專利名稱：一種低筋小麥種質(zhì)創(chuàng)制新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種培育低筋小麥的方法，特別涉及一種通過(guò)轉(zhuǎn)Glu-IEbX基因獲得穩(wěn)定遺傳的共抑制HMW-GS表達(dá)的低筋小麥品種的方法。
背景技術(shù)：
小麥?zhǔn)鞘澜缟现匾娜蠹Z食農(nóng)作物(小麥、水稻和玉米)之一。小麥種子儲(chǔ)藏蛋白占種子總蛋白的50%左右，它們的結(jié)構(gòu)和特性對(duì)面粉加工品質(zhì)起著重要的作用。小麥面筋蛋白主要由醇溶蛋白和麥谷蛋白組成，分別決定面團(tuán)的延展性(extensibility)和彈性(elasticity)。麥谷蛋白為多聚體,是多個(gè)亞基通過(guò)二硫鍵相互交聯(lián)而形成的,分子質(zhì)量高達(dá)幾百萬(wàn)道爾頓(Da)。經(jīng)等電聚焦和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分 離后，麥谷蛋白明顯地分成2種類型，即高分子量麥谷蛋白亞基(high-molecular-weightglutenin subunit, HMW-GS)和低分子量麥谷蛋白亞基(low-molecular-weight gluteninsubunit，LMW-GS)，分子質(zhì)量分別約為60 90kDa和34 54kDa。高分子量麥谷蛋白亞基平均占種子總蛋白的12%左右，相當(dāng)于面粉干重的I. 0% I. 7%，其數(shù)量和質(zhì)量對(duì)小麥面筋特性及面粉烘烤品質(zhì)起著重要作用。優(yōu)質(zhì)弱筋小麥適合制作餅干、糕點(diǎn)等食品。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展，餅干、糕點(diǎn)的需求量快速增長(zhǎng)，與此相適應(yīng)，優(yōu)質(zhì)弱筋小麥的需求量也將持續(xù)增加。經(jīng)過(guò)十幾年的工作，我國(guó)已育成了一批優(yōu)質(zhì)弱筋小麥，但在育種、生產(chǎn)中仍存在一定的問(wèn)題優(yōu)異親本資源缺乏；品質(zhì)穩(wěn)定性差；加工品質(zhì)仍需改良；綜合性狀有待進(jìn)一步提高。目前，我國(guó)優(yōu)質(zhì)低筋小麥缺口很大，仍依靠從美國(guó)、澳大利亞、加拿大等國(guó)家進(jìn)口以滿足國(guó)內(nèi)食品加工需求。我國(guó)低筋小麥主產(chǎn)區(qū)集中在淮河以南的長(zhǎng)江沿線。我國(guó)培育低筋小麥的主要途徑是常規(guī)雜交育種，利用南方小麥生態(tài)區(qū)品種的低筋和低蛋白特性開(kāi)展育種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種培育低筋小麥的方法。本發(fā)明所提供的培育低筋小麥的方法包括如下步驟將Glu-IEbX基因轉(zhuǎn)入目的小麥中，獲得與所述目的小麥相比，面筋強(qiáng)度降低的轉(zhuǎn)基因小麥。在實(shí)際應(yīng)用中，所述培育低筋小麥的方法還包括如下步驟將所述轉(zhuǎn)基因小麥與面筋強(qiáng)度待降低小麥進(jìn)行雜交，獲得面筋強(qiáng)度低于所述面筋強(qiáng)度待降低小麥的雜交小麥(Fl代小麥)。在實(shí)際應(yīng)用中，所述培育低筋小麥的方法還包括如下步驟將所述雜交小麥(Fl代小麥)與所述面筋強(qiáng)度待降低小麥(受體親本)進(jìn)行連續(xù)回交，獲得回交后代。回交的目的是為了增大受體親本優(yōu)良農(nóng)藝性狀基因在回交后代中的比例，其理想狀態(tài)為回交后代能夠保留受體親本自身的所有優(yōu)良性狀。在實(shí)際應(yīng)用中，所述方法還包括將所述回交后代進(jìn)行自交的步驟。