專利名稱：正紅菇菌根型食用菌的分離培養保存方法
技術領域：
本發明涉及共生微生物培養的技術領域，特別是涉及一種正紅菇菌根型食用菌的分離培養保存方法。
背景技術：
菌根型食用菌指一些在其自身的生活史中，必須依賴于一些活的樹木根系，并與樹木根系形成共生關系的一類食用菌。菌根食用菌與樹木根系之間的 營養生理過程首先形成共生體-菌根，才能完成物質交換的相互依賴關系。我國已知的567年野生食用菌資源中，屬于菌根型食用菌的資源就已知有352種，約占國產食用菌資源總量的53. 6%。許多種類的菌根型食用菌都具有較高的經濟和營養，同時它們對森林的持續發展也具有重要的意義。正紅菇是目前僅知分布在中國部分地區的紅菇屬新種，是一種與殼斗科樹種共生的菌根型食用菌。正紅菇具養血、逐瘀、祛風，主治血虛萎黃、產后惡露不盡、關節酸痛等功能，它不僅美味，更是營養保健的野生菇，在中國及東南亞部分地區深受人們喜愛。由于其獨特的營養價值和保健功能，正紅菇的價值甚至超過世界某種的松茸、美味牛肝菌和松乳菇。正紅菇做為一種珍貴的藥食兩用菌，不僅具有良好的色澤和風味，并且具有增強機體免疫力、補血、降低血液膽固醇等藥用功能。近年來，隨著生活水平的提高，人們的飲食要求已經由原來的滿足溫飽轉變為追求健康和崇尚天然。這無疑為開發利用紅菇資源提供了廣闊的市場前景。菌根菌普遍都較難分離培養，亦較難保存，目前國際上菌根菌一般每隔3個月左右轉管一次，且菌種的活性也易退化。目前,正紅燕菌絲體分離培養一般取材于子實體的燕蓋或燕柄的菌肉，分離培養所取的子實體均為未成熟或有7分成熟，菌傘均未打開，分離成功的概率較少或幾乎沒有萌發；分離所用的子實體材料均用升汞溶液或酒精進行表面消毒；分離培養所用的培養基均為PDA培養基或改良的PDA培養基；正紅菇分離培養、純化及保存均采用PDA培養基，試管種的活性一般為3個月(黃年來等，2010 ;陳旭健等，2005 ;陳少珍等，2004)。從事食用菌研究的科研人員，普遍都深感正紅菇的分離培養萌發率低，純化成功率低，菌種保存時間較難持久，菌種的活性消失較快。

發明內容
基于此，有必要提供一種分離培養成功率高、菌種保存時間長、活性持久的正紅菇菌根型食用菌分離培養保存方法。一種正紅菇菌根型食用菌的分離培養保存方法，包括以下步驟a、摘采正開傘的成熟正紅菇子實體；b、在無菌條件下取步驟a中正紅菇子實體菌柄與菌蓋交接處的菌褶部分的組織塊，放入含乳糖、維生素B1和葉酸的改良PDA固體培養基中，室溫、避光培養3 5天，萌發得到菌絲體；C、在無菌條件下將步驟b中的菌絲體放入含乳糖的改良MN固體培養基中，室溫、避光培養 5 7天，純化菌絲體；d、在無菌條件下，將步驟c中純化的菌絲體轉接入具膠蓋的試管中，25 30°C、避光培養5 7天，所述試管中裝有由步驟b所述的含乳糖、維生素BI和葉酸的改良PDA培養基和步驟c所述的含乳糖的改良MN培養基組成的混合培養基；e、將步驟d中無污染的試管置于10 15°C保存。在其中一些實施例中，步驟b的培養基中所述乳糖的濃度為4 6g/L。在其中一些實施例中，步驟c的培養基中所述乳糖的濃度為0. 5 I. 5g/L。在其中一些實施例中，步驟d中所述含乳糖、維生素B1和葉酸的改良PDA培養基與含乳糖的改良麗培養基的體積比為I : I 2 : I。在其中一個實施例中，步驟d中所述含乳糖、維生素B1和葉酸的改良PDA培養基與含乳糖的改良麗培養基的體積比為2 I。在其中一個實施例中，步驟e中所述試管與膠蓋之間的銜接口用保鮮膜封包。本發明正紅菇菌根型食用菌的分離培養保存方法，組織塊菌絲體的萌發率高達50%以上，菌種保存時間一次分轉可達I年，菌種活性持續3年不退化。本發明方法不需要消毒子實體，配制培養基所用試劑均是常用品，整個操作過程較簡練，使正紅菇菌根食用菌的菌種分離培養保存方法簡便化，為菌根食用菌行業提供了新的操作方法和技術。