專利名稱：一種誘導紅豆杉種子種胚獲得愈傷組織和懸浮細胞的方法
技術領域：
本發明屬于植物組織培養和細胞工程領域，具體涉及一種誘導紅豆杉種子種胚獲得愈傷組織和懸浮細胞的方法。
背景技術：
紫杉醇(Paclitaxel,商品名Taxol)是20世紀六七十年代從紅豆杉科(Taxaceae)紅豆杉屬(Taxus L.)植物樹皮中分離出來的一種天然的四環二萜類生物堿，因其在腫瘤治療中的獨特效果而廣受人們關注。據相關資料介紹，估計國內外在21世紀初期對紫杉醇針劑的需求量約2000萬支，即需用紫杉醇600kg，目前市場售價為1200-1800元/支不等。隨著對紫杉醇需求量的日益遞增，目前僅僅從紅豆杉的樹體中提取的產量已經不能滿足醫藥市場需要，加之大肆的開采使紅豆杉自然資源日趨枯竭、紅豆杉資源自然更新能力差、生長 緩慢、瀕危滅絕，各國政府已明文規定禁止砍伐野生紅豆杉資源。因此紫杉醇其他途徑的開發就顯得極為重要，其中利用紅豆杉細胞進行離體培養就是一條重要的途徑，一方面可以加強對紅豆杉野生種質資源及其生態環境的保護，另一方面可以滿足供需間的差距，并且細胞培養繁殖率高，培養條件易于優化和控制，產物較易分離，從長遠來看是解決紫杉醇供需矛盾的最佳途徑。國內外關于紅豆杉細胞、組織培養和紫杉醇鑒定、分離和純化方面的研究工作已經開發了較為完善的實驗室技術體系，并且具有相當規模的工廠化生產系統。在其大規模培養生產紫杉醇的核心是要篩選得到具有高產、優質、遺傳穩定的細胞種質資源，這是利用紅豆杉細胞進行大規模生產紫杉醇的前提。在以紅豆杉莖段或者其他成年態的材料為外植體建立細胞系的過程中污染率較高，比較的浪費人力、財力和物力(魯明波，紅豆杉高產細胞株的篩選及培養條件優化，2000，華中科技大學博士論文)。紅豆杉種胚可以直接或者間接誘導成愈傷組織細胞無性系，并具有產生紫杉醇代謝的能力。中國紅豆杉剛剛萌動的種胚可以在培養基上離體培養得到愈傷組織細胞系，并通過篩選得到細胞生長快、紫杉醇含量高的細胞系(張長河等，紅豆杉胚源細胞株的培養和紫杉醇的生產，華中理工大學學報，2000，28 (1):82-85)。Sung HS等利用日本紅豆杉的成熟種胚在B5培養基上誘導出了愈傷組織，并進一步進行了紫杉醇的檢測(Sung Ho Son, et al, selectionand proliferation of rapid growth cell lines from embryoderived cell culturesof Yew Tree (Taxus cuspidate Sieb.Et Zucc)，Bioprocess Eng，1994，4，112-118);Wann RS等短葉紅豆杉、歐洲紅豆杉和日本紅豆杉的胚乳為材料在BLCG培養基上成功誘導得到體細胞胚胎，并成功增值用于紫杉醇的提取(Wann et al. , induction of somaticembryogenisis in taxus, and the production of taxane-ring containing alkaloidstherefrom, United States Patent, US005310672A)；Mihaljevi 等[19]利用歐洲紅豆杉的成熟種胚為材料，在B5培養基上直接成功誘導出愈傷組織、增殖，并用高效液相色譜檢測到紫杉醇的產生(Mihal jevic S et al，effect of explant source and growthregulators on in vitro callus growth of Taxus baccta L. Washingtoniij FoodTechnol.Biotechnol. 2002, 40(4):299 - 303)。以上4篇文獻有關于中國紅豆杉、短葉紅豆杉、歐洲紅豆杉和日本紅豆杉種胚間接或直接誘導愈傷組織組織或者體細胞胚胎發生的報道，但沒有直接誘導成疏松并直接適合細胞懸浮培養的文獻報道或者專利公開。

發明內容
本發明的目的在于提供一套利用南方紅豆杉種胚直接誘導成疏松的愈傷組織的方法，并提供利用該愈傷組織進行懸浮培養獲得懸浮細胞的方法，克服了莖段誘導愈傷組織高污染率、低效率或方法存在的缺陷，以便快速、高效、大規模地獲得分散性能好的懸浮細胞，為紅豆杉的細胞懸浮培養提供原料或者進一步篩選高產紫杉醇細胞株提供優質篩選材料。本發明的目的是通過以下方式實現的。
