專利名稱：矮牽牛離體莖尖的超低溫保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物種質(zhì)資源的超低溫保存方法，具體地說(shuō)，涉及一種矮牽牛離體莖尖的超低溫保存方法。
背景技術(shù)：
矮牽牛(PetuniaXhybrida Vilm.),別名靈芝牡丹、碧冬爺、撞羽朝顏等，為爺科(Solanaceae)矮牽牛屬花丼。矮牽牛為多年生草本雙子葉植物，常作一、二年生栽培，株高15 80cm不等；葉片呈現(xiàn)橢圓或卵圓狀；營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期短，當(dāng)年可開(kāi)花，花期可長(zhǎng)達(dá)數(shù)月之久；花冠呈現(xiàn)喇叭狀(類似牽牛花)；花瓣邊緣類型有平瓣、波狀瓣、鋸齒瓣等；花色有紫、紅、白、 粉及鑲嵌、網(wǎng)紋、條紋等；果實(shí)為尖圓形蒴果，種子極小，千粒重約0. Ig (費(fèi)硯良，劉青林，葛紅等.中國(guó)作物及其野生近緣植物，花卉卷[M].中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2008:505-508)。矮牽牛原產(chǎn)于南美洲的阿根廷，目前在世界各國(guó)均廣泛種植，如日本、意大利、法國(guó)、西班牙、荷蘭和德國(guó)等，用于道路街邊綠化和庭園美化；在美國(guó)，矮牽牛的種植面積和消費(fèi)額高居草本花卉之首；在日本，矮牽牛也被評(píng)為最受歡迎的草本花卉之一。矮牽牛廣泛應(yīng)用于花壇、花境布置，窗臺(tái)和庭院裝點(diǎn)，另外大花、重瓣的品種也是切花的材料。矮牽牛種子常規(guī)保存壽命3-5年，發(fā)芽率60%左右，染色體倍數(shù)為2X、4X、5X(X=7)類型。矮牽牛品種在種植時(shí)退化現(xiàn)象嚴(yán)重，很多品種只能通過(guò)無(wú)性繁殖保存種質(zhì)。我國(guó)目前矮牽牛種子多為國(guó)外進(jìn)口的雜交種，其價(jià)格十分高昂，雖可以采用扦插繁殖，但其成活率低，但是實(shí)際生產(chǎn)中需要大量的種苗，很難在短時(shí)間內(nèi)提供大量的繁殖體。目前，有關(guān)矮牽牛的種質(zhì)保存方面的研究報(bào)道較少。超低溫保存技術(shù)是可長(zhǎng)期安全保存種質(zhì)資源的可選擇的較佳途徑之一，不但節(jié)約空間，而且成本低。現(xiàn)已開(kāi)發(fā)出多種超低溫保存方法，然而針對(duì)不同物種甚至對(duì)于同一物種的不同栽培品種，其適宜的超低溫保存方法及程序技術(shù)都有可能不同，迄今為止，國(guó)際上尚未建立起具有普適性的超低溫保存方法，這也是超低溫保存技術(shù)實(shí)際應(yīng)用中的一個(gè)主要瓶頸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種矮牽牛試管苗離體莖尖小滴玻璃化法超低溫保存技術(shù)及植株再生培養(yǎng)方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種矮牽牛離體莖尖的超低溫保存方法，其主要基于小滴玻璃化法超低溫保存技術(shù)，包括材料擴(kuò)繁、莖尖剝?nèi)　㈩A(yù)培養(yǎng)、裝載、PVS2處理、超低溫(_196°C )冷凍保存的步驟。材料擴(kuò)繁具體步驟如下1)將矮牽牛試管苗接種在含0. 5mg/L BA和30g/L鹿糖的MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)繁；2)將擴(kuò)繁的試管苗轉(zhuǎn)移到不含激素的MS培養(yǎng)基中生根復(fù)壯，20d后，將生根苗轉(zhuǎn)到含30g/L蔗糖的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照14h/d，光照強(qiáng)度為7001ux。莖尖剝?nèi)【唧w為在無(wú)菌條件下，從繼代15-20d的生長(zhǎng)健壯的矮牽牛無(wú)菌苗上剝?nèi)?-3片葉原基，直徑大小約2 3mm的離體莖尖為材料。