顯著提高野生百合胚性愈傷組織繼代增殖率的培養方法
【專利摘要】本發明涉及植物快速繁殖【技術領域】，旨在提供顯著提高野生百合愈傷組織繼代增殖率的培養方法。該培養方法包括步驟：愈傷組織的誘導培養、愈傷組織的繼代培養、愈傷組織的擴增培養。本發明以百合愈傷再生體系中的直徑0.3～0.5cm的小團塊的愈傷組織為對象，其突出的優勢在于愈傷組織處理后在較短時間內獲得非常高的增殖率，顯著高于常規繼代的愈傷組織增殖率，并且低溫處理期間無需再進行繼代，從而在節約人力時間的同時獲得較高的增殖率，為以愈傷組織為基礎的高效擴繁體系和遺傳轉化體系準備條件。
【專利說明】顯著提高野生百合胚性愈傷組織繼代增殖率的培養方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及植物快速繁殖【技術領域】，尤其涉及顯著提高野生百合愈傷組織繼代增殖率的培養方法。
【背景技術】
[0002]百合胚性愈傷組織再生體系對建立遺傳轉化體系具有重要意義，通過繼代培養保持愈傷組織系可以為后期的遺傳轉化提供可隨時獲得的原材料，由于轉基因技術轉化效率目前仍較低，高增殖率的愈傷組織是在短期內獲得充足愈傷組織以保證不斷進行轉基因操作，以取得轉基因的必要條件。
[0003]對于百合胚性愈傷組織的繼代，現有技術主要是通過在同一種繼代培養基及培養條件下培養，以4-8周為周期，將上一次繼代的愈傷組織團塊分成較小團塊后，接種到新鮮培養基上培養，使其進一步增殖；針對現有技術的改良，已有報道主要是圍繞繼代培養基配方中植物生長調節劑等物質的濃度和比例的改變。但定期擴繁(每4-8周)需要較高的時間人力成本，同時擴繁增殖率相對較低。伴隨繼代次數增加，愈傷組織胚性退化、再生能力下降。如何能在節約人力時間的同時獲得較高的愈傷組織增殖率是技術瓶頸。

【發明內容】

[0004]本發明要解決的技術問題是，克服現有技術中的不足，提供一種顯著提高野生百合胚性愈傷組織繼代增殖率的培養方法。
[0005]為解決技 術問題，本發明的解決方案是:
[0006]提供顯著提高野生百合胚性愈傷組織繼代增殖率的培養方法，包括以下步驟:
[0007](I)愈傷組織的誘導培養:在超凈工作臺上，取野生百合組培苗鱗片進行愈傷誘導培養，方法是將組培苗鱗莖的鱗片用鑷子或解剖刀剝離，將其鱗片尖端切除0.3cm，并在其近軸面用解剖刀劃I~3個創口，接種時以創口朝下接觸愈傷誘導培養基表面，愈傷誘導培養20~50天后，獲得直徑0.3~0.5cm的淺黃色、顆粒狀的胚性愈傷組織團塊，愈傷誘導率為63.3%~79.1% (其中，鱗片上的創口是產生愈傷組織的關鍵，創口接觸培養基可以使植物充分感應培養基中的激素等物質，以產生愈傷);
[0008]所述愈傷誘導培養是在完全黑暗、25°C的愈傷誘導培養條件下進行；用于接種的愈傷誘導培養基以MS培養基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養基，即每升培養基添加4.43gMS粉，所述愈傷誘導培養基中還含有濃度為0.1~2.0mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic, 2, 4-D)、?~L Omg/L α -萘乙酸(1-Naphthaleneaceticacid, NAA)、濃度為 0.1 ~0.4mg/L 的 6-節氛基腺嘿呤(6-benzyladenine, 6_BA)、30g/L 的蔗糖、6~8g/L瓊脂，愈傷誘導培養基的pH值為5.8 (其中，2，4- 二氯苯氧乙酸對愈傷組織的誘導是關鍵的)；
[0009](2)愈傷組織的繼代培養:愈傷誘導培養60~90天后，在超凈工作臺上用鑷子或解剖刀剔除愈傷組織團塊中褐色的老化部分，接種到新鮮的繼代培養基上；每個裝有繼代培養基的培養皿中接種20~30塊愈傷組織團塊，愈傷組織團塊的直徑在0.3~0.5cm之間，每4周繼代一次，每次繼代可獲得每月2~2.5倍的增殖率，即愈傷組織團塊經過一個月的培養，重量增加為接種時的2~2.5倍；