自交是為了在具備受體親本優(yōu)良性狀的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步得到低筋純合小麥，從而保證低筋這一性狀在自交后代中能夠穩(wěn)定遺傳。在本發(fā)明中，所述面筋強(qiáng)度具體體現(xiàn)在濕面筋含量、穩(wěn)定時(shí)間和谷蛋白大聚合體(GMP)積累速率上。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育谷蛋白大聚合體(GMP)積累速率降低的小麥的方法。該方法包括如下步驟將Glu-I EbX基因轉(zhuǎn)入目的小麥中，獲得與所述目的小麥相t匕，谷蛋白大聚合體積累速率降低的轉(zhuǎn)基因小麥。在實(shí)際應(yīng)用中，所述培育谷蛋白大聚合體(GMP)積累速率降低的小麥的方法，還包括如下步驟將所述轉(zhuǎn)基因小麥與谷蛋白聚合體積累速率待降低小麥雜交，獲得谷蛋白聚合體積累速率低于所述谷蛋白聚合體積累速率待降低小麥的雜交小麥(Fl代小麥)。在上述雜交的基礎(chǔ)上，所述方法中還包括將所述雜交小麥(Fl代小麥)與所述谷蛋白聚合體積累速率待降低小麥進(jìn)行連續(xù)回交，獲得回交后代的步驟。在上述回交的基礎(chǔ)上，所述方法中還包括將所述回交后代進(jìn)行自交的步驟。在本發(fā)明中，所有所述的谷蛋白大聚合體(GMP)均指小麥胚乳中的谷蛋白并不是以單個(gè)分子存在，而是高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)和低分子量谷蛋白亞基(LMW-GS)通過(guò)二硫鍵形成大小不同的聚合體。其中，不溶于SDS的谷蛋白聚合體分子量較大，稱為谷蛋白大聚合體(glutenin macro-polymer, GMP)。上述所有的Glu-IEbX基因均可編碼序列表中序列2所示的多肽。序列2由604個(gè)
氨基酸組成。所述Glu-IEbX基因的編碼序列是序列表中序列I (GenBank :AY525782的第955-2772位)或序列I的第1-1815位。序列I含有兩個(gè)終止密碼子，共由1818個(gè)核苷酸組成。上述所有所述將Glu-IEbX基因轉(zhuǎn)入目的小麥，具體可為將所述Glu-IEbX基因以重組表達(dá)載體的方式導(dǎo)入所述目的小麥。所述重組表達(dá)載體中啟動(dòng)所述Glu-IEbx基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為CaMV35S啟動(dòng)子，更為具體的，所述重組表達(dá)載體為在pCAMBIA3301載體的多克隆位點(diǎn)出插入所述Glu-IEbX基因，得到的重組質(zhì)粒；所述多克隆位點(diǎn)具體為Xba I和Sac I酶切位點(diǎn)。上述所有的目的小麥均具體為小麥品種藁城8901 ;所述面筋強(qiáng)度待降低小麥和所述谷蛋白聚合體積累速率待降低小麥均具體為小麥品種小偃54、金麥I號(hào)、豐優(yōu)I號(hào)和藁城8901中的任一種。實(shí)驗(yàn)證明，通過(guò)轉(zhuǎn)Glu-IEbX基因可以獲得穩(wěn)定遺傳的共抑制HMW-GS表達(dá)的小麥材料，將其作為育種遺傳材料對(duì)其他綜合性狀表現(xiàn)好的小麥材料進(jìn)行雜交或回交，可獲得面筋強(qiáng)度降低的小麥新種質(zhì)。這將有利于創(chuàng)造適合餅干和糕點(diǎn)加工的優(yōu)質(zhì)低筋小麥。


圖I為T(mén)tl代Glu-IEbX轉(zhuǎn)基因小麥Lg-I的種子的SDS-PAGE分析結(jié)果。其中，泳道I和泳道10為野生型小麥品種藁城8901的種子；泳道2-9為T(mén)tl代Glu-IEbX轉(zhuǎn)基因小麥Lg-I的8粒種子。圖2為T(mén)1代Glu-IEbX轉(zhuǎn)基因小麥Lg_l_l的種子的SDS-PAGE分析結(jié)果。其中，泳道B為野生型小麥品種藁城8901的種子；泳道1-5為隨機(jī)選取的T1代Glu-IEbx轉(zhuǎn)基因小麥Lg-I-I的5粒種子。