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的闡述。實施例I一種正紅菇菌根型食用菌的分離培養保存方法，其步驟如下(I)配制含葉酸、維生素B1和乳糖的改良PDA培養基。改良PDA培養基的成分是馬鈴薯汁200g/L，葡萄糖20g/L，乳糖5g/L，葉酸50 u g/L、維生素 B1IOO u g/L，瓊脂粉 8g/L。(2)將步驟(I)配制好的培養基裝入三角瓶中于121°C滅菌20分鐘，取出待溫度降至50°C左右，在潔凈工作臺下，按30ml/皿裝入無菌培養皿(2 X 9cm)中，置工作臺中冷卻成平板固體培養基，待用。(3)在潔凈工作臺下，用無菌鑷子取一小塊正紅菇剛開傘子實體菌柄與菌蓋交接處的菌褶塊，迅速放入步驟(2)備好的培養皿中，菌褶塊在培養皿中呈三角形擺放，用寬3cm的保鮮膜封包培養皿套口。(4)將培養皿置于25_35°C的溫室條件下，遮光培養3天，萌發得到菌絲體，菌絲體的萌發率為52%。(5)配制含乳糖I g/L的改良麗固體培養基。配方為=CaCl20. 05g/L, NaCl 0. 025g/L, KH2PO4 0. 5g/L, (NH4) HPO4 0. 25g/L,MgSO4 7H20 0. 15g/L，DETA-Fe3 0. 02g/L,維生素 B1 100 u g/L,葡萄糖 2. 5g/L，麥芽糊精3.Og/L，乳糖 lg/L，瓊脂粉 8. 5g/L。(6)將步驟(5)配制好的培養基按步驟(2)進行裝瓶滅菌備用。(7)步驟(4)培養3天后，挑取一小塊萌發的菌絲體轉入步驟￠)的培養皿中，操作方法同步驟(3)。(8)將培養皿置于25_35°C的溫室條件下，遮光培養I天，純化菌絲體。(9)將步驟⑴和步驟(5)配制好的兩種培養基按2 I的比例混合，使其溶化成液體，按9ml/管裝入試管(1.8X7cm)中，用塑膠蓋擰緊試管口，將試管置于121°C滅菌20分鐘，取出斜置冷卻至室溫，試管中的培養基成固體斜面狀。(10)將步驟(8)培養7天后純化的菌絲體挑一小塊放入步驟(9)的試管中，用塑膠蓋擰緊試管口，于25-35°C的溫室條件下，遮光培養7天。 (11)培養7天后，挑選沒有污染的試管種用寬Icm的保鮮膜封包塑膠蓋與試管的銜接口，于10-15°C溫度條件保存。采用實施例I的條件，正紅菇菌種分離成功率達52%，純化率達80%，菌種保存12個月后試管內的培養基基本保持原樣，菌種活性達90% ;保存24個月后試管內的培養基減少10%，菌種活性達80 %。實施例2除了步驟⑴的培養基中乳糖的濃度為4g/L，步驟(5)的培養基中乳糖的濃度為
0.5g/L，步驟(9)中兩種培養基按I : I的比例混合外，其他操作均與實施例I相同。采用實施例2的條件，正紅菇菌種分離成功率達40 %，純化率達60 %，菌種保存12個月后試管內的培養基基本保持原樣，菌種活性達70% ;保存24個月后試管內的培養基減少9%，菌種活性達50%。實施例3除了步驟⑴的培養基中乳糖的濃度為6g/L，步驟(5)的培養基中乳糖的濃度為1.5g/L，步驟(9)中兩種培養基按I : I的比例混合外，其他操作均與實施例I相同。采用實施例3的條件，正紅菇菌種分離成功率達50 %，純化率達50 %，菌種保存12個月后試管內的培養基減少10%，菌種活性達80% ;保存24個月后試管內的培養基減少20%，菌種活性達70 %。實施例4除了步驟(3)中挑取一小塊正紅菇未開傘子實體菌柄與菌蓋接種處的菌褶塊外，其他操作均與實施例I相同。采用實施例4的條件下做了 6個菌株分離培養，每個菌株采用10個培養皿共挑取30小塊進行試驗，分離成功率只達8. 3%。實施例5除了步驟(5)中所用培養基為步驟⑴的培養基外，其他操作均與實施例I相同。