[0010]所述繼代培養是在完全黑暗、25 °C的繼代培養條件下進行；用于接種的繼代培養基以MS培養基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養基，即每升培養基添加4.43gMS粉，所述繼代培養基中還含有濃度為0.1~2.0mg/L的2，4_D、0~Img/La -蔡乙酸(1-Naphthaleneacetic acid, NAA)>0.1 ~0.4mg/L 的 6_ 節氛基腺嘿呤(6-benzyladenine, 6_BA)、30g/L的鹿糖、4~8g/L瓊脂,繼代培養基的pH值為5.8(其中，2，4- 二氯苯氧乙酸對愈傷組織脫分化狀態的維持是關鍵的)；
[0011](3)愈傷組織的擴增培養:
[0012]愈傷組織團塊在繼代培養基上繼代培養I~8個月后，將愈傷組織團塊分切成
0.5cm的小塊，接種到含繼代培養基的培養皿上，依次用經過紫外滅菌的保鮮膜和錫紙包裹，然后進行30~60天的低溫處理，低溫處理條件為I~4°C，完全黑暗(低溫處理能夠抑制愈傷組織在繼代培養基上出現的分化情況，保持愈傷組織在脫分化狀態并有利于愈傷組織的增殖，黑暗條件有利于愈傷組織的誘導和增殖，保持愈傷組織的脫分化狀態)；
[0013]再將低溫處理后的愈傷組織團塊接種到擴增培養基上，進行弱光培養，弱光培養是指在光照100~9001UX、溫度25°C的條件下進行，且擴增培養基裝在口徑為6.35cm,高度為9.20cm的柱形瓶中； [0014]弱光培養60天后，將擴增后的愈傷組織團塊分成0.3~0.5cm的小塊，轉接到新鮮的繼代培養基上黑暗培養，黑暗培養是指:完全黑暗，溫度25°C，繼代培養基裝在培養皿中(黑暗條件有利于愈傷組織的誘導和增殖，保持愈傷組織的脫分化狀態)；經過低溫處理和弱光培養后的愈傷組織團塊，即為增殖率15~36.6的愈傷組織；
[0015]所述擴增培養基以MS培養基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養基，即每升培養基添加4.43gMS粉，擴增培養基中還含有濃度為30g/L的蔗糖和4~8g/L瓊脂，擴增培養基的pH值5.8。
[0016]在本發明中，步驟(3 )中，包裹培養皿的錫紙和保鮮膜間填充有脫脂棉，脫脂棉用于在低溫處理和恢復常溫中保護植物材料。
[0017]本發明提供的上述方法可以用于百合愈傷組織再生體系和遺傳轉化體系中，具體為:對上述方法獲得的愈傷組織進行繼代培養后分切成小塊，接種到相應繼代培養基上培養；用該愈傷組織在再生培養基上分化生根，煉苗、移栽即可獲得百合的組織培養植株；或將該愈傷組織作為遺傳轉化體系的受體，經農桿菌轉染或基因槍介導轉化，經過篩選和鑒定，并在再生培養基上分化生根、煉苗、移栽獲得百合的轉基因植株。
[0018]與現有技術相比，本發明的有益效果是:
[0019]通過低溫處理來源于野生百合鱗片的愈傷組織，再通過弱光常溫培養和調整培養基配方，能夠保存愈傷組織的活力和胚性、降低定期繼代的時間勞力成本，并同時獲得15~36.6倍的增殖率。
[0020]本發明以百合愈傷再生體系中的直徑0.3~0.5cm的小團塊的愈傷組織為對象，其突出的優勢在于愈傷組織處理后在較短時間內獲得非常高的增殖率，顯著高于常規繼代的愈傷組織增殖率，并且低溫處理期間無需再進行繼代，從而在節約人力時間的同時獲得較高的增殖率，為以愈傷組織為基礎的高效擴繁體系和遺傳轉化體系準備條件。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為實施例中愈傷組織分化出心形胚的電鏡觀察圖。
[0022]圖2為實施例中愈傷組織分化出魚雷形胚的電鏡觀察圖。
【具體實施方式】