預(yù)培養(yǎng)具體為將剝?nèi)〉那o尖在含0.2、. 4mol/L蔗糖的MS液體培養(yǎng)基中，于25°C振蕩預(yù)培養(yǎng)f 3d，搖床轉(zhuǎn)速為60rpm/min。裝載具體為將預(yù)培養(yǎng)后的離體莖尖置于裝載液中室溫裝載2(T40min ;所述裝載液的組成為MS+2mol/L甘油+0. 4mol/L鹿糖。PVS2脫水處理具體為將裝載后的莖尖置于PVS2中，(TC處理3(T50min ;所述PVS2的組成為MS+30%甘油+15%乙二醇+15% 二甲基亞砜+0. 4mol/L蔗糖。超低溫冷凍保存具體為將經(jīng)PVS2脫水處理后的莖尖置于鋁箔條上，向莖尖上滴加PVS2溶液，使莖尖完全包裹于PVS2溶液小滴中，然后將鋁箔條直接浸入液氮中進(jìn)行冷凍，冷凍后將鋁箔條裝入凍存管中，擰緊蓋子，最后投入液氮中保存。
本發(fā)明進(jìn)一步提供利用上述方法獲得的矮牽牛離體莖尖在組織培養(yǎng)及植株再生中的應(yīng)用。其包括解凍、洗滌及恢復(fù)再生培養(yǎng)的步驟。具體為將超低溫冷凍保存的離體莖尖取出，迅速投入卸載液中解凍并洗滌，然后將莖尖接種于恢復(fù)再生培養(yǎng)基中，在25±2°C下暗培養(yǎng)7d，最后移至光下培養(yǎng)。洗滌次數(shù)優(yōu)選為2 3次，每IOmin更換一次卸載液。所述卸載液的組成為MS+1.2mol/L蔗糖；所述恢復(fù)再生培養(yǎng)基的組成為MS+0. 5mg/L BA+30g/L 蔗糖 +9. Og/L 瓊脂。本發(fā)明的矮牽牛試管苗離體莖尖小滴玻璃化法超低溫保存及植株再生培養(yǎng)方法，是一種長(zhǎng)期安全、穩(wěn)定可靠、簡(jiǎn)單有效的保存矮牽牛種質(zhì)資源的方法，再生苗恢復(fù)生長(zhǎng)良好，植株再生率可達(dá)50%以上。


圖I為本發(fā)明實(shí)施例I中不同品種矮牽牛超低溫保存后的存活率和再生率比較。圖2為本發(fā)明實(shí)施例I中超低溫保存后矮牽牛莖尖恢復(fù)培養(yǎng)的結(jié)果；其中a-e為恢復(fù)培養(yǎng)20d，a.存活率和再生率分別為25%和16. 67% ；b.存活率和再生率分別為75%和66. 67% ；c.由莖尖直接再生的帶根小苗；d.莖尖直接再生的不帶根小苗；e.恢復(fù)培養(yǎng)存活但不能再生；f.恢復(fù)培養(yǎng)14d，存活的莖尖，只有上部分生組織和葉原基存活；g.恢復(fù)培養(yǎng)10d，存活的莖尖；h.恢復(fù)培養(yǎng)10d，死亡的莖尖。圖3為本發(fā)明實(shí)施例2的預(yù)培養(yǎng)液中蔗糖濃度對(duì)矮牽牛莖尖超低溫保存的影響。圖4為本發(fā)明實(shí)施例3中預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)矮牽牛莖尖超低溫保存的影響。圖5為本發(fā)明實(shí)施例4中裝載時(shí)間對(duì)矮牽牛莖尖超低溫保存的影響。圖6為本發(fā)明實(shí)施例5中PVS2處理時(shí)間對(duì)矮牽牛莖尖超低溫保存的影響。圖7為本發(fā)明實(shí)施例6中利用引物PID3H7對(duì)矮牽牛(牛2)組培苗進(jìn)行SSR擴(kuò)增的結(jié)果；其中，a中各泳道為未經(jīng)超低溫保存的試管苗葉片DNA擴(kuò)增圖譜，b中各泳道為經(jīng)過(guò)超低溫保存的再生苗葉片DNA擴(kuò)增圖譜，*為對(duì)照處理的樣品。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
實(shí)施例I矮牽牛試管苗離體莖尖小滴玻璃化法超低溫保存技術(shù)及植株再生培養(yǎng)方法實(shí)驗(yàn)材料矮牽牛(PetuniaXhybrida Vilm.) “泛美夢(mèng)幻”系列4個(gè)品種試管苗牛I (白色)、牛2 (藍(lán)色)、牛3 (紅色)、牛4 (玫瑰紅色)。實(shí)驗(yàn)方法具體步驟如下I、材料擴(kuò)繁I)將矮牽牛試管苗接種在含0. 5mg/L BA和30g/L蔗糖的MS固體培養(yǎng)基(含9. Og/L瓊脂)上進(jìn)行擴(kuò)繁；