一種誘導紅豆杉種子種胚獲得愈傷組織的方法，包括以下步驟(I)種子種胚的剝離將南方紅豆杉種子(Taxales chinensis var. mairei)從外種皮中剝離出來；(2)外植體消毒取步驟(I)得到的種子，用70%的酒精和O. 1%的氯化汞表面消毒，再用無菌水清洗；(3)種子的預處理將步驟(2)得到的種子用無菌水浸泡1-5天后；(4)種子合子胚的分離在無菌條件下剝取種子的合子胚；(5)愈傷組織的誘導將步驟(4)獲得的合子胚接種于誘導培養基上誘導愈傷組織，所述的誘導培養基為BLCG培養基(該培養基配方見Wann et al.，induction ofsomatic embryogenisis in taxus, and the production of taxane-ring containingalkaloids therefrom, United States Patent, US005310672A)+Piculoram(毒莠定)l_5mg/L+6-BA 0. 5mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂7g/L ;誘導條件為24± 1°C條件下暗培養。所述步驟(I)中的南方紅豆杉種子為當年生或者4°C保存1-2年的南方紅豆杉種子。所述步驟(2)清洗消毒過程具體如下先將去除外種皮的種子放入無菌的容器中，在超凈工作臺內依次經70%酒精消毒90s和0. 1%氯化汞消毒12min，無菌水沖洗5次后備用。所述步驟(3)種子預處理具體過程如下將去掉外種皮的種子經過步驟(2)的表面消毒處理后，用無菌的蒸餾水在室溫條件下無菌密封浸泡1-5天。步驟(5)得到的愈傷組織可進行繼代培養，具體條件為繼代培養的培養基為BLCG 培養基+picloram l-3mg/L+6_BA 0. 5-1. 0mg/L+鹿糖 20g/L+瓊脂 7g/L, pH 值調至
5.8 6. O，培養條件為24 ± I °C條件下暗培養。一種誘導紅豆杉種子種胚獲得懸浮細胞的方法，挑取由上述的方法中繼代培養得到的淡黃色愈傷組織，轉入液體培養基中進行懸浮培養，獲得懸浮細胞。具體是挑取上述的方法中繼代培養IOd得到的淡黃色膨松的愈傷組織進行懸浮培養，培養基為BLCG培養基或者B5培養基+picloram l-3mg/L+6_BA 0. 5-1. 0mg/L+鹿糖20g/L,(為液體培養基，不要添加瓊脂)pH值調至5. 8 6. O,培養條件為24土 TC條件下暗培養，搖床轉速為100_120rpm/mino該發明具有以下優點(1)外植體采集時期集中，污染率極低；(2)種子預處理簡單，用靜水處理可以大量節約水資源，并且適合大批量的種子處理；(3)通過一步培養可以獲得適合懸浮培養的愈傷組織，簡化后續試驗；(4)克服了莖段誘導愈傷組織高污染率、低效率或方法存在的缺陷，以便快速、高效、大規模地獲得分散性能好的懸浮細胞，為紅豆杉的細胞懸浮培養提供原料或者進一步篩選高產紫杉醇細胞株提供優質篩選材料。


圖I是本發明中用南方紅豆杉種胚獲得南方紅豆杉愈傷組織和懸浮細胞的過程，其中A.剛剝離的種胚接種到培養基上；B.種胚誘導培養20天；C.種胚誘導培養32天；D.種胚誘導培養45天；E.愈傷組織懸浮培養4天后的照片；F.懸浮細胞懸浮培養7天后剛抽濾后的細胞系。
具體實施例方式以下實施例旨在進一步說明本發明，而不會限制本發明。實施例II)種子種胚的剝離收集當年生的南方紅豆杉種子，使用機械結合手工方法破殼，將種子從外種皮中剝離出來；(2)外植體消毒先將去外種皮的種子放入無菌的容器中，在超凈工作臺內經70%酒精消毒90s和O. 1%氯化汞消毒12min，無菌水沖洗5次后備用，清洗時每次浸種5分鐘左右。(3)種子的預處理將去掉外種皮的種子經過步驟(2)的表面消毒處理后，用無菌的蒸餾水在室溫條件下密封浸泡3-5天。(4)種子合子胚的分離在無菌條件下剝取種子的合子胚，其他部分棄除；(5)愈傷組織的誘導接種于愈傷組織培養基，培養基配方為BLCG培養基+Piculoram3mg/L+6-BA O. 5mg/L+ 鹿糖 20g/L+ 瓊脂 7g/L ;誘導條件為 24± 1/C條件下暗培養；經過40天的暗培養可以誘導出愈傷組織，愈傷組織誘導率為90%，當其他條件不變，而愈傷組織誘導培養基中Piculoram含量在l_5mg/L范圍內變化時，其誘導率均能達到90%，且生長良好。(6)愈傷組織的繼代培養挑取誘導的初始淡黃色合子胚愈傷組織在繼代培養基中進行繼代培養，繼代培養的培養基為=BLCG培養基+20g/L的蔗糖+7g/L的瓊脂+picloram2mg/L+6-BA O. 8mg/L，pH值調至6. 0，培養條件為24±1°C條件下暗培養；愈傷組織能夠正常增值培養，當其他條件不變，而繼代培養基中picloram含量在l_3mg/L和6-BA含量在O. 