[0023]下面結合實施例對本發明作進一步詳細描述，方便本專業的專業技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。
[0024]實施例1巨球百合繼代I次愈傷組織的培養
[0025](I)愈傷組織的誘導培養:取巨球百合(Lilium brownii F.E.Brown ex Miellezvar.giganteum G.Y.Li&Z.H.Chen)組培苗鱗片進行愈傷誘導培養，方法是將組培苗鱗莖的鱗片用鑷子或解剖刀剝離，將其鱗片尖端切除0.3cm,并在其近軸面用揭解剖刀劃2個創口，接種時以創口朝下接觸愈傷誘導培養表面，在完全黑暗、25°C的愈傷誘導培養條件下培養50天后，獲得直徑0.5cm的淺黃色、顆粒性良好的胚性愈傷組織團塊，愈傷誘導率為79.1%。
[0026]用于接種的愈傷誘導培養基以MS培養基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養基，即每升培養基添加4.43gMS粉，還含有濃度為lmg/L的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic, 2，4-D)、濃度為 0.2mg/L 的 6-節氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_BA)、30g/L的鹿糖、8g/L瓊脂,愈傷誘導培養基的pH為5.8。
[0027](2)愈傷組織的繼代培養`:愈傷誘導培養80天后，在超凈工作臺上用鑷子或解剖刀剔除愈傷組織團塊中褐色的老化部分，接種到新鮮的繼代培養基上，每個培養皿接種30塊愈傷組織團塊，每塊愈傷組織團塊直徑0.3cm。在完全黑暗、25°C的繼代培養條件下進行培養，每4周繼代一次，獲得每月2.3倍的增值率。
[0028]用于接種的愈傷繼代培養基以MS培養基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養基，即每升培養基添加4.43gMS粉，還含有濃度為lmg/L的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic, 2，4-D)、濃度為 0.2mg/L 的 6-節氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_BA)、30g/L 的鹿糖、4g/L 瓊脂,繼代培養基的 pH 為 5.8。
[0029](3)愈傷組織的擴增培養:愈傷組織團塊在繼代培養基上培養I個月后，獲得2.3倍的增殖率，將愈傷組織團塊分切成0.5cm的小塊，接種到含相同的繼代培養基的培養皿上，用無菌濾膜封口后，用紫外消毒后的保鮮膜和錫紙包裹，中間夾少量脫脂棉，進行30天的低溫處理，低溫處理條件為1°C，完全黑暗。將低溫處理后的愈傷組織團塊接種到擴增培養基上，擴增培養基裝在口徑為6.35cm，高度為9.20cm的柱形瓶中，在光照5001ux，溫度25°C條件下進行弱光培養。弱光培養60天后，將擴增后的愈傷組織團塊分成0.3cm的小塊，轉接到新鮮的繼代培養基上黑暗培養，黑暗培養是在完全黑暗，溫度25°C下，繼代培養基裝在培養皿培中。
[0030]擴增培養基以MS培養基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養基，即每升培養基添加4.43gMS粉，還含有濃度為30g/L的蔗糖和4g/L瓊脂，擴增培養基的pH為5.8。
[0031]經過擴增培養，愈傷團塊增長迅速，愈傷團塊體積大而不規則，接種到擴增培養前相同的含繼代培養基的培養皿上，可獲得900塊直徑5mm的愈傷組織團塊，增殖率達到1:30。
[0032]實施例2巨球百合短期繼代愈傷組織培養