2)將擴(kuò)繁的試管苗轉(zhuǎn)移到不含激素的MS培養(yǎng)基中生根復(fù)壯，20d后，將生根苗轉(zhuǎn)到含30g/L蔗糖的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照14h/d，光照強(qiáng)度為7001ux。2、莖尖剝?nèi)≡跓o(wú)菌條件下，從繼代15-20d的生長(zhǎng)健壯的矮牽牛無(wú)菌苗上剝?nèi)?-3片葉原基，直徑大小約2 3mm的離體莖尖為材料。3、預(yù)培養(yǎng)將剝?nèi)〉那o尖在含0. 2mol/L蔗糖的MS液體培養(yǎng)基中，于25°C振蕩預(yù)培養(yǎng)2d，搖床轉(zhuǎn)速為60rpm/min。4、裝載將預(yù)培養(yǎng)后的離體莖尖置于裝載液中室溫裝載30min ;所述裝載液的組成為MS+2mol/L 甘油 +0. 4mol/L 鹿糖。5、PVS2脫水處理將裝載后的莖尖置于PVS2中，(TC處理30min ;所述PVS2的組成為MS+30%甘油+15%乙二醇+15% 二甲基亞砜+0. 4mol/L蔗糖。6、超低溫冷凍保存將經(jīng)PVS2脫水處理后的莖尖置于鋁箔條上，向莖尖上滴加PVS2溶液，使莖尖完全包裹于PVS2溶液小滴中，之后將載有包裹著莖尖的PVS2小滴的鋁箔條直接浸入液氮中進(jìn)行冷凍，然后將冷凍過(guò)的小滴連同鋁箔條裝入凍存管中，擰緊蓋子，最后投入液氮(_196°C )中進(jìn)行保存。7、解凍、洗滌將液氮保存的離體莖尖取出，迅速投入卸載液中解凍并洗滌2次，每IOmin更換一次卸載液。其中，卸載液的組成為MS+1.2mol/L蔗糖。8、恢復(fù)再生培養(yǎng)將洗滌后的莖尖接種于恢復(fù)再生培養(yǎng)基中，在25±2°C下暗培養(yǎng)7d，最后移至光下培養(yǎng)。其中，恢復(fù)再生培養(yǎng)基的組成為MS+0. 5mg/LBA+30g/L蔗糖+9. Og/L瓊脂。不同品種矮牽牛的存活率和再生率如圖I所示。超低溫保存后莖尖恢復(fù)培養(yǎng)的結(jié)果如圖2所示，其中a-e為恢復(fù)培養(yǎng)20d，a.存活率和再生率分別為25%和16. 67% ；b.存活率和再生率分別為75%和66. 67% ；c.由莖尖直接再生的帶根小苗；d.莖尖直接再生的不帶根小苗；e.恢復(fù)培養(yǎng)存活但不能再生；f.恢復(fù)培養(yǎng)14d，存活的莖尖，只有上部分生組織和葉原基存活；g.恢復(fù)培養(yǎng)10d，存活的莖尖；h.恢復(fù)培養(yǎng)10d，死亡的莖尖。實(shí)施例2預(yù)培養(yǎng)液中蔗糖濃度對(duì)矮牽牛莖尖超低溫保存的影響
僅改變預(yù)培養(yǎng)液中的蔗糖濃度，其余步驟同實(shí)施例I，研究預(yù)培養(yǎng)液中蔗糖濃度對(duì)矮牽牛莖尖超低溫保存的影響。結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，矮牽牛莖尖經(jīng)小滴玻璃化法超低溫保存后，其存活率和再生率對(duì)預(yù)培養(yǎng)液中蔗糖濃度的變化較為敏感。隨著預(yù)培養(yǎng)液中蔗糖濃度的上升，莖尖存活率和再生率呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì)，過(guò)高或過(guò)低濃度的蔗糖均可能導(dǎo)致存活率和再生率下降，其中含0. 2^0. 3mol/L蔗糖的預(yù)培養(yǎng)液的效果較好，存活率和再生率高達(dá)80%和70%以上，與經(jīng)其他濃度的蔗糖預(yù)處理后莖尖的存活率和再生率差異顯著。
實(shí)施例3預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)矮牽牛莖尖超低溫保存的影響僅改變預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間，其余步驟同實(shí)施例1，研究預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)矮牽牛莖尖超低溫保存的影響。結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，矮牽牛莖尖經(jīng)小滴玻璃化法超低溫保存后，其存活率和再生率對(duì)預(yù)培養(yǎng)時(shí)間變化較為敏感。