專利名稱：一種馬檳榔愈傷組織的誘導及再生方法
技術領域：
〔0001〕 本發明涉及一種植物組織的培養方法，具體涉及一種馬檳榔愈傷組織的誘導及再 生方法。
背景技術：
〔0002〕 馬檳榔((^.爪狀&丨匕丨)，系山柑科((^卯犯^也⑶冊)，山柑屬植物；是一種多年生常 綠木質藤本、攀援灌木，長達數米至數十米；僅分布于我國熱帶亞熱帶地區，如云南、廣西和 貴州等省區的高海拔“(^-化^^)!!!)地區；是一種珍稀瀕危野生果樹。
〔0003〕 馬檳榔種子可入藥，其性苦、甘、寒，可催產、避孕；可清熱解毒、治咽喉腫痛、惡瘡 腫毒；可生津潤肺、助消化；還可去斑痧、醒酒等，特別是其種仁食之有經久甜味。其種子富 含甜蛋白，在全世界7種植物甜蛋白中，馬檳榔是我國特有分布的、唯一在果實中富含甜蛋 白的野生果樹資源。其種仁中富含甜蛋白馬賓靈化處1111110，甜度約為蔗糖的400倍(以重 量比較為基礎〉，而且其耐酸性好，熱穩定性高，即使在851水浴中48卜都不改變其甜味活 性，為11. 3，在酸性體系中仍保持可溶性，因此有望成為一種新型食品甜味劑。
〔0004〕馬檳榔為高大木質藤本植物，僅海南瓊海有人以種子育苗試種植，此外，基本上屬 于野生自然繁殖的狀態，加上自然生境的破壞及人為的砍伐，數量已十分稀少。目前，國內 外對馬檳榔的研究主要是在成分分析和甜蛋白基因等方面，其次就是形態學的研究，在馬 檳榔的育種方面的研究較少，繁殖方法也只是停留在種子育苗的狀態，致使對它的開發與 利用受到很大的限制，難于滿足人工種植和實驗室的深入研究的需要。

發明內容
〔0005〕 本發明的目的在于提供一種馬檳榔愈傷組織的誘導及再生方法，該方法不僅能夠 保證株系的優良特性，并能夠提供大量的優質種苗，為馬檳榔大面積種植、生態與物種保 護、資源利用及實驗提供了良好的誘導及再生方法。
〔0006〕 本發明的上述目的是通過如下技術方案來實現的
〔0007〕 一種馬檳榔愈傷組織的誘導及再生方法，含以下步驟“丨)材料的選取與消毒； (之)愈傷組織誘導；^叢生芽誘導；(幻叢生芽的增殖培養；巧)不定芽的生根成苗。
〔0008〕 具體的，本發明提供的馬檳榔愈傷組織的誘導及再生方法，含以下步驟材料 的選取與消毒選取馬檳榔材料，將材料經含清洗和浸泡消毒工序處理，獲得處理后的馬檳 榔材料；
〔0009〕 ^愈傷組織誘導將處理后的馬檳榔材料切塊，獲得組織塊，將組織塊接種于愈傷 組織誘導培養基上于26181進行暗培養20飛0天，獲得馬檳榔愈傷組織塊；
〔0010〕 ^叢生芽誘導將馬檳榔愈傷組織塊連同馬檳榔愈傷組織塊中未愈傷的組織塊， 轉接于叢生芽的誘導培養基上于26 281進行光培養20 40天，獲得馬檳榔叢生芽組織 塊；
〔0011〕(幻叢生芽的增殖培養選取長勢較好的馬檳榔叢生芽組織塊進行切塊，去除已死去變黑和變褐的組織，接種于叢生芽增殖培養基上于26 28°C進行光培養3(T60天，獲 得大量的馬檳榔不定芽；(5)不定芽的生根成苗選取馬檳榔不定芽接到生根成苗培養基上于26 28°C進 行光培養30 60天，獲得馬檳榔的小苗。在上述步驟中本發明步驟(1)中所述的馬檳榔材料包括馬檳榔未成熟胚、成熟胚、嫩莖和嫩葉 材料中的一種或幾種。本發明步驟(1)中將馬檳榔材料經含清洗和浸泡消毒工序處理的過程如下選 取馬檳榔材料，用水清洗干凈，將馬檳榔材料置于體積百分含量為7(T75%的酒精中消毒 l(T60s，并在質量百分含量為0. 1%的氯化汞中浸泡消毒3 20min，用無菌水沖洗干凈即可， 浸泡期間進行不時振蕩，使馬檳榔材料與酒精或氯化汞充分接觸。本發明步驟(2)中將處理后的馬檳榔材料切塊，獲得長度為1. (T2. 0cm的組織塊。本發明步驟(2)中愈傷組織誘導培養基以MS培養基為基礎培養基，在每1升MS培 養基中還添加有1飛mg的6-BA (6-芐氨基腺嘌呤)、() ro. 5mg的NAA (萘乙酸)和2(T30g 的蔗糖。