專利名稱：基于醋糟和雜粕的一種高效低成本的微生物飼料蛋白的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物飼料添加劑領域，特別是涉及基于纖維質的釀造廢棄物的高效低成本的新型微生物飼料蛋白或微生物飼料添加劑。
背景技術：
目前飼料產業利潤很低，絕大多數是以糧食為原料進行配合，成本難以下降，具有充分提高飼料利用率降低飼料成本的微生物飼料給飼料業和養殖業帶來新的希望。眾所周知，動物胃腸道內存在著大量的微生物，這些微生物群系之間，以及微生物與動物之間，形成了相互依存，相互作用的不可分割的整體——微生態系統。益生菌是這個微生態系統主要活菌組成部分，對動物的生長、發育、消化、吸收、營養和免疫等具有重要意義。化學合成類藥物，特別是低劑量抗生素飼料添加劑的廣泛使用，不僅破壞了動物胃腸道內的微生態平衡，而且產生了耐藥性和藥物殘留等一系列副作用，給人類和動物的健康帶來了嚴重危害。因此，一些國家和地區已經限制或禁止其使用，如歐盟在2006年在飼料添加劑中全面 禁止使用低劑量的抗生素，這就更加促使了抗生素替代品的研究和應用。益生菌，具有綠色安全、無抗藥性、無殘留、無毒副作用等優點，對動物具有防治疾病、促進生長、提高飼料利用率、保健等多方面的益生作用，可以完全或部分替代抗生素。主力益生菌，如乳酸菌、雙歧桿菌、酵母菌、枯草桿菌都是在美國FDA、飼料管理協會及中國農業部公布的益生菌。其中枯草桿菌類，能形成芽孢，將自己保護起來，發芽快，復活率高，最能耐酸、堿、鹽及抗高溫高壓，因而在飼料加工、保存、通過胃酸環境等過程中有較高的穩定性。枯草桿菌類是好氧兼性厭氧，定植腸道后可奪取腸內有限的氧氣，維持腸內厭氧環境，從而促進乳酸菌、雙歧桿菌等的生長，抑制各種有害菌的繁殖。枯草桿菌類生產豐富的酶群，維生素，氨基酸，有機酸，寡糖等物質，提高飼料利用率和總體營養水平。枯草桿菌可也能促進機體免疫器官成熟，使T淋巴細胞和B淋巴細胞增多，提高機體的免疫力，使內源干擾素產生感應同時枯草桿菌可產生70多種包括枯草桿菌素等抗菌物質，能殺死或抑制大部分葡萄球菌，鏈球菌，綠膿桿菌，腸道桿菌，沙門氏菌，變形桿菌等有害菌。枯草桿菌能產生氨基氧化酶及分解硫化氫的酶類等，添加后糞便惡臭大大降低。因此，枯草桿菌是有很大潛力的高成活率的益生菌。作為主要益生之一，乳酸菌在體內可產生各種消化酶，有助于食物消化，也可降解飼料中的某些抗營養因子，提高飼料轉化率。同時又有預防和治療疾病作用，如對維持機體微生態平衡有著重要的作用，增加腸道有益菌和抑制病原菌，降低膽固醇，降血壓，抑制腸癌的發生，治療痢疾。乳酸菌增強機體免疫力，進入動物體內，除產生細菌素以外，還可以刺激宿主產生防御素。作為主要益生菌之一，雙歧桿菌具有保持腸道正常微生物菌群平衡的作用，阻止致病菌、條件致病菌的入侵和定植。雙歧桿菌具有免疫調節和輔助治療疾病的作用，及能合成VB1、VB2、VB6以及VK等多種維生素，同時還能合成多種氨基酸，雙歧桿菌可使仔豬腸道內的蔗糖酶、乳糖酶、三肽酶的活性提高。降低血清膽甾醇水平，控制內毒素血癥，分降解一些致癌物質，又啟動機體免疫功能，具有一定的抗腫瘤作用。酵母作為益生菌，具有改善飼料風味，增加飼料營養成分，促進養分的轉化和吸收，從而促進生長，促進消化道微生態體系健康發展，調節機體免疫功能，提高生產性能和肉產品品質，改善水質，減少有害氣體排放等功能。目前國內外生物飼料分為以下幾類一是早期的菌體蛋白飼料，菌體為死菌體，不是真正的生物飼料。二是基于糧食或常用工業發酵原料的生物發酵飼料，也需要低溫干燥或冷凍干燥保存處理，總體上講成本大，飼用時添加量少，生物活性也不是很明顯！如發明專利(CN1682599A)，(CN1806659A), (CN101190003A), (CN102204632A)。三是基于秸桿、酒糟等廢棄物，用木霉或纖維素酶處理，或益生菌發酵，低溫干燥處理保存，原料也需要滅菌處理，成本大，但活性成分不易保存，益生菌效果不明顯，如發明專利(CN101897381B)，(CN100337555C)。