圖3為T(mén)3代轉(zhuǎn)Glu-IEbX基因小麥Lg-l_l_3種子的HMW-GS的RP-HPLC分析結(jié)果。其中，A為野生型小麥品種藁城8901的種子；B為T(mén)3代Glu-IEbx轉(zhuǎn)基因小麥Lg_l-1_3的種子。圖4為T(mén)1代Glu-IEbX轉(zhuǎn)基因小麥Lg_l_l的種子的Western雜交分析結(jié)果。其中，泳道I和泳道7為野生型小麥品種藁城8901的種子；泳道2-6為圖2中隨機(jī)選取的T1代Glu-IEbx轉(zhuǎn)基因小麥Lg-I-I的5粒種子；泳道8為小麥品種中國(guó)春的種子。圖5為雜交F1代小麥種子的SDS-PAGE分析結(jié)果。其中，泳道I為野生型小麥品種藁城8901 ;泳道2為L(zhǎng)g-I-IX野生型小麥品種藁城8901 ;泳道3為野生型小麥品種藁 城8901 XLg-I-I ;泳道4為小偃54XLg-I-I ;泳道5為金麥I號(hào)XLg-I-I ;泳道6為金麥I號(hào)；泳道7為小偃54。泳道2-5中，X表不雜交，X前的小麥品種作為母本；X后的小麥品種作為父本。圖6為雜交F1代小麥種子的Western雜交分析結(jié)果。其中，泳道I為小麥品種中國(guó)春；泳道2為野生型小麥品種藁城8901 ;泳道3為L(zhǎng)g-I-IX野生型小麥品種藁城8901 ；泳道4為野生型小麥品種藁城8901 XLg-I-I ;泳道5為小偃54XLg-l-l ;泳道6為金麥I號(hào)XLg-I-I ;泳道7為金麥I號(hào)；泳道8為小偃54。泳道3-6中，X表示雜交，X前的小麥品種作為母本；X后的小麥品種作為父本。圖7為回交一代小麥種子的SDS-PAGE分析結(jié)果。其中，A為金麥I號(hào)X (金麥I號(hào)XLg-I-I)子代的檢測(cè)結(jié)果；B為豐優(yōu)I號(hào)X (豐優(yōu)I號(hào)XLg-I-I)子代的檢測(cè)結(jié)果。A中，泳道I為作為對(duì)照的小麥品種藁城8901 ;泳道2-9為金麥I號(hào)X(金麥I號(hào)XLg-I-I)子代的全部8粒種子；泳道10為小麥品種金麥I號(hào)。B中，泳道I為作為對(duì)照的小麥品種藁城8901 ;泳道2-9為豐優(yōu)I號(hào)X (豐優(yōu)I號(hào)XLg-I-I)子代的全部8粒種子；泳道10為小麥品種豐優(yōu)I號(hào)。圖8為HMW-GS全部缺失的T3代轉(zhuǎn)基因材料和T4代轉(zhuǎn)基因材料與未突變材料藁城8901的小麥花后GMP積累特性分析結(jié)果。其中，野生型對(duì)照指小麥品種藁城8901。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。pAHC25 載體Rita Abranches, Ana P. Santos, Eva Wegel, SarahWilliams, Alexandra Castilho，Paul Christou，Peter Shaw,Eva Stoger. Widelyseparated multiple transgene integration sites in wheat chromosomes are broughttogether at interphase. The Plant Journal(2000)24 (6)，713-723.pCAMBIA3301載體購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司(目錄號(hào)MCV039)。小麥品種藁城8901 :劉霞，王振林.藁城8901和山農(nóng)1391淀粉合成酶活性和淀粉組分積累特征的比較.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38(05) :897-903.小麥品種中國(guó)春劉登才，鄭有良，蘭秀錦.小麥中國(guó)春遺傳背景的育種改良.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003,36 (11) :1383-1389.