本發明采用愈傷組織誘導培養基培養后，最高的出愈率可達85%，愈傷組織較好， 淺綠色、較緊密、且有光澤，并有芽萌動的現象；隨著6-BA濃度在一定范圍內的逐步增加， 愈傷組織形成速度逐步加快，而在此基礎上添加一定量的NAA會使產生的愈傷組織變得稍 微疏松，并能直接誘導產生不定芽。本發明步驟(3)、步驟(4)和步驟(5)中光培養時，每天光照的時間最好為l(Tl2h ； 每天光照10 12h有利于叢生芽的誘導，誘導出多個不定芽，且芽生長健壯，顏色鮮綠，可 用于進一步的增殖培養。本發明步驟(3)中的叢生芽誘導培養基和步驟(4)中的叢生芽增殖培養基以MS 培養基為基礎培養基，在每1升MS培養基中還添加有f 5mg的6-BA、0. f 1. Omg的NAA和 20 30g的蔗糖。本發明步驟(4)中選取長勢較好的馬檳榔叢生芽組織塊進行切塊至馬檳榔叢生 芽組織塊的大小為0. 5^1. 5cm2，去除已死去變黑和變褐的組織，接種于叢生芽培養基中。叢生芽的增殖培養時，隨著培養基中6-BA/NAA比率的增大，增殖率逐漸加大，最 高增殖率為283. 46%，且不定芽粗細均勻、生命力旺盛。適合大規模的繁殖。本發明步驟(5)中所述的生根成苗培養基以MS培養基為基礎培養基，在每1升MS 培養基中還添加有0. 05 0. 7mg的IBA以及2(T30g的蔗糖。本發明中馬檳榔的不定芽生根成苗過程時間約為30 60天，生根率可以達到90% 以上。與現有技術相比，本發明具有如下優點本發明馬檳榔愈傷組織的誘導及再生方 法可在短時間、小空間的條件下，可獲得大量的規格統一、無病毒、高質量的馬檳榔小苗，且 后代整齊一致，能保持原有品種的優良性狀，并能節約繁殖材料，從根本上解決了瀕危植物 馬檳榔的育苗問題，同時為馬檳榔的進一步研究提供技術基礎；并且本發明方法簡單，生產 成本低，叢生芽增殖率高，組織培養周期短，具有很大的應用價值。


圖1是實施例1中馬檳榔愈傷組織于誘導愈傷組織培養基MS+6-BA5. Omg/ L+NAAO. lmg/L中培養45天的長勢圖；圖2是實施例2中馬檳榔愈傷組織于誘導愈傷組織培養基MS+6-BA3. Omg/ L+NAAO. 5mg/L中培養35天的長勢圖；圖3是實施例2中馬檳榔愈傷組織塊于誘導叢生芽培養基MS+6-BA1. Omg/ L+NAAO. lmg/L中培養35天的長勢圖；圖4是實施例1中馬檳榔愈傷組織塊于誘導叢生芽培養基MS+6-BA1. Omg/ L+NAAO. 5mg/L中培養30天的長勢圖；圖5實施例1中馬檳榔叢生芽組織塊于叢生芽增殖培養基MS+6-BA5. Omg/ L+NAAO. 5mg/L中培養15天的長勢圖；圖6是實施例1中馬檳榔叢生芽組織塊于叢生芽增殖培養基MS+6-BA5. Omg/ L+NAAO. 5mg/L中培養45天的長勢圖；圖7是實施例1中馬檳榔的不定芽接于生根培養基MS+IBAO. 15mg/L中培養50天 的長勢圖；圖8是實施例3中馬檳榔的不定芽接于生根培養基MS+IBAO. 5mg/L中培養40天 的長勢圖。
具體實施例方式實施例1本實施例提供的馬檳榔愈傷組織的誘導及再生方法，含以下步驟(1)材料的選取與消毒過程選取無病蟲害、生長狀態良好的馬檳榔未成熟果實， 用清水將果實清洗干凈，在無菌工作臺上，小心剝出幼嫩的未成熟胚，然后置于體積百分含 量為75%的酒精中消毒10s，無菌水沖洗1次，在質量百分含量為0. 1%氯化汞中浸泡3min， 無菌水清洗4次，浸泡期間要不時振蕩，使外植體馬檳榔未成熟胚與消毒劑充分接觸；(2)愈傷組織誘導過程將步驟(1)中所得到的未成熟胚切成約2. Ocm的組織塊 接種于愈傷組織誘導培養基中，于26 28°C進行暗培養45天，獲得馬檳榔種胚愈傷組織 塊，出愈率為85%，從圖1中可以看出，所誘導的愈傷組織較好，淺綠色、較緊密、且有光澤， 并有芽萌動的現象，此類愈傷組織用于下一步的叢生芽誘導效果最好，其中愈傷組織誘導 培養基的成分為以MS培養基為基礎培養基，在每1升MS培養基中還添加有5mg的6-BA、 0. lmg的NAA和30g的蔗糖，將愈傷組織誘導培養基標記為MS+6_BA5. Omg/L+NAAO. lmg/L, 其中MS培養基根據教科書中的配方進行配制，每1升MS培養基的基本成分表如下表1所 示表1每1升MS培養基的基本成分表