四是以非纖維質廢棄物為發酵原料，進行厭氧發酵，但原料來源有限，成本難以降低，如發明專利(CN101554202A)，(CN100574627C)。五是本發明的生物飼料技術，基于纖維質醋糟雜柏為發酵原料，生產成本及低，原料不需滅菌，產品不需干燥，活性成分 全部保存，上述需氧和厭氧的益生菌效果非常明顯，產品具有很大的競爭力和市場容量，這樣的生物飼料既是飼料蛋白，又是富含益生活菌及功能酶和因子，價廉物美。在以往的研究中，如發明專利(CN1285156A)、(CN101491290A)、(CN101366445A),將鮮白酒糟部分烘干，能耗大，用一種白地霉或擬青霉菌接種降解，但對于木質素效果不明顯，產品沒有益生菌的功效。又如發明專利(CN101919490A) (CN101756009A)及(CN101756044A)中，醋糟沒有經過富含木質素酶和纖維素酶的菌群預處理，僅靠加纖維素酶等，成本高，效果不明顯，而且，需氧益生菌和厭氧益生菌沒有前后分期發酵，導致雙方都發酵不好。發明專利(CN101756012A)雖是有二期發酵，但一期的黑曲酶對木質素和纖維素降解不明顯，二期也是需氧發酵，沒有益生菌的發酵。上述三種發明的產品都要經過低溫干燥處理，能耗大，菌酶保存率低。因此生產成本高，飼用效果不明顯，不利于產業化推廣。

發明內容
本發明的目的在于生產一種基于纖維質醋糟、雜柏的高效極低成本的微生物飼料添加劑，添加量大，可達5-40%，綜合營養豐富，也稱微生物飼料蛋白，成品中益生菌主要有芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌、雙歧桿菌，活菌數60億以上cfu/g，功能酶、營養物質豐富，必需氨基酸勻恒，飼養效果顯著，價廉物美，保存期長，市場容量大，環境友好，社會和經濟效益明顯。本發明所述的基于醋糟的微生物飼料是以醋糟為主要碳源，棉柏為主要氮源兼部分碳源，經食品級霉菌一期發酵預處理，再以芽孢桿菌和酵母菌為發酵菌種同時補料添加部分棉柏進行二期發酵，最后再添加部分豆柏和菜子柏作為氮源兼部分碳源，接種乳酸菌和耐酸雙歧桿菌并充分混勻后，分裝在單向膜厭氧袋中密封保存，即三期發酵獲得成品。本發明所有菌種
霉菌為粗糖脈抱霉(!' !eurospora crassa),好食脈抱霉(J^eurospora si tophi la).中間脈孢霉iNeurospora intermedia)的任意一種或多種。酵母菌為熱帶假絲酵母{Candida tropical is),產 I元假絲酵母{Candida utilis、，啤酒酵母 iSacclmromycoscerevisiae)等的任意一種或多種。雙歧桿菌為兩歧雙歧桿菌{Bifidobacteriumbifidum)等。乳酸菌為植物乳桿菌{Lactobacillus pi ant arum),保加利亞乳桿菌{Lac tobaciIlus bulgaricus ),嗜酸乳桿菌 iLac tobaciIlus acidophiIus ),乳酸乳桿菌{LactobaciIlus Jacfi1S),干酪乳桿菌{Lactobacillus casei)等的任意一種或多種。芽抱桿菌為地衣芽抱桿菌CfeciJJy1S)、枯草芽抱桿菌CfeciJJy1S subtilis、、
納豆桿菌(feci77m的任意一種或多種。上述菌種為普通常規的商品化菌株，可在 中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)或市場上購買到。本發明產品的具體生產過程如下
I第一期生物預處理發酵