小麥品種小偃54 :張曉霞，焦湞，董振營(yíng)，李世明，王燃，凌宏清，秦廣雍，王道文.普通小麥品種小偃54中a/￠-醇溶蛋白編碼基因的克隆與序列分析.作物學(xué)報(bào)，2011,37 (8) :1497-1502.小麥品種金麥I號(hào)張國(guó)叢，班進(jìn)福，劉彥軍.河北省小麥面粉及加工制品色澤研究.麥類作物學(xué)報(bào)，2011，31 (3) =462-468.小麥品種豐優(yōu)I號(hào)石明，姜紫勤，李言益.豐產(chǎn)抗病小麥新品種“豐優(yōu)1，2號(hào)”特征特性與產(chǎn)量表現(xiàn).耕作與栽培，2003，4 21.實(shí)施例I、轉(zhuǎn)Glu-IEbX基因小麥的獲得及其HMW-GS的鑒定一、重組表達(dá)載體 pCAMBIA3301-Glu_lEbx 的構(gòu)建以來(lái)源于百薩偃麥草(Thinopyrumbessarabicum)的 Glu-IEbX 基因(GenBank : AY525782，序列I)為模板，以上游引物和下游引物作為兼并性引物，擴(kuò)增得到兩端分別帶有酶切位點(diǎn)Xba I和Sac I的Glu-IEbX基因片段。上游引物5'-GACTCTAGAATGGCTAAGCGGC/TTA/GG-3'(下劃線部分為 Xba I 的識(shí)別位點(diǎn)，其后的序列為序列I的第I-第25位)下游引物5'-CGGAGCTCGCTATCACTGGCTG/AGCC-3'(下劃線部分為 Sac I 的識(shí)別位點(diǎn)，第10-27位為序列I的第1794-1818位的反向互補(bǔ)序列)利用Xba I和Sac I雙酶切PCR產(chǎn)物后，將其連接到經(jīng)過(guò)同樣酶切的pCAMBIA3301的骨架片段上，形成重組質(zhì)粒。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，將經(jīng)過(guò)測(cè)序表明含有序列表中序列I所示 Glu-IEbX 基因的重組質(zhì)粒命名為 pCAMBIA3301-Glu-IEbX。pCAMBIA3301-Glu_lEbx 中，啟動(dòng)所述Glu-IEbx基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為CaMV35S啟動(dòng)子。二、轉(zhuǎn)Glu-IEbX基因小麥的獲得I、以重組表達(dá)載體pCAMBIA3301-Glu-IEbX轉(zhuǎn)化小麥將步驟一 I中構(gòu)建的重組表達(dá)載體pCAMBIA3301-Glu-IEbX和pAHC25載體用基因槍轟擊的方法共轉(zhuǎn)化小麥品種藁城8901的幼胚。同時(shí)設(shè)置轉(zhuǎn)入pCAMBIA3301空載體為對(duì)照。由于PAHC25載體上含有bar基因，可以作為抗除草劑雙丙氨磷(PPT)的篩選標(biāo)記。將轉(zhuǎn)化后的小麥幼胚置于含有雙丙氨磷(PPT)的篩選培養(yǎng)基(1/2MS培養(yǎng)基中加A PPT,使PPT終濃度為4mg/L)上進(jìn)行篩選，獲得Ttl代抗PPT的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。對(duì)上述獲得的抗雙丙氨磷的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株進(jìn)行PCR分子鑒定，以上述獲得的抗除草劑的轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA為模板，以上述步驟一所述上游引物和所述下游引物所組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將其中一個(gè)經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增得到大小為1800bp左右的目的條帶的轉(zhuǎn)Glu-IEbx基因植株命名為L(zhǎng)g-I。三、轉(zhuǎn)基因小麥種子中HMW-GS表達(dá)情況的鑒定I、SDS-PAGE檢測(cè)Ttl代Glu-IEbX轉(zhuǎn)基因小麥Lg-I的種子中HMW-GS表達(dá)情況收獲步驟二獲得的Ttl代轉(zhuǎn)基因小麥Lg-I的所有種子，提取麥谷蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析Glu-IEbX轉(zhuǎn)基因小麥Lg-I的種子中高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)的表達(dá)情況。同時(shí)以野生型小麥品種藁城8901的種子作為內(nèi)源HMW-GS正常表達(dá)的對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。其中，麥谷蛋白的提取操作如下(1)取單粒種子的胚乳端半粒，將其研磨成細(xì)粉末(大約20mg)。