專利名稱：凡納濱對蝦用復合免疫增強飼料添加劑及其應用和飼料的制作方法
技術領域：
本發明屬于水產飼料領域，具體涉及一種凡納濱對蝦用復合免疫增強飼料添加劑及其應用和含有該飼料添加劑的飼料。
背景技術：
凡納濱對奸(Litopenaeus vannamei ),俗稱南美白對奸,是當今世界奸類養殖產量最高的三大品種之一，具有抗病力強，生長速度快，食性雜，營養要求低等特點，是“海蝦淡養”的優質品種，也是中國養殖面積和產量最高的養殖品種。近年來，隨著對蝦養殖規模不斷擴大，養殖密度的不斷提高，對蝦養殖面臨著大量的問題，如擁擠、營養、環境、代謝等因子的激烈應激，導致對蝦抗應激能力差，抗病力弱，極易爆發大規模病害，從而給對蝦的養殖業造成巨大的經濟損失。目前關于水產動物的疾病防治主要是依靠抗生素等藥物，但是由于病原菌耐藥性的形成，以及食品安全等問題的提出，正確地使用抗生素等藥物及其基本的疾病防治對策尚待確立。此外，對于對蝦的病毒性疾病目前尚無有效的治療方法，只能進行諸如對養殖池的消毒和卵的清洗等一般性處理而已。研究發現，￠-葡聚糖作為單一免疫增強劑能夠通過增強對蝦的非特異性免疫來提高蝦體的免疫力和抗病力，在生產中已得到廣泛應用。但隨著研究的不斷深入，發現飼料中單一添加￠-葡聚糖時存在免疫刺激作用時間短，劑量大，長期使用時易出現免疫疲勞等問題。

發明內容
本發明的第一個目的是提供一種能有效延長P -葡聚糖的免疫刺激時間、減少其使用劑量，同時緩解單獨使用P-葡聚糖時產生免疫疲勞問題的凡納濱對蝦用復合免疫增強飼料添加劑。本發明的凡納濱對蝦用復合免疫增強飼料添加劑，其特征在于，包括￠-葡聚糖 和蛋氨酸硒，蛋氨酸硒以硒的量計算，P -葡聚糖和硒質量比為15(T300 :0. 2。所述的凡納濱對蝦用復合免疫增強飼料添加劑進一步優選還包括維生素E，^ -葡聚糖、硒和維生素E的質量比為:150^300 :0. 2 =IOO0本發明還提供了另外一種凡納濱對蝦用復合免疫增強飼料添加劑，其特征在于，包括￠-葡聚糖和維生素E，兩者質量比為150 300:100。本發明的第二個目的是提供上述凡納濱對蝦用復合免疫增強飼料添加劑在作為凡納濱對蝦的飼料添加劑的應用。本發明的第三個目的是提供一種凡納濱對蝦用復合免疫增強飼料，其特征在于，包括普通凡納濱對蝦基礎飼料和凡納濱對蝦用復合免疫增強飼料添加劑，所述的凡納濱對蝦用復合免疫增強飼料添加劑包括3-葡聚糖和蛋氨酸硒，3 -葡聚糖的添加量為15(T300mg/kg普通凡納濱對奸基礎飼料,蛋氨酸硒，以硒的量計算,其添加量為0. 2mg/kg普通凡納濱對蝦基礎飼料。所述的凡納濱對蝦用復合免疫增強飼料添加劑優選還包括維生素E，維生素E的添加量為100mg/kg普通凡納濱對奸基礎飼料。本發明的另外一種凡納濱對蝦用復合免疫增強飼料，其特征在于，包括普通凡納濱對蝦基礎飼料和凡納濱對蝦用復合免疫增強飼料添加劑，所述的凡納濱對蝦用復合免疫增強飼料添加劑包括￠-葡聚糖和維生素E，￠-葡聚糖的添加量為15(T300mg/kg普通凡納濱對蝦基礎飼料，維生素E的添加量為100mg/kg普通凡納濱對蝦基礎飼料。本發明通過實驗發現，將￠-葡聚糖與蛋氨酸硒按一定的質量比聯合添加，或者將￠-葡聚糖與維生素E按一定的質量比聯合添加，或者將3 -葡聚糖與蛋氨酸硒、維生素E按一定的質量比聯合添加到普通凡納濱對蝦基礎飼料中，通過蛋氨酸硒和維生素E的抗氧化途徑來提高凡納濱對蝦機體的免疫防御能力，能有效延長3-葡聚糖的免疫刺激時間、減少其使用劑量，同時緩解單獨使用￠-葡聚糖時產生免疫疲勞問題。本發明可直接添加到凡納濱對蝦的基礎日糧中，使用方便。


圖I是投喂對照飼料和投喂添加了不同組合添加劑的飼料的凡納濱對蝦血淋巴計數圖。圖2是投喂對照飼料和投喂添加了不同組合添加劑的飼料的凡納濱對蝦的血清酚氧化物酶活性的測定圖。圖3是投喂對照飼料和投喂添加了不同組合添加劑的飼料的凡納濱對蝦的血清溶菌酶活性的測定圖。圖4是投喂對照飼料和投喂添加了不同組合添加劑的飼料的凡納濱對蝦的白斑病毒感染試驗測定圖。圖5是投喂對照飼料和投喂添加了不同組合添加劑的飼料的凡納濱對蝦的血清總抗氧化能力的測定圖。圖6是投喂對照飼料和投喂添加了不同組合添加劑的飼料的凡納濱對蝦的血清MDA含量的測定圖。圖7是投喂對照飼料和投喂添加了不同組合添加劑的飼料的凡納濱對蝦的血清SOD活性的測定圖。