(I)脈孢霉種子培養和生產培養基。斜面培養基和平板培養基馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂20 g，定容IL中，pH5.0，110°C滅菌 30min。接種 30°C培養 4_10 天。種子液體培養基=KH2PO4 2g,MgSO4 0. 3g，CaCl2 0. 3g，蛋白胨5g，酵母浸膏3 g，麥芽汁 3g, FeSO4 7H20 0. 005g, ZnSO4 0. 0014g, MnSO4. 4H20 0. 0016g, CoCl2O. 002 g，定溶于I L中，pH 5.0。500 ml三角瓶中加100 ml培養基，110°C滅菌30min。固態發酵生產種子培養基和生產培養基按質量計，40-100目粉碎后的濕醋糟占培養基的10-90%，棉柏占5-40%，硝酸氨、硫酸氨或氯化氨占0. 1-3%，尿素占0. 1-3%，碳酸鈣占0. 1-5%，磷酸二氫鉀占0. 1_3%，硫酸鎂、硝酸鎂、或氯化鎂占0. 01-1%，培養基最終含水量為 53-65%。(2)培養方法
將脈孢菌在斜面培養基上劃單菌落復壯，再挑選強壯的單菌落，各接種在新的脈孢菌斜面培養基25-38°C生長，斜面培養基菌種中的孢子用無菌水洗下接種于搖瓶培養基中，裝液量 100-250ml /L 三角瓶，150-220 r/min，25-38°C，培養 24_48h，再各以 1-5% (V/V)接種量，混合轉接到200L的種子罐中，于25-38°C，150-220 r /min培養24_48h，活菌總數為IXlO7 cfu/ml以上，再以1-10%接種量(重量)轉接到上述固態發酵培養基，充分攪拌后，25-380C，發酵24-72h，作為固態發酵生產種子，以1_15%接種量(重量)接種到上述固態發酵培養基，充分攪拌后，25-38°C，發酵24-72h，完成一期預處理發酵。進入連續生產階段，一期固態發酵接種生產種子到上次發酵的預處理的固態培養基菌劑，按1-20%接種量接種。第二期發酵 (I)芽孢桿菌培養基
芽孢桿菌斜面和平板菌種培養基蛋白胨10g，牛肉膏粉5g，氯化鈉5g，瓊脂15g，葡萄H 20 g，蒸餾水 1000ml，最終 pH7. 0±0. 2。110_121°C滅菌 20_30min.
芽孢桿菌搖瓶種子培養基和種子罐培養基牛肉膏5. Og/L，蛋白胨20. Og/L，葡萄糖5. Og/L, FeCl2 6H20 0. 07g/L, MnCl2 7H20 0. 01g/L, MgSO4 7H20 0. 15g/L, pH 6. 5-7. 0，110-121°C 滅菌 20-30min。(2)酵母菌培養基
酵母菌斜面培養基和平板菌種培養基(100 ml):葡萄糖2 g、酵母浸出物I g、蛋白胨2g、瓊脂2 g，pH值約6. O。搖瓶種子培養基和種子罐培養基成分同斜面培養基，不加瓊脂。(3) 二期發酵培養基由一期發酵預處理的固態菌劑再加10-30%棉柏組成，含水量為45-55%。首次啟動二期發酵要制作混合酵母菌和混合芽孢桿菌液體種子液，再固態發酵產生固態種子，以1-12%接種量接到一期發酵后的固態菌劑。(4)培養方法
芽孢桿菌液體菌種培養無菌條件下分別將4 °C保存的芽孢桿菌菌種地衣芽孢桿菌{Bacillus)、枯草芽抱桿菌{Bacillus 仰況iJis)、納豆桿菌{Bacillus
natto)。各接一環至斜面培養基中，30-37 °C培養16-36 h復蘇菌種。再在平板上劃單菌落，挑取健壯種子，分別接種到上述芽孢桿菌搖瓶種子培養基，裝液量100-300ml /L三角瓶，150-240 r/min，28-38°C，培養16-24h，再以1_10%的接種量混合接種到上述200L種子罐培養基擴大培養，150-240r/min，通氣量為20_50L/min，培養16_24h后制得復合芽孢桿菌液體種子，活菌總數為2X IO7 cfu/ml以上。、酵母菌液體菌種培養
無菌條件下分別將4 °C保存的酵母菌菌種啤酒酵母i^etccharomycGS cerevisiae),熱帶假絲酵母tropica/is),產朊假絲酵母utilis、。分別接一環至斜面培養基中，28-38 °C培養24-48 h復蘇菌種。再挑單菌落各在平板上劃單菌落，挑取健壯種子，分別接種到上述酵母菌搖瓶種子培養基，裝液量100-300ml /L三角瓶，150-240 r/min，28-38°C，培養24_48h，再以1_10%的接種量混合接種到上述200L種子罐培養基擴大培養，150-240r/min,通氣量為20_50L/min，培養24_48h后制得復合酵母菌液體種子，活菌總數為2 X IO7 cfu/ml以上。二期固態發酵