(2)用Iml溶液A (50%正丙醇V/V)在65°C提取醇溶蛋白30分鐘，其間震蕩2次以上，12000rpm離心I分鐘，棄上清。(3)重復(fù)步驟(2)兩次。(4)用0. 5ml上述溶液A洗滌沉淀，12000rpm離心5分鐘，棄上清。(5)用0. Iml含有新加入1% (W/V) 二硫蘇糖醇(DTT)的溶液B (50%V/V正丙醇，0.08M Tris-HCl, pH 8.0)，65°C孵育lh，對(duì)蛋白進(jìn)行還原。(6)12000rpm離心5分鐘后，加入0. Iml混勻的含有新加入I. 4% (V/V)4-乙烯批唳(4-vinylpyridine)的上述溶液B ,孵化15分鐘進(jìn)行蛋白質(zhì)燒基化。(7) 12000rpm離心2分鐘，取上清液即為麥谷蛋白樣品。SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖I所示，Ttl代Glu-IEbX轉(zhuǎn)基因小麥的種子中所有的高分子量麥谷蛋白亞基都不表達(dá)，這不僅包括受體野生型小麥品種藁城8901內(nèi)源的1Ax2*、1Bx7、lBy9、lDx5和IDylO五個(gè)亞基，而且轉(zhuǎn)化的Glu-EbX基因也未表達(dá)。2、反向高效液相色譜檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小麥中HMW-GS表達(dá)情況將步驟二獲得的Ttl代轉(zhuǎn)基因小麥Lg-I進(jìn)行兩次自交繁殖，獲得T3代轉(zhuǎn)基因小麥Lg-1-1-3-5。對(duì)T3代Glu-EbX轉(zhuǎn)基因小麥Lg-l_l-3_5的種子(HMW-GS缺失的種子)進(jìn)行反 向高效液相色譜(RP-HPLC)進(jìn)一步檢測(cè)T3R轉(zhuǎn)基因小麥的種子中HMW-GS的表達(dá)情況，同時(shí)以野生型小麥品種藁城8901的種子作為內(nèi)源HMW-GS正常表達(dá)的對(duì)照。實(shí)驗(yàn)中對(duì)于每個(gè)樣品采用從該種小麥多粒種子混合提取的HMW-GS樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。具體操作如下小麥HMW-GS的提取稱取全麥粉0. Ig于2mL離心管中，加入I. OmL提取液A(NaCl的終濃度為0. 4mol L-1，NaKHPO4的終濃度為0. 067mol L-1，pH=7. 6)，漩渦振蕩2min后，在 20°C下用恒溫混合器(Eppendorf Thermomixer comfort)振蕩 IOmin后，7000r/min 離心15min，連續(xù)提取2次，棄上清液。沉淀物中加入ImL提取液B (60% (v/v)乙醇溶液)，漩渦振蕩2min,在20°C下用恒溫混合器振蕩IOmin后,7000r/min離心20min,連續(xù)提取2次,棄去上清液。沉淀物中加入I. OmL提取液C (50% (v/v)正丙醇，尿素的終濃度為2mol L—1，Tris-HCl 的終濃度為 0. 05mol .L_l，1% (w/v) DTT，pH7. 5)，漩渦振蕩 2min 后，在 60°C下用恒溫混合器振蕩20min,懸浮液在20°C恒溫下7000r/min離心20min,連續(xù)提取2次,收集上清液。樣品測(cè)定前過(guò)0. 45 ii m濾膜，在上樣前后分別注入0. 5mL 0. 1% (v/v)三氟乙酸溶液，進(jìn)樣體積為100 Ii Lo色譜系統(tǒng)為美國(guó)Waters 公司生產(chǎn) 1525Binary HPLC pump+996 photodiodearray detector,樣品環(huán)體積為2mL,工作站軟件為Empower,色譜柱為Nucleosil 300-5C8柱(250_X4. 6_)。洗脫系統(tǒng)A液(三氟乙酸+H2O (0. 1%，v/v))，B液(乙腈+三氟乙酸(99. 9/0. 1，v/v))。洗脫梯度0min 24%B液，50min 56%B液，柱溫為53 °C，流速為ImL mirT1，吸收波長(zhǎng)為210nm。每個(gè)樣品進(jìn)行完畢，用90%B液洗脫5min，用初始B液平衡IOmin0實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。結(jié)果如圖3所示，與作為內(nèi)源HMW-GS正常表達(dá)的野生型小麥品種藁城8901對(duì)照的種子相比，T3代Glu-Ebx轉(zhuǎn)基因小麥的種子沒(méi)有明顯的峰檢出，HMW-GS含量接近于O。四、轉(zhuǎn)基因小麥后代遺傳規(guī)律分析將步驟二獲得的Ttl代Glu-IEbX轉(zhuǎn)基因小麥進(jìn)行自交繁殖，獲得T1代轉(zhuǎn)Glu-IEbX基因小麥，將其中一個(gè)轉(zhuǎn)基因株系命名為L(zhǎng)g-I-I。對(duì)1\代轉(zhuǎn)基因株系Lg-I-I所結(jié)種子的麥谷蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析。