采用實施例5的條件下做了 6個菌株純化培養，每個菌株采用10個培養皿共挑取30小塊進行試驗，分離成功率只達33. 3%。實施例6除了步驟(9)中所用培養基為步驟(I)的培養基外，其他操作均與實施例I相同。采用實施例6的條件下做了 6個菌株的保存試驗，每個菌株有7支試管種，保存6個月后菌種活性達60%，且分轉污染率較高，明顯菌種活性退化。實施例7除了步驟(11)中沒用用寬Icm的保鮮膜封包塑膠蓋與試管的銜接口外，其他操作均與實施例I相同。采用實施例7的條件下做了 6個菌株的保存期試驗，每個菌株有7支試管種，保存12個月后試管內的培養基縮水率達70%，菌種活性只達43%。以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員 護范圍。因此，本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
權利要求
1.一種正紅菇菌根型食用菌的分離培養保存方法，其特征在于，包括以下步驟 a、摘采正開傘的成熟正紅菇子實體； b、在無菌條件下取步驟a中正紅菇子實體菌柄與菌蓋交接處的菌褶部分的組織塊，放入含乳糖、維生素B1和葉酸的改良PDA固體培養基中，室溫、避光培養3 5天，萌發得到菌絲體； C、在無菌條件下將步驟b中的菌絲體放入含乳糖的改良MN固體培養基中，室溫、避光培養5 7天，純化菌絲體； d、在無菌條件下，將步驟c中純化的菌絲體轉接入具膠蓋的試管中，室溫、避光培養5 7天，所述試管中裝有由步驟b所述的含乳糖、維生素B1和葉酸的改良PDA培養基和步驟c所述的含乳糖的改良MN培養基組成的混合培養基； e、將步驟d中無污染的試管置于10 15°C保存。
2.根據權利要求I所述的正紅菇菌根型食用菌的分離培養保存方法，其特征在于，步驟b的培養基中所述乳糖的濃度為4 6g/L。
3.根據權利要求I所述的正紅菇菌根型食用菌的分離培養保存方法，其特征在于，步驟b的培養基中所述維生素B1的濃度為100±10ii g/L ;所述葉酸的濃度為50±5ii g/L。
4.根據權利要求I所述的正紅菇菌根型食用菌的分離培養保存方法，其特征在于，步驟c的培養基中所述乳糖的濃度為0. 5 I. 5g/L。
5.根據權利要求I所述的正紅菇菌根型食用菌的分離培養保存方法，其特征在于，步驟d中所述含乳糖、維生素B1和葉酸的改良PDA培養基與含乳糖的改良麗培養基的體積比為I : I 2 : I。
6.根據權利要求5所述的正紅菇菌根型食用菌的分離培養保存方法，其特征在于，步驟d中所述含乳糖、維生素B1和葉酸的改良PDA培養基與含乳糖的改良麗培養基的體積比為2:1。
7.根據權利要求1-6任一項所述的正紅菇菌根型食用菌的分離培養保存方法，其特征在于，步驟e中所述試管與膠蓋之間的銜接口用保鮮膜封包。
全文摘要
本發明公開了一種正紅菇菌根型食用菌的分離培養保存方法，包括以下步驟摘采正開傘的成熟正紅菇子實體；取正紅菇子實體菌柄與菌蓋交接處的菌褶部分的組織塊，放入含乳糖、維生素B1和葉酸的改良PDA固體培養基中，室溫、避光培養3～5天，萌發得到菌絲體；將菌絲體放入含乳糖的改良MN固體培養基中，室溫、避光培養5～7天，純化菌絲體；將純化的菌絲體轉接入具膠蓋的試管中，室溫、避光培養5～7天；將無污染的試管置于10～15℃保存。這種正紅菇菌根型食用菌的分離培養保存方法，組織塊菌絲體的萌發率高達50％以上，菌種保存時間一次分轉可達1年，菌種活性持續3年不退化。
文檔編號A01G1/04GK102715016SQ20121023817
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月10日 優先權日2012年7月10日
發明者仲崇祿, 姜清彬, 張勇, 陳珍, 陳羽 申請人:中國林業科學研究院熱帶林業研究所