上述混合芽孢桿菌液體種子以1-10%接種量，混合酵母菌液體菌種以1-10%接種量，都接種到二期發酵培養基中，充分攪拌，28-38°C通氣發酵12-72h，得到第一批二期固態發酵完成后的半成品。進入連續生產階段，種子為上次二期發酵的剩余固態菌劑，按1-20%接種量，接種到二期發酵培養基中，這樣循環接種利用。3第三期發酵 (I)乳酸菌培養基
MRS斜面培養基(g/L):蛋白胨10，酵母粉5，牛肉膏5，葡萄糖20，檸檬酸二銨2，吐溫80 I. 0 ml,乙酸鈉 25，K2HPO4 2，MgSO4 7 H2O 0. 58，MnSO4 4H20 0. 25，瓊月旨 20，pH 7. O。搖瓶和種子罐乳酸菌種子培養基大豆低聚糖2. 25%、葡萄糖2. 00%、蛋白胨I. 25%、酵母粉I. 25%、番茄汁6. 50%、吐溫80. 10%、磷酸氫二鉀0. 20%。pH 6. 5，IL的三角瓶裝液量200 ml。以上培養基配好后均在115_120°C條件下高壓滅菌20_30min。(2)雙歧桿菌的培養基
MRS斜面培養基(g/L):蛋白胨10，酵母粉5，牛肉膏5，葡萄糖20，檸檬酸二銨2，吐溫80 I. 0 ml,乙酸鈉 25，K2HPO4 2，MgSO4 7 H2O 0. 58，MnSO4 4H20 0. 25，瓊月旨 20，pH 7. O。厭氧瓶和種子罐雙歧桿菌增殖培養基蛋白胨5. 0g，牛肉膏5. Og,胰蛋白胨10. 0g，酵母浸出粉5. 0g，葡萄糖10. 0g，吐溫-80 I. 0ml, K2HPO4 2. 0g，乙酸鈉5. 0g，檸檬酸氫二銨 2. 0g, ZnSO4 7H20 0. 25g，MgSO4 7H20 0. lg，聚果糖 5g 和碳酸鈣 Ig 番茄汁 65ml。加蒸懼水至1000ml,調pH值為6. 5。以上培養基配好后均在115_120°C條件下高壓滅菌15_30min。
(3)三期發酵培養基
在二期固態發酵菌劑上，加5-30%菜子柏和5-30%豆柏，充分混勻，組成三期發酵培養基，含水量為30-35%。首次啟動三期發酵要制作乳酸菌和雙歧桿菌液體種子液，再厭氧固態發酵產生固態種子，以1-15%接種量接到三期發酵培養基進行三期發酵。(4)培養方法 乳酸菌種子培養
將植物乳桿菌iLactobacillus plantarum),保加利亞乳桿菌{Lactobacillusbulgari cus ),嗜酸乳桿菌 iLac tobaci Ilus aci dophi Ius ),乳酸乳桿菌 iLac tobaci Ilushcds),干酪乳桿菌{Lactobacillus casei)等在MRS斜面培養基上劃線活化,在33_38°C培養24-72h進行復壯，并形成單菌落，再各挑取單菌落，接種到乳酸菌種子培養基，35-38°C靜置培養24-72h，通入氮氣使溶氧維持為0，定時取樣，測定生物量。再按1_10%接種量接種到種子罐乳酸菌種子培養基靜置培養24-60h，通入氮氣使溶氧維持為0，定時取樣，測定生物量，活菌總數為5X IO7 cfu/ml以上。 雙歧桿菌種子培養
首先是菌種活化，取保存的菌種，在厭氧操作臺上，在裝有MRS固體斜面培養基上劃線復壯，置于35-38 1厭氧培養24 _72h，挑選強壯單菌落，接入裝有10 ml液體MRS培養基的充滿氮氣的厭氧管中，置于35-38°C厭氧培養24-72 h。再按0. 1_1%接種量，接到IL厭氧瓶雙歧桿菌增殖培養基中置于35-38°C厭氧培養24-72h，然后再按1_10%接種量接到種子罐雙歧桿菌增殖培養基中，進行35-38 1厭氧培養，活菌總數為5X IO7 cfu/ml以上。第三期固態發酵