同時(shí)以野生型小麥品種藁城8901的種子作為內(nèi)源HMW-GS正常表達(dá)的對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。其中麥谷蛋白的提取方法同步驟三I中所述。結(jié)果顯示，T1代轉(zhuǎn)基因株系Lg-I-I的全部種子，1Ax2*、!Bx7UBy9UDx5和IDylO五個(gè)亞基的編碼基因以及轉(zhuǎn)化的Glu-Ebx基因均沉默(圖2)，SDS-PAGE電泳沒(méi)有檢測(cè)到編碼蛋白。進(jìn)一步利用HMW-GS多克隆抗體(HMW-GS多克隆抗體由中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所王道文老師惠贈(zèng)，其制備過(guò)程參見(jiàn)Wan Y，Liu K，Wang D, ShewryPR. High-molecular-weight glutenin subunits in the Cylindropyrum and Vertebratasection of the Aegilops genus and identification of subunits related to thoseencoded by the Dx alleles of common wheat. Theor Appl Genet, 101:879-884.),對(duì) T1代Lg-I-I的種子麥谷蛋白進(jìn)行Western雜交，以小麥品種中國(guó)春和藁城8901的種子作為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。其中麥谷蛋白的提取方法同步驟三I中所述。結(jié)果如圖4所示，用HMW-GS多克隆抗體，對(duì)T1代轉(zhuǎn)基因株系Lg_l_l種子蛋白進(jìn)行Western雜交，非轉(zhuǎn)基因小麥種子麥谷蛋白與HM W-GS多克隆抗體表現(xiàn)出很強(qiáng)的雜交信號(hào)(lDx2、lBx7、lBy8和lDyl2亞基)，而轉(zhuǎn)基因小麥種子麥谷蛋白與該多抗無(wú)反應(yīng)信號(hào)，獲得了與SDS-PAGE相同的結(jié)果。以上SDS-PAGE和Western雜交的結(jié)果均表明對(duì)于通過(guò)轉(zhuǎn)化Glu-EbX基因來(lái)沉默高分子量麥谷蛋白不同亞基的編碼基因的基因沉默可以穩(wěn)定遺傳。實(shí)施例2、通過(guò)雜交獲得低筋小麥品種一、雜交小麥和回交后代的獲得及其HMW-GS表達(dá)情況的鑒定I、HMW-GS完全缺失小麥新種質(zhì)的獲得及其HMW-GS表達(dá)情況的鑒定以實(shí)施例I獲得的T1代Lg-I-I為父本，分別用受體野生型小麥品種藁城8901、小麥品種小偃54和金麥I號(hào)為母本進(jìn)行雜交；以及用T1RLg-I-I為母本，以野生型小麥品種藁城8901為父本進(jìn)行反交。對(duì)上述四個(gè)組合雜交后代的種子一方面進(jìn)行SDS-PAGE電泳，另一方面進(jìn)行Western雜交，從而分析HMW-GS的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)操作方法參見(jiàn)實(shí)施例I相關(guān)內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。SDS-PAGE結(jié)果如圖5所示，四個(gè)雜交后代(Fl代)種子的HMW-GS基因(1Ax2*、lBx7、lBy9、lDx5和IDylO五個(gè)亞基的編碼基因以及轉(zhuǎn)化的Glu-EbX基因)全部沉默。Western雜交結(jié)果(圖6)進(jìn)一步證實(shí)了 SDS-PAGE的結(jié)果。再將上述四個(gè)雜交后代(Fl)各自進(jìn)行自交，獲得F2代。采用同樣的SDS-PAGE和Western雜交對(duì)F2代的種子進(jìn)行HMW-GS表達(dá)情況的分析，結(jié)果顯示，F(xiàn)2代種子呈3:1分離(沉默不沉默)。這一結(jié)果表明該基因沉默呈現(xiàn)顯性效應(yīng)。2、回交后代的獲得及其HMW-GS表達(dá)情況的鑒定以實(shí)施例I獲得的T1代Lg-I-I為供體親本，分別用金麥I號(hào)和豐優(yōu)I號(hào)為受體親本進(jìn)行雜交；再將雜交后代與各自的受體親本進(jìn)行回交，獲得回交一代。對(duì)上述回交一代的種子進(jìn)行SDS-PAGE電泳，從而分析HMW-GS的表達(dá)情況。同時(shí)設(shè)置內(nèi)源HMW-GS正常表達(dá)的野生型小麥品種藁城8901作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)操作方法參見(jiàn)實(shí)施例I相關(guān)內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。SDS-PAGE結(jié)果如圖7所示，回交一代的種子呈現(xiàn)I :1的分離比，即有一半種子HMW-GS基因(1Ax2*、lBx7UBy9UDx5和IDylO五個(gè)亞基的編碼基因以及轉(zhuǎn)化的Glu-EbX基因)全部沉默，一半種子恢復(fù)正常表達(dá)HMW-GS。二、雜交小麥和回交后代的面筋品質(zhì)鑒定
