暗處理7 10d后再轉(zhuǎn)光下培養(yǎng)，50-60天后得到生根苗；所述的光下培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度1500-20001x，光照14 18h/d，溫度25±2°C ;所述的生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA O. 6mg/L+蔗糖60g/L+瓊脂6g/L，培養(yǎng)基pH值為5· 8。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物細(xì)胞工程領(lǐng)域，涉及一種梨葉片誘導(dǎo)不定芽再生植株的方法。采用試管苗幼嫩的葉片作為外植體，在超凈工作臺(tái)上，用無(wú)菌刀片垂直于葉片中脈橫切2～4個(gè)傷口，然后接種在不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)3周左右后轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng)，待其長(zhǎng)出不定芽后轉(zhuǎn)到增殖培養(yǎng)基上，以促進(jìn)芽的生長(zhǎng)；待不定芽長(zhǎng)到2cm左右，將其轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，從而獲得完整植株。本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)單，成本低廉，效果良好，可以快速的建立起穩(wěn)定、高效的葉片再生體系，有效的解決了梨葉片不定芽再生誘導(dǎo)的技術(shù)問題，從而為通過抗病基因的遺傳轉(zhuǎn)化和染色體組加倍培育多倍體這兩種手段達(dá)到改良果樹品種提供前提條件。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102668984SQ20121016421
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月24日
發(fā)明者吳俊 , 張紹鈴, 薛亞男, 陶書田, 齊開杰 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)