在二期固態發酵菌劑上，加5-30%菜子柏和5-30%豆柏組成三期發酵培養基，含水量為30-35%,首次啟動三期發酵要制作混合乳酸菌和雙歧桿菌液體種子液，混合乳酸菌種子液和雙歧桿菌種子液按I: (1-4)比例，活菌總數為5X107 cfu/ml以上，以1-15%接種量接種到三期發酵培養基上，充分攪拌后，盡快裝入單向膜厭氧袋，常溫下保存，即進行三期厭氧發酵，含水量30-35%，產品保質期可達I到2年，保存二到三個月活菌數達到高峰，可達200億cfu/g固體。進入連續發酵階段，三期發酵一個月后，以此成品為種子，按1-20%接種量，接到上述三期發酵培養基中，攪拌充分后，裝入單向膜厭氧袋，常溫下保存，即進行三期厭氧發酵。產品保質期可達I到3年，保存二個月活菌數達到高峰，可達200億cfu/g。本發明固體原料價格低廉，不需高溫滅菌，不需要購買纖維素酶制劑來降解纖維質原料，成品不需要干燥處理，保質期一年以上，不需要復雜的設備，生產成本極低，所以可以作為飼料組份，添加量達5-40%。由于成品不需要干燥處理，活菌數極高，酶量豐富，雜菌極少，飼養效果明顯大幅度提高畜禽飼料利用率，提高產量，改善腸道環境，提高免疫力和抵抗力，代替抗生素，改善動物產品品質。本發明化廢為寶，同時消除欄舍惡臭，因而具有明顯的生態和社會效益。
具體實施例方式下述實施例中所用菌種僅為舉例說明，不是對本發明的限制，本發明保護范圍內的菌種均都實現發明目的。
實施例I
第一期生物預處理發酵 (I)脈孢霉種子培養和生產培養基。斜面培養基和平板培養基馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂20 g，定容I L中，pH5.0，110°C滅菌 30min。接種 30°C，培養 7_10 天。種子液體培養基=KH2PO4 2g，MgSO4 0. 3g，CaCl2 0. 3g，蛋白胨5g，酵母浸膏3 g，麥芽汁 3g, FeSO4 7H20 0. 005g, ZnSO4 0. 0014g, MnSO4. 4H20 0. 0016g, CoCl2O. 002 g，定容于I L中，pH 5.0。500 ml三角瓶中加100 ml培養基，110°C滅 菌30min。固態發酵生產種子培養基和生產培養基粉碎后的濕醋糟76%棉柏18%，硝酸氨2%，尿素1%，碳酸鈣2%，磷酸二氫鉀1%，硫酸鎂0. 1%，培養基最終含水量為58%。(2)培養方法
將粗糖脈抱霉(Neurospora crassa CGMCC3. 1600),好食脈抱霉(Neurosporasitophila, CGMCC3. 1618).中間脈抱霉(Neurospora intermedia, CGMCC 3.591)各在斜面培養基上劃單菌落復壯，再各挑選強壯的單菌落，接種在新的脈孢菌斜面培養基30°C生長，斜面培養基菌種中的孢子用無菌水洗下接種于搖瓶培養基中，裝液量200ml /IL三角瓶，180 r/min, 30°C，條件下培養24h，再以5%接種量，混合轉接到200L的種子罐中，于30°C，180 r /m in培養24h，活菌總數為5X 108cfu/ml以上，再以10%接種量轉接到上述固態發酵培養基，充分攪拌后，30°C，發酵48h，作為固態發酵生產種子，以10%接種量接種到上述固態發酵培養基，充分攪拌后，30°C，發酵48h，完成一期預處發酵。進入連續生產階段，一期發酵接種生產種子為上次發酵的預處理的固態培養菌制，按10%接種量接種。實施例2 第二期發酵
(I)芽孢桿菌培養基
芽孢桿菌斜面和平板菌種培養基蛋白胨10g，牛肉膏粉5g，氯化鈉5g，瓊脂15g，葡萄H 20 g，蒸餾水 1000ml，最終 pH7.0±0.2。110°C滅菌 30min ;
芽孢桿菌搖瓶種子培養基和種子罐培養基牛肉膏5. Og/L,蛋白胨20. 0g/L,葡萄糖
5.0g/L, FeCl2 6H20 0. 07g/L, MnCl2 7H20 0. 01g/L, MgSO4 7H20 0. 15g/L, pH 7. 0，110°C滅菌30min。(2)酵母菌培養基