I、對(duì)谷蛋白大聚合體GMP的積累隨發(fā)育進(jìn)程做發(fā)育動(dòng)態(tài)分析谷蛋白大聚合體(GMP)對(duì)面筋的彈性起著重要作用，其數(shù)量與面團(tuán)強(qiáng)度成正相關(guān)。以實(shí)施例I獲得的T1代Lg-I-I進(jìn)行連續(xù)自交后，獲得的T3代和T4代HMW-GS完全缺失株系為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)谷蛋白大聚合體GMP的積累隨發(fā)育進(jìn)程做發(fā)育動(dòng)態(tài)分析。同時(shí)以野生型小麥品種藁城8901作為對(duì)照。具體操作如下分別在開(kāi)花后5、10、15、20、25、30和35天取同一穗位籽粒，烘干后磨粉，稱0. Ig的面粉，加入0. 8ml 50% (v/v)正丙醇,在 室溫下提取30min,并間隔振蕩；5000r/min離心3min，去上清，去除清蛋白、球蛋白，重復(fù)提取2次。將50PI (50% (v/v)正丙醇不溶性蛋白)沉淀用含1% (v/v) DTT的50% (v/v)正丙醇0. 8ml于60°C水浴振蕩提取lh，16000r/min離心lOmin，重復(fù)提取2次，合并上清液為50PDS (含1% (v/v) DTT的50% (v/v)正丙醇可溶性蛋白)。取0. Iml樣品上清液(50PDS)加5ml考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，在紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Agilent，8453型)上于595nm波長(zhǎng)進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)比色，測(cè)定吸收值。計(jì)算GMP的質(zhì)量百分含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。結(jié)果如圖8所示，HMW-GS全部缺失的T3代和T4代轉(zhuǎn)基因材料相比對(duì)照材料來(lái)說(shuō)，GMP的含量大大降低。在開(kāi)花后第5-10天內(nèi)，HMW-GS全部缺失材料與對(duì)照材料的GMP含量基本一致，從開(kāi)花10天后，對(duì)照材料GMP的積累速率明顯高于HMW-GS全部缺失材料，對(duì)照材料從開(kāi)花后10-25天和30-35天分別有兩個(gè)快速積累的階段，而HMW-GS全部缺失材料的GMP積累速率變化不明顯。對(duì)照材料開(kāi)花后35天，GMP含量達(dá)到9. 2%，而HMW-GS全部缺失材料的GMP含量只有4. 1%。這說(shuō)明高分子量麥谷蛋白(HMW-GS)缺失極大的影響小麥籽粒中GMP的積累水平，從而對(duì)小麥的蛋白含量和加工特性產(chǎn)生較大的影響。2、小麥加工品質(zhì)特性的檢測(cè)將實(shí)施例I獲得的T1代Lg-I-I進(jìn)行連續(xù)自交后，獲得的T3代的轉(zhuǎn)基因材料。將其中一個(gè)轉(zhuǎn)基因株系Lg-1-1-3-5，及其與藁城8901回交獲得回交后代，通過(guò)SDS-PAGE和Western blot技術(shù)(實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例I)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)所述Lg_l-l-3_5和所述回交后代為HMW-GS缺失材料。以所述T3轉(zhuǎn)基因后代Lg-1-1-3-5以及所述回交后代為實(shí)驗(yàn)材料，研究HMW-GS缺失對(duì)小麥加工品質(zhì)特性的影響。同時(shí)以野生型小麥品種藁城8901作為對(duì)照。具體操作如下測(cè)定各品質(zhì)指標(biāo),用Brabender senior實(shí)驗(yàn)?zāi)ブ品郏话磭?guó)標(biāo)GB5511-85半微量凱氏定氮法測(cè)定籽粒粗蛋白含量；用瑞典Falling Number公司2100型洗面筋儀測(cè)定籽粒面粉濕面筋含量；沉降值測(cè)定采用3. 2g面粉按照AA-CC標(biāo)準(zhǔn)56-61A機(jī)械震蕩法；按AA-CC方法54-21,用德國(guó)Brabender公司粉質(zhì)儀測(cè)定包括面團(tuán)吸水率、形成時(shí)間、穩(wěn)定時(shí)間、評(píng)價(jià)值等指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。