具體實施例方式以下是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。實施例I :一、飼養試驗飼料分組GO組飼料普通凡納濱對蝦基礎飼料Gl組飼料在普通凡納濱對蝦基礎飼料中添加3 -葡聚糖,添加量為每千克普通凡納濱對蝦基礎飼料300mg ^ -葡聚糖。G2組飼料在普通凡納濱對蝦基礎飼料中添加3 -葡聚糖和蛋氨酸硒，添加量為每千克普通凡納濱對奸基礎飼料300mgP -葡聚糖,0. 2mg硒，以蛋氨酸硒的形式添加。G3組飼料在普通凡納濱對蝦基礎飼料中添加3 -葡聚糖和維生素E，添加量為每千克普通凡納濱對奸基礎飼料300mg P -葡聚糖，IOOmg維生素E。G4組飼料在普通凡納濱對蝦基礎飼料中添加P -葡聚糖、硒和維生素E，添加量為每千克普通凡納濱對奸基礎飼料300mg ^ -葡聚糖,0. 2mg硒，以蛋氨酸硒的形式添加，IOOmg維生素E。G5組飼料在普通凡納濱對蝦基礎飼料中添加3 -葡聚糖、硒和維生素E，添加量為每千克普通凡納濱對奸基礎飼料150mg@ -葡聚糖,0. 2mg硒，以蛋氨酸硒的形式添加，IOOmg維生素E。選取960尾初始體重為(0. 83±0. 03)g的凡納濱對蝦，隨機分成6組，每組4個重復，每個重復40尾蝦，分別常規投喂GO組飼料、Gl組飼料、G2組飼料、G3組飼料、G4組飼料和G5組飼料，整個養殖周期為35天。飼養試驗結束時，每個缸隨機取1(T15尾蝦，用Iml 無菌注射器從對蝦頭胸甲插入心臟抽取血淋巴，合并置于無菌的Eppendorf管中，4°C下靜 置3 4h，在5°C下以10000r/min離心lOmin，吸取上清液分裝保存于_80°C冰箱中備用。二、效果檢測I、對蝦血淋巴計數血細胞總數(THC)在一定程度上反映了對蝦的免疫能力或健康狀況。在甲殼動物中，THC在抵抗病原入侵方面具有極其重要的作用，但因外界變化因素，如感染，環境脅迫，蛻皮期間內分泌變化等而發生較大變化。飼養試驗結束時，每缸隨機取5尾蝦，用ImL無菌注射器于圍心腔取血，合并置于無菌Eppendorf管中。吸取150 u L抗凝劑于Eppendorf管中，立即加入對奸血液100 y L,迅速混勻，取50 ii L抗凝的血液，加入IOmL pH 7. 3的PBS緩沖液，用細胞計數儀(Z2Coulter,BECKMAN COULTER)進行計數。試驗結果用平均值土標準差(means土SD)表示。采用SPSS13. 0軟件進行數據統計和分析，先對數據進行單因素方差分析(One-wayANOVA)，若差異顯著再作Duncan’s多重比較，P <0.05表示差異性顯著。結果如圖I所示，從圖I中可以看出，G4、G5組的血淋巴計數顯著高于GO組(P〈0. 05)，略高于Gl組。由此可見，本發明的由￠-葡聚糖與蛋氨酸硒、維生素E聯合組成的添加劑提高了對蝦的免疫能力。2、凡納濱對蝦血清酚氧化物酶(PO)活性的測定酚氧化物酶(PO)是對蝦非特異性免疫因子中具有重要作用的含銅金屬酶，可以通過酶促和非酶促反應來產生黑色素，所形成的黑色素及其代謝中間產物可抑制病原菌胞外蛋白和幾丁質酶的活性，從而殺死外來病原體，起到免疫保護作用。測定原理酚氧化物酶(PO)活力是以單位時間內其與底物的生成物引起吸光度的變化來確定的。本試驗血清樣品為實施例I中保存于_80°C冰箱中的凡納濱對蝦血清樣品。以L-多巴為底物，把IOuL血清加入96孔酶標板中，然后向各孔中加入200 ii L濃度為0. lmol/L，PH為6. 0的磷酸鹽緩沖液，最后向各樣品孔中加入IOy L濃度為0. 