權利要求
1.一種馬檳榔愈傷組織的誘導及再生方法，其特征是含以下步驟 (1)材料的選取與消毒選取馬檳榔材料，將材料經含清洗和浸泡消毒工序處理，獲得處理后的馬檳榔材料； (2)愈傷組織誘導將處理后的馬檳榔材料切塊，獲得組織塊，將組織塊接種于愈傷組織誘導培養基上于26 28°C進行暗培養2(T60天，獲得馬檳榔愈傷組織塊； (3)叢生芽誘導將馬檳榔愈傷組織塊連同馬檳榔愈傷組織塊中未愈傷的組織塊，轉接于叢生芽的誘導培養基上于26 28°C進行光培養2(T40天，獲得馬檳榔叢生芽組織塊； (4)叢生芽的增殖培養選取長勢較好的馬檳榔叢生芽組織塊進行切塊，去除已死去變黑和變褐的組織，接種于叢生芽增殖培養基上于26 28°C進行光培養3(T60天，獲得大量的馬檳榔不定芽； (5)不定芽的生根成苗選取馬檳榔不定芽接到生根成苗培養基上于26 28°C進行光培養30 60天，獲得馬檳榔的小苗。
2.根據權利要求I所述的馬檳榔愈傷組織的誘導及再生方法，其特征是步驟(I)中所述的馬檳榔材料包括馬檳榔未成熟胚、成熟胚、嫩莖和嫩葉材料中的一種或幾種。
3.根據權利要求I所述的馬檳榔愈傷組織的誘導及再生方法，其特征是步驟(I)中將馬檳榔材料經含清洗和浸泡消毒工序處理的過程如下選取馬檳榔材料，用水清洗干凈，將馬檳榔材料置于體積百分含量為7(T75%的酒精中消毒1(T60s，并在質量百分含量為0.1%的氯化汞中浸泡消毒3 20min，用無菌水沖洗干凈即可，浸泡期間進行不時振蕩，使馬檳榔材料與酒精或氯化汞充分接觸。
4.根據權利要求I所述的馬檳榔愈傷組織的誘導及再生方法，其特征是步驟(2)中將處理后的馬檳榔材料切塊，獲得長度為I. (T2. Ocm的組織塊。
5.根據權利要求I所述的馬檳榔愈傷組織的誘導及再生方法，其特征是步驟(2)中愈傷組織誘導培養基以MS培養基為基礎培養基，在每I升MS培養基中還添加有f 5mg的6-BA、0. I 0. 5mg 的 NAA 和 20 30g 的蔗糖。
6.根據權利要求I所述的馬檳榔愈傷組織的誘導及再生方法，其特征是步驟(3)、步驟(4)和步驟(5)中光培養時，每天光照的時間為l(Tl2h。
7.根據權利要求I所述的馬檳榔愈傷組織的誘導及再生方法，其特征是步驟(3)中的叢生芽誘導培養基和步驟(4)中的叢生芽增殖培養基以MS培養基為基礎培養基，在每I升MS培養基中還添加有I 5mg的6-BA、0. 1 1. Omg的NAA和20 30g的蔗糖。
8.根據權利要求I所述的馬檳榔愈傷組織的誘導及再生方法，其特征是步驟(4)中選取長勢較好的馬檳榔叢生芽組織塊進行切塊至馬檳榔叢生芽組織塊的大小為0.5 L 5cm2。
9.根據權利要求I所述的馬檳榔愈傷組織的誘導及再生方法，其特征是步驟(5)中所述的生根成苗培養基以MS培養基為基礎培養基，在每I升MS培養基中還添加有0. 05 0.7mg的IBA以及20 30g的蔗糖。
全文摘要
本發明公開了一種馬檳榔愈傷組織的誘導及再生方法，其特征是含以下步驟(1)材料的選取與消毒；(2)愈傷組織誘導；(3)叢生芽誘導；(4)叢生芽的增殖培養；(5)不定芽的生根成苗。該方法不僅能夠保證株系的優良特性，并能夠提供大量優質種苗，為馬檳榔大面積種植、生態與物種保護、資源利用及實驗提供了良好的再生體系方法。
文檔編號A01H4/00GK102657096SQ20121017709
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月31日 優先權日2012年5月31日
發明者于旭東, 吳繁花, 胡新文, 郭建春 申請人:海南大學