結(jié)果如表I所示，與對(duì)照材料相比，所述Lg-1-1-3-5的濕面筋含量、沉降值、形成時(shí)間、穩(wěn)定時(shí)間等指標(biāo)有大幅度的降低，濕面筋含量由31. 0%下降到3%，沉降值由28. 8%下降到7%左右，形成時(shí)間由6分鐘下降到0. 3分鐘，穩(wěn)定時(shí)間由7分鐘下降到0. 6分鐘。所述回交后代(藁城8901XLg-l-l-3-5)的情況基本相同，其面筋含量、穩(wěn)定時(shí)間急劇下降，有利于創(chuàng)造適合餅干和糕點(diǎn)加工的優(yōu)質(zhì)低筋小麥。表I HMW-GS缺失材料面團(tuán)流變學(xué)特性
權(quán)利要求
1.一種培育低筋小麥的方法，包括如下步驟將Glu-IEbX基因轉(zhuǎn)入目的小麥中，獲得與所述目的小麥相比，面筋強(qiáng)度降低的轉(zhuǎn)基因小麥。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述方法還包括如下步驟將所述轉(zhuǎn)基因小麥與面筋強(qiáng)度待降低小麥進(jìn)行雜交，獲得面筋強(qiáng)度低于所述面筋強(qiáng)度待降低小麥的雜交小麥。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述方法還包括如下步驟將所述雜交小麥與所述面筋強(qiáng)度待降低小麥進(jìn)行回交，獲得回交后代。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述方法還包括將所述回交后代進(jìn)行自交的步驟。
5.一種培育谷蛋白大聚合體積累速率降低的小麥的方法，包括如下步驟^fGlu-IEbx基因轉(zhuǎn)入目的小麥中，獲得與所述目的小麥相比，谷蛋白大聚合體積累速率降低的轉(zhuǎn)基因小麥。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述方法還包括如下步驟將所述轉(zhuǎn)基因小麥與谷蛋白聚合體積累速率待降低小麥雜交，獲得谷蛋白聚合體積累速率低于所述谷蛋白聚合體積累速率待降低小麥的雜交小麥。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述方法還包括如下步驟將所述雜交小麥與所述谷蛋白聚合體積累速率待降低小麥進(jìn)行回交，獲得回交后代。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述方法中還包括將所述回交后代進(jìn)行自交的步驟。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述Glu-IEbx基因的編碼序列為序列表中序列1，或序列I的第1-1815位。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于將所述Glu-IEbx基因轉(zhuǎn)入目的小麥中為通過(guò)重組表達(dá)載體將所述Glu-IEbx基因?qū)胨瞿康男←溨校鲋亟M表達(dá)載體中啟動(dòng)所述Glu-IEbx基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為CaMV35S啟動(dòng)子。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種培育低筋小麥的方法。本發(fā)明所提供的培育低筋小麥品種的方法包括如下步驟將Glu-1Ebx基因轉(zhuǎn)入目的小麥中，獲得與所述目的小麥相比面筋強(qiáng)度降低的轉(zhuǎn)基因小麥；所述方法還包括將所述轉(zhuǎn)基因小麥與面筋強(qiáng)度待降低小麥進(jìn)行雜交，獲得面筋強(qiáng)度低于所述面筋強(qiáng)度待降低小麥的雜交小麥的步驟；將所述雜交小麥與所述面筋強(qiáng)度待降低小麥進(jìn)行回交，獲得回交后代的步驟；以及將所述回交后代進(jìn)行自交的步驟。實(shí)驗(yàn)證明，通過(guò)轉(zhuǎn)Glu-1Ebx基因可以獲得穩(wěn)定遺傳的共抑制HMW-GS表達(dá)的小麥材料，將其作為育種遺傳材料對(duì)其他綜合性狀表現(xiàn)好的小麥材料進(jìn)行回交，可獲得面筋強(qiáng)度降低的小麥新種質(zhì)。這將有利于創(chuàng)造適合餅干和糕點(diǎn)加工的優(yōu)質(zhì)低筋小麥。
文檔編號(hào)A01H1/02GK102732557SQ201210223998
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月28日
發(fā)明者劉茜, 張穎君, 李輝, 胡夢(mèng)蕓 申請(qǐng)人:河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所