[0033](I)取巨球百合(Lilium brownii F.E.Brown ex Miellez var.giganteumG.Y.Li&Z.H.Chen)組培苗鱗片進行愈傷誘導培養，方法是將組培苗鱗莖的鱗片用鑷子或解剖刀剝離，將其鱗片尖端切除0.3cm,并在其近軸面用解剖刀劃I個創口，接種時以創口朝下接觸愈傷誘導培養表面，在完全黑暗、25°C的愈傷誘導培養條件下培養40天后，獲得直徑0.4cm的淺黃色、顆粒性良好的胚性愈傷組織團塊，愈傷誘導率為63.3%。
[0034]用于接種的愈傷誘導培養基以MS培養基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養基，即每升培養基添加4.43gMS粉，還含有濃度為2mg/L的2，4-二氯苯氧乙
酸(2，4-dichlorophenoxyacetic，2，4-D)、0.5mg/Lα -萘乙 酸(1-Naphthaleneaceticacid, NAA)、濃度為 0.4mg/L 的 6-節氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_BA)、30g/L 的鹿糖、7g/L瓊脂，愈傷誘導培養基的pH為5.8。
[0035](2)愈傷組織的繼代培養:愈傷誘導培養90天后，在超凈工作臺上用鑷子或解剖刀剔除愈傷組織團塊中褐色的老化部分，接種到新鮮的繼代培養基上，每個培養皿25塊愈傷組織團塊，每塊愈傷直徑0.4cm。在完全黑暗、25°C的繼代培養條件下進行培養，每4周繼代一次，可獲得每月2倍的增值率。
[0036]用于接種的愈傷繼代培養基以MS培養基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養基，即每升培 養基添加4.43gMS粉，含有濃度為2mg/L的2，4-二氯苯氧乙M.(2,4-dichlorophenoxyacetic,2, 4-D)>0.5mg/L α -萘乙 酸(1-Naphthaleneaceticacid, NAA)、濃度為 0.4mg/L 的 6-節氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_BA)、30g/L 的鹿糖、6g/L瓊脂，愈傷繼代培養基的pH為5.8。
[0037](3)愈傷組織的擴增培養:愈傷組織團塊在繼代培養基上培養3個月后，獲得每月2倍的增殖率，將愈傷組織團塊分切成0.5cm的小塊，接種到含相同的繼代培養基的培養皿上，用無菌濾膜封口后，用紫外消毒后的保鮮膜和錫紙包裹，中間夾少量脫脂棉，進行60天的低溫處理，低溫處理條件為3°C，完全黑暗。將進過低溫處理后的愈傷組織團塊接種到擴增培養基上，擴增培養基裝在口徑為6.35cm、高度為9.20cm的柱形瓶中，在光照lOOlux，溫度25°C條件下進行弱光培養60天后，將擴增后的愈傷組織團塊分成0.4cm的小塊，轉接到新鮮的繼代培養基上黑暗培養，黑暗培養是指完全黑暗、溫度25°C的條件，繼代培養基裝在培養皿培中。
[0038]擴增培養基以MS培養基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養基，即每升培養基添加4.43gMS粉，還含有濃度為30g/L的蔗糖和6g/L瓊脂，擴增培養基的pH為5.8。
[0039]經過擴增培養，愈傷團塊增長迅速，愈傷團塊體積大而不規則，接種到擴增培養前相同的含繼代培養基的培養皿上，可獲得450塊直徑5mm的愈傷組織團塊，增殖率達到1:15。
[0040]實施例3巨球百合長期繼代愈傷組織的培養
[0041](I)取巨球百合(Lilium brownii F.E.Brown ex Miellez var.giganteumG.Y.Li&Z.H.Chen)組培苗鱗片進行愈傷誘導培養，方法是將組培苗鱗莖的鱗片用鑷子或解剖刀剝離，將其鱗片尖端切除0.3cm,并在其近軸面用揭解剖刀劃3個創口，接種時以創口朝下接觸培養基表明為宜，在完全黑暗、25°C的愈傷誘導培養條件下培養20天后，獲得直徑0.3cm的淺黃色、顆粒性良好的胚性愈傷組織團塊，愈傷誘導率為78.1%。