酵母菌斜面培養基和平板菌種培養基(100 ml):葡萄糖2 g、酵母浸出物I g、蛋白胨2
g、瓊脂2 g，pH值約6. O。搖瓶種子培養基和種子罐培養基成分同斜面培養基，不加瓊脂。(3) 二期發酵培養基由一期發酵預處理的固態菌劑再加20%棉柏組成，含水量為49%。首次啟動二期發酵要制作酵母菌和芽孢桿菌液體種子液，再固態發酵產生固態種子，以10%接種量接到二期發酵培養基中。(4)培養方法
芽孢桿菌液體菌種培養無菌條件下分別將4 1保存的芽孢桿菌菌種，即地衣芽孢桿舊{Bacillus Ii cheni formi s, CGMCC I. 813)、枯草芽抱桿菌subtil is, CGMCCI. 884)、納豆桿菌CGMCC I. 1086)各接一環至斜面培養基中，37 °C培養36 h復蘇菌種。再在平板上劃單菌落，挑取健壯種子，分別接種到上述芽孢桿菌搖瓶種子培養基，裝液量200ml /IL三角瓶，220 r/min, 30°C，培養16h，再各以2%的接種量接種到上述200L種子罐培養基擴大培養，220r/min,通氣量為40L/min，培養24h后制得混合芽孢桿菌液體種子。酵母菌液體菌種培養
無菌條件下分別將4 °C保存的酵母菌菌種啤酒酵母cerevisiae,CGMCC 2. 1527)，熱帶假絲酵母{Candida tropicalis, CGMCC 2. 637)，產朊假絲酵母{Candida util is, CGMCC 2. 1180)各接一環至斜面培養基中，30 °C培養24 h復蘇菌種。再分別在平板上劃單菌落，挑取健壯種子，分別接種到上述酵母菌搖瓶種子培養基，裝液量200ml /IL三角瓶，220 r/min, 30°C，培養24h，再各以2%的接種量接種到上述200L種子罐培養基擴大培養，220r/min,通氣量為40L/min，培養24h后制得混合酵母菌液體種子。
二期固態發酵
上述混合芽孢桿菌液體種子以5%接種量，混合酵母菌液體菌種以2%接種量，接種到二期發酵培養基中，充分攪拌，30°C通氣發酵48h，得到第一批二期固態發酵完成后的半成品。進入連續生產階段，固態發酵種子為上次二期發酵的剩余固態菌劑，按10%接種量，接種到二期發酵培養基中，這樣循環接種利用。實施例3 第三期發酵
(I)乳酸菌培養基
MRS斜面培養基(g/L):蛋白胨10，酵母粉5，牛肉膏5，葡萄糖20，檸檬酸二銨2，吐溫80 I. 0 ml,乙酸鈉 25，K2HPO4 2，MgSO4 7 H2O 0. 58，MnSO4 4H20 0. 25，瓊月旨 20，pH 7. O。搖瓶和種子罐乳酸菌種子培養基(g/L):大豆低聚糖2. 25%、葡萄糖2. 00%、蛋白胨
I.25%、酵母粉I. 25%、番茄汁6. 50%、吐溫80. 10%、磷酸氫二鉀0. 20%。pH 6. 5，IL的三角瓶裝液量200 ml。以上培養基配好后均在115°C條件下高壓滅菌30min。(2)雙歧桿菌的培養基
MRS斜面培養基(g/L):蛋白胨10，酵母粉5，牛肉膏5，葡萄糖20，檸檬酸二銨2，吐溫80 I. 0 ml,乙酸鈉 25，K2HPO4 2，MgSO4 7 H2O 0. 58，MnSO4 4H20 0. 25，瓊月旨 20，pH 7. O。厭氧瓶和種子罐雙歧桿菌增殖培養基蛋白胨5. 0g，牛肉膏5. Og,胰蛋白胨10. 0g，酵母浸出粉5. 0g，葡萄糖10. Og,吐溫-80 I. 0ml, K2HPO4 2. Og,乙酸鈉5. 0g，檸檬酸氫二銨 2. 0g, ZnSO4 7H20 0. 25g，MgSO4 7H20 0. lg，聚果糖 5g 和碳酸鈣 Ig 番茄汁 65ml，加蒸懼水至1000ml,調pH值為6. 5。以上培養基配好后均在115°C條件下高壓滅菌30min。(3)三期發酵培養基