01mol/L的L-多巴液(購自Sigma公司),在酶標儀(550, Bio-Rad)中震蕩4次,每隔4min讀取490nm處的吸光值。酶活力以實驗條件下，0D490值每分鐘增加0. 001為一個酶活力單位。試驗結果用平均值土標準差(means土SD)表示。采用SPSS13. 0軟件進行數據統計和分析，先對數據進行單因素方差分析(One-wayANOVA)，若差異顯著再作Duncan’s多重比較，P < 0. 05表示差異性顯著。結果如圖2所示，從圖2可以看出，G4組的血清PO活性顯著高于GO組。由此可見，本發明的由￠-葡聚糖與蛋氨酸硒、維生素E聯合組成的添加劑對凡納濱對蝦能夠起到更好的免疫保護作用。3、凡納濱對蝦血清溶菌酶(LZM)活性的測定溶菌酶是由弗萊明在1922年發現的，它是一種有效的抗菌劑，全稱為1，
4-^ -N-溶菌酶，又稱作粘肽N-乙?；邗Ｋ饷富虬谫|酶。溶菌酶的殺菌機理是其作用于細菌細胞壁的粘肽層，粘肽是細菌的細胞壁主要成分。溶菌酶能切斷粘肽結構中的N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之間的P -I, 4糖苷鍵，破壞粘肽支架，使細胞壁破壞。由 于細菌細胞壁的重要功能之一是保護細菌，即抗低滲，故細菌失去細胞壁的保護作用后，在低滲環境中可發生溶解。溶菌酶的主要作用對象是革蘭氏陽性菌。測定原理溶菌酶能使革蘭氏陽性菌細胞壁溶解，尤其是對腐生菌，如溶壁微球菌最為敏感，故常以溶解溶壁微球菌為指標，對溶菌酶的活性值進行測定。本試驗血清樣品為實施例I中保存于_80°C冰箱中的凡納濱對蝦血清樣品。以溶壁微球菌凍干粉為底物，用0. lmol/LPH值為6. 4的磷酸鉀鹽緩沖溶液配成底物懸液(0D570=0. 3)。取3ml該懸液于試管內，置冰浴中，再加入50ul血清混勻，于570nm處測其初始光密度值AO值，然后將試液移入37°C水浴中保溫30min，取出后立刻置于冰浴中IOmin終止反應，測其A值。溶菌酶活力(LZM)按下式計算U= (AO-A)/A。試驗結果用平均值土標準差(means土SD)表示。采用SPSS13. 0軟件進行數據統計和分析，先對數據進行單因素方差分析(One-wayANOVA)，若差異顯著再作Duncan’s多重比較，P < 0.05表示差異性顯著。結果如圖3所示，從圖3可以看出，G2、G3、G4組的血清LSZ活性顯著高于GO組和Gl組。由此可見，本發明的由￠-葡聚糖和蛋氨酸硒聯合組成的添加劑，或由￠-葡聚糖和維生素E聯合組成的添加劑，或由3 -葡聚糖和蛋氨酸硒、維生素E三者聯合組成的添加劑能夠提高對蝦的免疫防御功能，緩解葡聚糖單獨使用時的免疫疲勞問題。4、凡納濱對蝦白斑病毒(WSSV)感染實驗測定病毒粗提液制備取帶有白斑病毒感染的病蝦肌肉0. 3g左右，剪碎混勻，按0. Ig組織加I. OmLPH為7. 4的0. 01mol/L磷酸緩沖液于勻漿器中混勻，勻漿液以10000r/min離心lOmin，取上清液，經0. 45 ii L微孔濾膜過濾，其濾液為WSSV粗提液。粗提液于2h內制備完畢。粗提液加磷酸緩沖液稀釋5倍作為注射液，用于對蝦注射感染實驗。感染試驗實驗前做預實驗，摸得最適注射量為50 U L0從實施例I的每個重復中取10尾對蝦進行感染實驗。每尾注射WSSV粗提液50 i! L，每個重復繼續投喂原來的試驗飼料，記錄3天內對蝦的累計死亡率和相對免疫保護率。相對免疫保護率=IOOX (對照組累計死亡率一實驗組累計死亡率)/對照組累計死亡率。試驗結果用平均值土標準差(means土SD)表示。采用SPSS13. 0軟件進行數據統計和分析，先對數據進行單因素方差分析(One-wayANOVA)，若差異顯著再作Duncan’s多重比較，P < 0.05表示差異性顯著。結果如圖4所示，從圖4可以看出，G2、G4、G5組的累計死亡率顯著低于GO組(P < 0. 05),略低于Gl組。