5-1. Omg/L, pH值在5. 8 6. O范圍內變化時，愈傷組織生長效果良好。(7)懸浮培養挑取繼代培養IOd左右的淡黃色、生長快、顆粒明顯的細胞團進行懸浮培養，培養基為BLCG培養基+20g/L的鹿糖+picloram 2mg/L+6-BA O. 8mg/L,(為液體培養基，不要添加瓊脂)pH值調至6. O,培養條件為24土 1°C條件下暗培養，搖床轉速為100-120rpm/min。在轉入液體培養基中進行懸浮培養3天左右，獲得分散良好的紅豆杉合子胚愈傷組織懸浮細胞。當其他條件不變，而懸浮培養基中picloram含量在l_3mg/L和6-BA含量在
O.5-1. Omg/L, pH值在5. 8 6. O范圍內變化時，均能獲得分散良好的紅豆杉合子胚愈傷組織懸浮細胞。 或者當其他條件不變，而將上述懸浮培養基改為B5培養基時，也能達到上述同樣的效果。
權利要求
1.一種誘導紅豆杉種子種胚獲得愈傷組織的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)種子種胚的剝離將南方紅豆杉種子(Taxaleschinensis var. mairei)從外種皮中剝離出來； (2)外植體消毒取步驟(I)得到的種子，用70%的酒精和O.1%的氯化汞表面消毒，再用無菌水清洗； (3)種子的預處理將步驟(2)得到的種子用無菌水浸泡1-5天后； (4)種子合子胚的分離在無菌條件下剝取種子的合子胚； (5)愈傷組織的誘導將步驟(4)獲得的合子胚接種于誘導培養基上誘導愈傷組織，所 述的誘導培養基為BLCG培養基+Piculoram l-5mg/L+6_BA O. 5mg/L+鹿糖20g/L+瓊脂7g/L ;誘導條件為24±1°C條件下暗培養。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于， 所述步驟(I)中的南方紅豆杉種子為當年生或者4°C保存1-2年的南方紅豆杉種子。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于， 所述步驟(2)清洗消毒過程具體如下先將去除外種皮的種子放入無菌的容器中，在超凈工作臺內依次經70%酒精消毒90s和O. 1%氯化汞消毒12min，無菌水沖洗5次后備用。
4.根據權利要求I所述的方法，其特征在于， 所述步驟(3)種子預處理具體過程如下將去掉外種皮的種子經過步驟(2)的表面消毒處理后，用無菌的蒸餾水在室溫條件下無菌密封浸泡1-5天。
5.根據權利要求I所述的方法，其特征在于， 步驟(5)得到的愈傷組織進行繼代培養，具體條件為繼代培養的培養基為BLCG培養基 +picloram l-3mg/L+6_BA O. 5-1. Omg/L+ 鹿糖 20g/L+ 瓊脂 7g/L, pH 值調至 5· 8 6· O,培養條件為24±1°C條件下暗培養。
6.一種誘導紅豆杉種子種胚獲得懸浮細胞的方法，其特征在于，挑取由權利要求5所述的方法培養得到的淡黃色愈傷組織，轉入液體培養基中進行懸浮培養，獲得懸浮細胞。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，挑取由權利要求5所述的方法繼代培養IOd得到的淡黃色膨松的愈傷組織進行懸浮培養，培養基為BLCG培養基或者B5培養基+picloram l-3mg/L+6_BA O. 5-1. Omg/L+ 鹿糖 20g/L, pH 值調至 5· 8 6· O,培養條件為 24±1°C條件下暗培養，搖床轉速為100-120rpm/min。
全文摘要
本發明公開了一種誘導紅豆杉種子種胚獲得愈傷組織和懸浮細胞的方法。包括(1)種子外種皮剝離；(2)外植體消毒；(3)種子預處理用無菌水密封常溫浸種1-5天；(4)分離合子胚；(5)愈傷組織的誘導；(6)愈傷組織的繼代培養；(7)愈傷組織的懸浮培養挑取生長勢好的淡黃色合子胚細胞系，轉入液體培養基中進行懸浮培養，獲得紅豆杉合子胚愈傷組織懸浮細胞。本發明具有簡便、快速獲取紅豆杉愈傷組織以及利用該愈傷組織給紅豆杉的細胞懸浮培養提供原料或者進一步篩選高產紫杉醇細胞株提供優質篩選材料的特點，能節省大量的人力、物力、提高勞動效率。
文檔編號A01H4/00GK102715085SQ20121020177
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月19日 優先權日2012年6月19日
發明者張家銀, 李炎林, 熊興耀, 石夢蝶, 秦宇 申請人:湖南農業大學