在二期固態發酵菌劑上，加20%菜子柏和20%豆柏，充分混勻，組成三期發酵培養基，含水量為32%。首次啟動三期發酵要制作乳酸菌和雙歧桿菌液體種子液，再厭氧固態發酵產生固態種子，以10%接種量接到三期發酵培養基中進行三期發酵。(4)培養方法 乳酸菌種子培養將植物乳桿菌QLactobaci I Ius plan tarum, CGMCC I. 557),保加利亞乳桿菌{Lac tobaci Ilus bulgari cus, CGMCC I. 1482),嗜酸乳桿菌acidophilus,CGMCC I. 2467)，乳酸乳桿菌lactis, CGMCC I. 2467)，干酪乳桿菌{Lactobacillus casei, CGMCC I. 62)等各在MRS斜面培養基上劃線活化，在37°C培養28h進行復壯，并形成單菌落，再各挑取單菌落，接種到乳酸菌種子培養基，37°C靜置培養24h，通入氮氣使溶氧維持為O，定時取樣，測定生物量。再各按2%接種量接種到種子罐乳酸菌種子培養基靜置培養48h，通入氮氣使溶氧維持為O，定時取樣，測定生物量。袁 iBifidobacterium bifidum, CQKC I. 2477)種子培養
首先是菌種活化，取保存的菌種，在厭氧操作臺上，在裝有MRS固體斜面培養基上劃線復壯，置于37 1厭氧培養48h，挑選強壯單菌落，接入裝有10 ml液體MRS培養基的充滿氮氣的厭氧管中，置于37 1厭氧培養24 h。再按1%接種量，接到IL厭氧瓶雙歧桿菌增殖培養基中置于37 1厭氧培養48h，然后再按2%接種量接到種子罐雙歧桿菌增殖培養基中，進行37 °C厭氧培養。雙歧桿菌利用此培養基在37°C厭氧培養20h，活菌數可達I X IO10Cfu/ ml o第三期固態發酵
在二期固態發酵菌劑上，加20%菜子柏和20%豆柏組成，配成三期發酵培養基，含水量為32%，首次啟動三期發酵要制作混合乳酸菌和雙歧桿菌液體種子液，混合乳酸菌種子液和雙歧桿菌種子液按1:2比例以6%接種到三期發酵培養基上，充分攪拌后，盡快裝入單向膜厭氧袋，常溫下保存，即進行三期厭氧發酵，含水量32%，產品保質期可達2年，保存二個月活菌數達到高峰，可達200億cfu/g固體。進入連續生產階段，三期發酵一個月后，以此成品為種子，按10%接種量，接到上述三期發酵培養基中，攪拌充分后，裝入單向膜厭氧袋，常溫下保存，即進行三期厭氧發酵，進行連續生產，產品保質期可達2年，保存二個月活菌數達到高峰，可達200億cfu/g，產品檢測結果如表I。上述三期發酵，實際上醋糟約為40%，棉柏、菜籽柏、豆柏各約為20%，因為棉柏精氨酸含量高達3. 6%-3. 8%，顯著高于豆柏，是菜籽柏的2倍，而賴氨酸含量僅為I. 3%-1. 5%，只有豆柏的50%，利用率低，賴氨酸是棉柏的第一限制性氨基酸；蛋氨酸含量僅為0. 4 %，只有菜籽柏的50 %。所以本發明的功能飼料蛋白必需氨基酸相對均衡，是一種優質的功能性飼料蛋白。表I.三期發酵成品檢測結果
檢測項目I干基(％) I標準 —
粗蛋白質(％)_28.9>15
粗脂肪(g/kg)25. 11 > 15
粗纖維_^_5_^9_
棉酚0.0001 < 0.03
異硫氰酸酯0.012 < 0.075
惡唑烷硫酮_ 0.0051 '
粗灰分(%)9. 7<10
鈣(%)0.80.4-0.8
水溶性氯化物(%) 0. 40. 3-0. 8
霉菌總數(cfu/g) 4. 17X10^ < 4. 5X104 沙門氏菌(cfu/25g)I不得檢出
權利要求
1.一種基于醋糟的微生物飼料，其特征是以醋糟為主要碳源，棉柏為主要氮源兼部分碳源，經食品級霉菌一期發酵預處理，再以芽孢桿菌和酵母菌為發酵菌種同時補料添加部分棉柏進行二期發酵，最后再添加部分豆柏和菜子柏作為氮源兼部分碳源，接種乳酸菌和耐酸雙歧桿菌并充分混勻后，分裝在單向膜厭氧袋中密封保存，即三期發酵獲得成品。
2.根據權利要求I所述的微生物飼料，其特征是所述預處理中的發酵培養基配方為醋糟10-90% 棉柏5-40%，硝酸氨、硫酸氨或氯化氨占0. 1-3%，尿素占0. 1-3%，碳酸鈣占0. 1-5%，磷酸二氫鉀占0. 1_3%，硫酸鎂、硝酸鎂、或氯化鎂占0. 01-1%，培養基含水量為53-70% ;首次啟動一期發酵要制作液體種子液，活菌總數為IXlO7 cfu/ml以上，以1-10%(重量)接種量接到一期發酵培養基中，再固態發酵產生固態種子，以1-12% (重量)接種量接到一期發酵后的固態菌劑，進行24-72h的一期發酵，進入連續生產階段，接種種子為上次預處理的固態培養基，按1-20%接種量接種。