由此可見，本發明的由￠-葡聚糖和蛋氨酸硒聯合組成的添加劑，或由￠-葡聚糖和蛋氨酸硒、維生素E三者聯合組成的添加劑能夠提高對蝦的免疫防御功能，緩解3 -葡聚糖單獨使用時的免疫疲勞問題。5、凡納濱對奸血清總抗氧化能力(T-AOC)的測定機體防御體系的總抗氧化能力(T-AOC)的強弱與機體健康程度存在著密切聯系，是對機體抗氧化能力評價的一個總體指標。該防御體系有酶促與非酶促兩個體系，許多酶是以微量元素為活性中心，例如超氧化物歧化酶(S0D)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽S-轉移酶(GST)等，非酶促反應體系中主要為維生素、氨基酸和金屬蛋白質。例如VE、胡蘿卜素、VC、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、組氨酸、葡萄糖、銅藍蛋白、轉鐵蛋白、乳鐵蛋白等。這個體系的防護氧化作用主要通過消除自由基和活性氧以免引發脂質過氧化；并分解過氧化物，阻斷過氧化鏈；同時除去起催化作用的金屬離子。測定原理機體中有許多抗氧化物質，能使Fe3+還原成Fe2+，后者可與菲啉類物質形成穩固的絡合物，通過比色可測出其抗氧化能力的高低。 本試驗血清樣品為實施例I中保存于_80°C冰箱中的凡納濱對蝦血清樣品。本試驗所采用總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所(名稱總抗氧化能力(T-AOC)測試盒(100管/50樣)貨號A015)，測定步驟按說明書進行。試驗結果用平均值土標準差(means土SD)表示。采用SPSS13. 0軟件進行數據統計和分析，先對數據進行單因素方差分析(One-wayANOVA)，若差異顯著再作Duncan’s多重比較，P < 0. 05表示差異性顯著。結果如圖5所示，從圖5中看出，Gl組的T-AOC活性顯著低于G3、G5組(P < 0. 05)，略低于G2、G4組。 由此可見，蛋氨酸硒和維生素E能夠通過抗氧化途徑提高對蝦的T-AOC能力，緩解^-葡聚糖單獨添加時的免疫疲勞問題。6、凡納濱對蝦血清MDA含量的測定丙二醛(MDA)是脂質過氧化反應的主要產物，MDA的測定常常與超氧化物歧化酶(SOD)的測定相互配合，SOD活力的高低間接反應了機體清除氧自由基的能力，而MDA的高低又間接反應了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。測定原理過氧化脂質降解產物中的丙二醛可與硫代巴比妥酸縮合，形成紅色產物，在532nm處有最大吸收峰。通過比色即可求出各樣品中丙二醛的含量。本試驗血清樣品為實施例I中保存于_80°C冰箱中的凡納濱對蝦血清樣品。本試驗所用丙二醛(MDA)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所(名稱丙二醛(MDA)測試盒(100管/96樣)貨號A003-1)，按說明書進行測定。試驗結果用平均值土標準差(means土SD)表示。采用SPSS13. 0軟件進行數據統計和分析，先對數據進行單因素方差分析(One-wayANOVA)，若差異顯著再作Duncan’s多重比較，P < 0.05表示差異性顯著。結果如圖6所示，從圖6可以看出，G1、G2、G4、G5組的血清MDA含量顯著低于GO組和G3組。由此可見，本發明的￠-葡聚糖或￠-葡聚糖與蛋氨酸硒二者聯合添加或者葡聚糖與蛋氨酸硒，維生素E三者聯合添加能夠抑制脂質過氧化物的產生，從而提高機體的抗氧化能力。7、凡納濱對蝦血清SOD活性的測定