[0042]用于接種的愈傷誘導培養基以MS培養基(Murashige and Skoog，1962)為基本培養基，即每升培養基添加4.43gMS粉，還含有濃度為0.lmg/L的2，4-二氯苯氧乙M.(2, 4-dichlorophenoxyacetic,2, 4~D)>1.0mg/L α -萘乙 酸(1-Naphthaleneaceticacid, NAA)、濃度為 0.lmg/L 的 6-節氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_BA)、30g/L 的鹿糖、6g/L瓊脂，愈傷誘導培養基的pH為5.8。
[0043](2)愈傷組織的繼代培養:愈傷誘導培養60天后，在超凈工作臺上用鑷子或解剖刀剔除愈傷組織團塊中褐色的老化部分，接種到新鮮的繼代培養基上，每個培養皿20塊愈傷組織團塊，每塊愈傷組織團塊直徑0.5cm。在完全黑暗、25°C的繼代培養條件下進行培養，每4周繼代一次，可獲得每月2.5倍的增殖率。
[0044]用于接種的愈傷繼代培養基以MS培養基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養基即每升培養基添加4.43gMS粉，還含有濃度為0.lmg/L的2，4-二氯苯氧乙M.(2,4-dichlorophenoxyacetic,2, 4~D)>1.0mg/L α -萘乙 酸(1-Naphthaleneaceticacid, NAA)、濃度為 0.lmg/L 的 6-節氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_BA)、30g/L 的鹿糖，8g/L瓊脂，愈傷繼代培養基的pH為5.8。
[0045](3)愈傷組織的擴增培養:愈傷組織團塊在繼代培養基上繼代培養8個月后，將愈傷組織團塊分切成0.5cm的小塊，接種到含相同的繼代培養基的培養皿上，用無菌濾膜封口后，用紫外消毒后的保鮮膜和錫紙包裹，中間夾少量脫脂棉，進行45天的低溫處理，低溫處理條件為4°C，完全黑暗。將進過低溫處理后的愈傷組織團塊接種到擴增培養基上，擴增培養基裝在口徑為6.35cm、高度為9.20cm的柱形瓶中，在光照9001ux，溫度25°C條件下進行弱光培養60天后，將擴 增后的愈傷組織團塊分成0.5cm的小塊，轉接到新鮮的繼代培養基上黑暗培養，黑暗培養是指完全黑暗、溫度25°C的條件，繼代培養基裝在培養皿培中。
[0046]擴增培養基以MS培養基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養基，即每升培養基添加4.43gMS粉，還含有濃度為30g/L的蔗糖、8g/L瓊脂，擴增培養基的pH為5.8。
[0047]經過擴增培養，愈傷團塊增長迅速，愈傷團塊體積大而不規則，接種到擴增培養前相同的含繼代培養基的培養皿上，可獲得1100塊直徑5_的愈傷組織團塊，增殖率達到1:36.6。
[0048]最后，需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有很多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容中直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
【權利要求】