預(yù)培養(yǎng)時(shí)間從Od延長(zhǎng)至2d時(shí)莖尖存活率和再生率緩慢提高，預(yù)培養(yǎng)2 3d時(shí)莖尖存活率和再生率最高，達(dá)80%和70%以上。預(yù)培養(yǎng)3 5d莖尖存活率和再生率下降。實(shí)施例4裝載時(shí)間對(duì)矮牽牛莖尖超低溫保存的影響僅改變裝載的時(shí)間，其余步驟同實(shí)施例1，研究裝載時(shí)間對(duì)矮牽牛莖尖超低溫保存的影響。結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出，采用小滴玻璃化法對(duì)矮牽牛莖尖進(jìn)行超低溫保存，其存活率和再生率對(duì)裝載時(shí)間長(zhǎng)短敏感。裝載時(shí)間由Omin延長(zhǎng)到20min時(shí)莖尖存活率和再生率顯著升高，裝載2(T40min時(shí)莖尖存活率和再生率最高，存活率和再生率高達(dá)80%和70%以上，裝載超過(guò)40min莖尖存活率和再生率下降。實(shí)施例5PVS2處理時(shí)間對(duì)矮牽牛莖尖超低溫保存的影響僅改變PVS2脫水處理的時(shí)間，其余步驟同實(shí)施例1，研究PVS2脫水處理時(shí)間對(duì)矮牽牛莖尖超低溫保存的影響。結(jié)果如圖6所示。從圖6可以看出，矮牽牛莖尖小滴玻璃化法超低溫保存對(duì)PVS2處理時(shí)間長(zhǎng)短較為敏感。PVS2處理時(shí)間由Omin延長(zhǎng)到30min時(shí)莖尖存活率和再生率顯著升高，PVS2處理30min時(shí)莖尖存活率和再生率最高，達(dá)80%和70%以上。PVS2處理超過(guò)40min莖尖存活率和再生率下降，即過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的PVS2處理均可能導(dǎo)致存活率和再生率的下降。實(shí)施例6超低溫保存處理對(duì)再生的矮牽牛遺傳穩(wěn)定性的影響將牛2的一株試管苗擴(kuò)繁獲得100株試管苗，并進(jìn)行連續(xù)編號(hào)。當(dāng)苗齡為20d時(shí)剝?nèi)∏o尖，按照實(shí)施例I的小滴玻璃化法程序(步驟f步驟6)進(jìn)行超低溫保存(對(duì)每株試管苗進(jìn)行編號(hào)，剝?nèi)∏o尖也做相應(yīng)的編號(hào)，每個(gè)莖尖的超低溫保存獨(dú)立進(jìn)行)。剝離莖尖同時(shí)，提取100株試管苗葉片的DNA以備用。莖尖經(jīng)過(guò)小滴玻璃化法的超低溫保存后再生了 60個(gè)試管苗，提取其葉片DNA。以超低溫保存前剝?nèi)∏o尖的相同編號(hào)的試管苗葉片DNA為對(duì)照，共120份樣品采用SSR分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)。經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增體系的優(yōu)化以及PCR擴(kuò)增條帶的篩選，最后選用15對(duì)引物進(jìn)行SSR擴(kuò)增(退火溫度490C 55°C )，PCR產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離。超低溫保存前的60個(gè)組培苗沒(méi)有出現(xiàn)差異性條帶；超低溫保存后的60個(gè)再生苗也沒(méi)有出現(xiàn)差異性條帶，且條帶模式與超低溫保存前相同。例如，利用引物PID3H7進(jìn)行SSR擴(kuò)增。PID3H7引物序列及退火溫度如表I所示表1PID3H7引物序列及退火溫度
權(quán)利要求