超氧化物歧化酶(SOD)對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用，其可以清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受傷害。測定原理通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統產生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現紫紅色，用可見光分光光度計測其吸光度。當被測樣品中含SOD時，則對超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時測定管的吸光度值低于對照管的吸光度值，通過公式計算可求出被測樣品中的SOD活力。本試驗血清樣品為實施例I中保存于_80°C冰箱中的凡納濱對蝦血清樣品。本試驗所用超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所(名稱超氧化物歧化酶(SOD)測試盒(酶標法)(96T)貨號A001-3)，測定步驟按說明書進行。
試驗結果用平均值土標準差(means土SD)表示。采用SPSS13. 0軟件進行數據統計和分析，先對數據進行單因素方差分析(One-wayANOVA)，若差異顯著再作Duncan’s多重比較，P < 0.05表示差異性顯著。結果如圖7所示，從圖7可以看出，G1、G2、G3組的血清T-SOD活性顯著高于GO組(P < 0. 05)，G2組的血清T-SOD活性顯著高于其他各組。由此可見，0 -葡聚糖與蛋氨酸硒二者聯合添加能有效提高機體清除自由基的能力。
權利要求
1.一種凡納濱對蝦用復合免疫增強飼料添加劑，其特征在于，包括3 -葡聚糖和蛋氨酸硒，蛋氨酸硒以硒的量計算，P -葡聚糖和硒質量比為15(T300 :0. 2。
2.根據權利要求I所述的凡納濱對蝦用復合免疫增強飼料添加劑，其特征在于，還包括維生素E，￠-葡聚糖、硒和維生素E的質量比為:150^300 :0. 2 100o
3.—種凡納濱對蝦用復合免疫增強飼料添加劑，其特征在于，包括3 -葡聚糖和維生素E，兩者質量比為150 300 =IOO0
4.權利要求1-3任意一項所述的凡納濱對蝦用復合免疫增強飼料添加劑在作為凡納濱對蝦的飼料添加劑的應用。
5.一種凡納濱對蝦用復合免疫增強飼料，其特征在于，包括普通凡納濱對蝦基礎飼料 和凡納濱對蝦用復合免疫增強飼料添加劑，所述的凡納濱對蝦用復合免疫增強飼料添加劑包括P -葡聚糖和蛋氨酸硒，^ -葡聚糖的添加量為15(T300mg/kg普通凡納濱對蝦基礎飼料，蛋氨酸硒，以硒的量計算，添加量為0. 2mg/kg普通凡納濱對奸基礎飼料。
6.根據權利要求5所述的凡納濱對蝦用復合免疫增強飼料，其特征在于，所述的凡納濱對蝦用復合免疫增強飼料添加劑還包括維生素E，維生素E的添加量為100mg/kg普通凡納濱對蝦基礎飼料。
7.—種凡納濱對蝦用復合免疫增強飼料，其特征在于，包括普通凡納濱對蝦基礎飼料和凡納濱對蝦用復合免疫增強飼料添加劑，所述的凡納濱對蝦用復合免疫增強飼料添加劑包括P -葡聚糖和維生素E，P -葡聚糖的添加量為15(T300mg/kg普通凡納濱對蝦基礎飼料,維生素E的添加量為100mg/kg普通凡納濱對蝦基礎飼料。
全文摘要
本發明公開了一種凡納濱對蝦用復合免疫增強飼料添加劑及其應用和飼料。所述的凡納濱對蝦用復合免疫增強飼料添加劑包括β-葡聚糖和蛋氨酸硒，蛋氨酸硒以硒的量計算，β-葡聚糖和硒質量比為150~3000.2。本發明通過實驗發現，將β-葡聚糖與蛋氨酸硒按一定的質量比聯合添加，或者將β-葡聚糖與維生素E按一定的質量比聯合添加，或者將β-葡聚糖與蛋氨酸硒、維生素E按一定的質量比聯合添加到普通凡納濱對蝦基礎飼料中，通過蛋氨酸硒和維生素E的抗氧化途徑來提高凡納濱對蝦機體的免疫防御能力，能有效延長β-葡聚糖的免疫刺激時間、減少其使用劑量，同時緩解單獨使用β-葡聚糖時產生免疫疲勞問題。本發明可直接添加到凡納濱對蝦的基礎日糧中，使用方便。
文檔編號A23K1/18GK102742729SQ20121020655
公開日2012年10月24日 申請日期2012年6月20日 優先權日2012年6月20日
發明者劉群芳, 曹俊明, 王國霞, 黃燕華 申請人:廣東省農業科學院畜牧研究所, 廣州飛禧特水產科技有限公司