1.顯著提高野生百合胚性愈傷組織繼代增殖率的培養方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)愈傷組織的誘導培養:在超凈工作臺上，取野生百合組培苗鱗片進行愈傷誘導培養，方法是將組培苗鱗莖的鱗片用鑷子或解剖刀剝離，將其鱗片尖端切除0.3cm，并在其近軸面用解剖刀劃I~3個創口，接種時以創口朝下接觸愈傷誘導培養基表面，愈傷誘導培養20~50天后，獲得直徑0.3~0.5cm的淺黃色、顆粒狀的胚性愈傷組織團塊，愈傷誘導率為63.3% ~79.1% ； 所述愈傷誘導培養是在完全黑暗、25°C的愈傷誘導培養條件下進行；用于接種的愈傷誘導培養基以MS培養基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養基，即每升培養基添加4.43gMS粉，所述愈傷誘導培養基中還含有濃度為0.1~2.0mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic, 2, 4-D)、0 ~1.0mg/L α -萘乙酸(1-Naphthaleneaceticacid, NAA)、濃度為 0.1 ~0.4mg/L 的 6-節氛基腺嘿呤(6-benzyladenine, 6_BA)、30g/L 的蔗糖、6~8g/L瓊脂，愈傷誘導培養基的pH值為5.8 ; (2)愈傷組織的繼代培養:愈傷誘導培養60~90天后，在超凈工作臺上用鑷子或解剖刀剔除愈傷組織團塊中褐色的老化部分，接種到新鮮的繼代培養基上；每個裝有繼代培養基的培養皿中接種20~30塊愈傷組織團塊，愈傷組織團塊的直徑在0.3~0.5cm之間，每4周繼代一次，每次繼代可獲得每月2~2.5倍的增殖率，即愈傷組織團塊經過一個月的培養，重量增加為接種時的2~2.5倍； 所述繼代培養是在完全黑暗、25 °C的繼代培養條件下進行；用于接種的繼代培養基以MS培養基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養基，即每升培養基添加4.43gMS粉，所述繼代培養基中還含有濃度為0.1~2.0mg/L的2，4_D、0~Img/La -蔡乙酸(1-Naphthaleneacetic acid, NAA)>0.1 ~0.4mg/L 的 6_ 節氛基腺嘿呤(6-benzyladenine, 6_BA)、30g/L的鹿糖、4~8g/L瓊脂,繼代培養基的pH值為5.8 ； (3)愈傷組織的擴增培養: 愈傷組織團塊在繼代培養基上繼代培養I~8個月后，將愈傷組織團塊分切成0.5cm的小塊，接種到含繼代培養基的培養皿上，依次用經過紫外滅菌的保鮮膜和錫紙包裹，然后進行30~60天的低溫處理，低溫處理條件為I~4°C，完全黑暗； 再將低溫處理后的愈傷組織團塊接種到擴增培養基上，進行弱光培養，弱光培養是指在光照100~9001ux、溫度25°C的條件下進行，且擴增培養基裝在口徑為6.35cm，高度為9.20cm的柱形瓶中； 弱光培養60天后，將擴增后的愈傷組織團塊分成0.3~0.5cm的小塊，轉接到新鮮的繼代培養基上黑暗培養，黑暗培養是指:完全黑暗，溫度25°C，繼代培養基裝在培養皿中；經過低溫處理和弱光培養后的愈傷組織團塊，即為增殖率15~36.6的愈傷組織； 所述擴增培養基以MS培養基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養基，即每升培養基添加4.43gMS粉，擴增培養基中還含有濃度為30g/L的蔗糖和4~8g/L瓊脂，擴增培養基的pH值5.8。
2.根據權利要求1所述的顯著提高野生百合胚性愈傷組織繼代增殖率的培養方法，其特征在于，步驟(3)中，包裹培養皿的錫紙和保鮮膜間填充有脫脂棉，脫脂棉用于在低溫處理和恢復常溫中保護植物材料。
【文檔編號】A01H4/00GK103798140SQ201410037346
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年1月26日 優先權日:2014年1月26日
【發明者】夏宜平, 張琳 申請人:浙江大學