1.一種矮牽牛離體莖尖的超低溫保存方法，其包括材料擴(kuò)繁、莖尖剝?nèi)　㈩A(yù)培養(yǎng)、裝載、PVS2處理、超低溫冷凍保存的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，材料擴(kuò)繁具體步驟如下 1)將矮牽牛試管苗接種在含0.5mg/L BA和30g/L蔗糖的MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)繁； 2)將擴(kuò)繁的試管苗轉(zhuǎn)移到不含激素的MS培養(yǎng)基中生根復(fù)壯，20d后，將生根苗轉(zhuǎn)到含30g/L蔗糖的MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)；培養(yǎng)溫度為25±2°C，光照14h/d，光照強(qiáng)度為7001ux。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，莖尖剝?nèi)【唧w為在無(wú)菌條件下，從繼代15-20d的矮牽牛無(wú)菌苗上剝?nèi)?-3片葉原基，直徑大小約2 3mm的離體莖尖為材料。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，預(yù)培養(yǎng)具體為將剝?nèi)〉那o尖在含0.2^0. 4mol/L蔗糖的MS液體培養(yǎng)基中，于25°C振蕩預(yù)培養(yǎng)f 3d，搖床轉(zhuǎn)速為60rpm/min。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，裝載具體為將預(yù)培養(yǎng)后的離體莖尖置于裝載液中室溫裝載2(T40min ;所述裝載液的組成為MS+2mol/L甘油+0. 4mol/L蔗糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，PVS2處理具體為將裝載后的莖尖置于PVS2中，(TC處理3(T50min ;所述PVS2的組成為MS+30%甘油+15%乙二醇+15% 二甲基亞砜 +0. 4mol/L 鹿糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，超低溫冷凍保存具體為將經(jīng)PVS2脫水處理后的莖尖置于鋁箔條上，向莖尖上滴加PVS2溶液，使莖尖完全包裹于PVS2溶液小滴中，然后將鋁箔條直接浸入液氮中進(jìn)行冷凍，冷凍后將鋁箔條裝入凍存管中，擰緊蓋子，最后投入液氣中保存。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述方法獲得的矮牽牛離體莖尖在組織培養(yǎng)中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，將超低溫冷凍保存的離體莖尖取出，投入卸載液中解凍并洗滌，然后將莖尖接種于恢復(fù)再生培養(yǎng)基中，在25±2°C下暗培養(yǎng)7d，最后移至光下培養(yǎng)； 所述卸載液的組成為MS+1. 2mol/L蔗糖；所述恢復(fù)再生培養(yǎng)基的組成為MS+0. 5mg/LBA+30g/L 鹿糖 +9. Og/L 瓊脂。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，洗滌次數(shù)為2 3次，每IOmin更換一次卸載液。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種矮牽牛離體莖尖的超低溫保存方法，其主要基于小滴玻璃化法超低溫保存技術(shù)，包括材料擴(kuò)繁、莖尖剝?nèi)　㈩A(yù)培養(yǎng)、裝載、PVS2處理、超低溫冷凍保存的步驟。通過(guò)對(duì)采用本發(fā)明的小滴玻璃化法超低溫保存技術(shù)獲得的矮牽牛離體莖尖進(jìn)行植株再生培養(yǎng)，表明該法是一種長(zhǎng)期安全、穩(wěn)定可靠、簡(jiǎn)單有效的保存矮牽牛種質(zhì)資源的方法，再生苗恢復(fù)生長(zhǎng)良好，植株再生率可達(dá)50%以上。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102726298SQ201210229180
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月3日
發(fā)明者盧新雄, 張金梅, 辛霞, 陳曉玲, 黃斌 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所