3.根據權利要求I所述的微生物飼料，其特征是所述二期發酵培養基由一期發酵預處理的固態菌劑再加5-30%棉柏組成，含水量為45-55% ;首次啟動二期發酵要制作酵母菌和芽孢桿菌液體種子液，酵母菌和芽孢桿菌比例為(I 1)~(1 :4)，活菌總數為2X107 cfu/ml以上，以1-10% (重量)接種量接到部分二期發酵培養基中，再固態發酵產生固態種子，以1-12%接種量接到另外的二期發酵培養基中，進行12-72h 二期發酵；進入連續生產階段，種子為上次二期發酵的剩余固態菌劑，按1-20%接種量，接種到二期發酵培養基上，這樣循環利用。
4.根據權利要求I所述的微生物飼料，其特征是所述三期發酵培養基由二期發酵的固態菌劑再加5-30%菜子柏和5-30%豆柏組成，三期發酵培養基含水量為30-35%，首次啟動三期發酵要制作乳酸菌和雙歧桿菌液體種子液，乳酸菌和雙歧桿菌活菌數之比為(I 1) (I :4)，乳酸菌和雙歧桿菌液體種子液中的活菌總數為5 X IO7 cfu/ml以上，以1-15%(重量)接種量接到三期發酵培養基中，攪拌充分后，裝入單向膜厭氧袋，常溫下保存，即進行三期厭氧發酵；發酵一個月后，以此成品為種子，按1-20%接種量，接到上述三期發酵培養基中，攪拌充分后，裝入單向膜厭氧袋，常溫下保存，即進行三期厭氧發酵，進入連續生產階段。
5.根據權利要求2所述的微生物飼料，其特征是所述濕醋糟在潮濕狀態下經過粉碎，大約20到100目左右。
6.根據權利要求I一 4之一所述的微生物飼料，其特征是所述霉菌為粗糙脈孢霉(JVeurospora crassa),好食脈抱霉 i^eurospora,中間脈抱霉{Neurosporaintermedia)的任意一種或多種；酵母菌為熱帶假絲酵母{Candida tropicalis) ,f11月元假絲酵母0 WiJi1S),啤酒酵母(feccAarOffiiFce1S cerevisiae)的任意一種或多種；雙歧桿菌為兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum);乳酸菌為植物乳桿菌{Lactobacillus ter應)，保加利亞乳桿菌(Lacto辦buIgaricus^),嗜酸乳桿菌{Lactobacillus acidophilus、,乳酸乳桿菌{Lactobacillus I act is),干酪乳桿菌{Lac tobaciIlus casei)的任意一種或多種, 芽孢桿菌為地衣芽孢桿菌W1S)、枯草芽抱桿菌{Bacillus 仰況iJis)、納豆桿菌{Bacillus的任意一種或多種。
全文摘要
本發明涉及利用醋糟、雜粕經益生菌三期發酵，生產一種高效低成本的微生物飼料蛋白。是以醋糟為主要碳源，棉粕為主要氮源兼部分碳源，經食品級霉菌一期發酵預處理，再以芽孢桿菌和酵母菌為發酵菌種同時補料添加部分棉粕進行二期發酵，最后再添加部分豆粕和菜子粕作為氮源兼部分碳源，接種乳酸菌和耐酸雙歧桿菌并充分混勻后，分裝在單向膜厭氧袋中密封保存，即三期發酵獲得成品。本發明生產成本極低，所以可以作為飼料組份，添加量達5-40%。由于成品不需要干燥處理，活菌數極高，酶量豐富，雜菌極少，飼養效果明顯大幅度提高畜禽飼料利用率，提高產量，改善腸道環境，提高免疫力和抵抗力，代替抗生素，改善動物產品品質。
文檔編號A23K1/06GK102696860SQ20121017674
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月1日 優先權日2012年6月1日
發明者倪忠, 崔鳳杰, 崔恒林, 朱道辰, 李萍萍, 楊勝利, 王浩森, 謝永明, 陳華友, 齊向輝 申請人:江蘇大學