專利名稱：泛素蛋白內(nèi)含子改造序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及ー種改造的泛素蛋白內(nèi)含子序列。本發(fā)明還涉及該改造的內(nèi)含子的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大多數(shù)真核基因都被ー個或多個內(nèi)含子所間隔，這些間隔序列可以轉(zhuǎn)錄成pre-mRNA，這些轉(zhuǎn)錄本只有在細胞核中經(jīng)剪接復(fù)合體的作用去除內(nèi)含子片段后，才能形成成熟mRNA，然后穿過核孔轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)中進行翻譯。真核pre-mRNA的剪接是ー個在細胞核中完成的、嚴格保守的化學(xué)反應(yīng)，該過程包括剪接體識別外顯子-內(nèi)含子連接區(qū)段，通過兩步轉(zhuǎn)酯反應(yīng)切除內(nèi)含子并使相鄰的外顯子連接。已有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)含子在基因表達方面起著重要的調(diào)控作用。由內(nèi)含子介導(dǎo)的使基因表達活性增強的效應(yīng)叫做內(nèi)含子增強效應(yīng)(intron-mediated enhancement, IME)(Callis et al. , Genes Development, 1987,1:1183-1200)。真核 mRNA 內(nèi)含子已成為提高轉(zhuǎn)基因生物外源基因表達的重要元件之一。單子葉植物的內(nèi)含子增強效應(yīng)高于雙子葉植物，雙子葉植物內(nèi)含子增強效應(yīng)一般在 2-5 倍，而單子葉植物可達 10-100 倍(Simpson 和 Filipowicz, Plant Mol. Biol.，1996，32 :1-41)。雙子葉植物內(nèi)含子可以提高單子葉植物基因的表達，而由于單子葉植物內(nèi)含子與外顯子AU的平均含量為59%和44%，雙子葉植物的分別為74%和55%，高AU含量可以使內(nèi)含子更易形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)從而有利于剪接，因此，單子葉植物內(nèi)含子通常不會提高雙子葉植物基因的表達(Vain et al.，Plant cell R印，1996，15:489-494)。Ueki 等將 PLD、Cat 和Ubi (玉米ubiquitin第一個內(nèi)含子)內(nèi)含子與不同啟動子連接,分別轉(zhuǎn)化玉米和煙草的原生質(zhì)體，驗證各個載體表達特點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含有內(nèi)含子載體的報告基因表達水平在玉米原生質(zhì)體中普遍高于同樣載體的煙草原生質(zhì)體的表達水平，內(nèi)含子載體增強效應(yīng)與啟動子、內(nèi)含子和報告基因等緊密相關(guān)(Ueki et al.，Plant Biotech, 2004，21 (I) :15_24)。現(xiàn)在人們普遍接受內(nèi)含子像其他調(diào)控基因表達的順式作用元件一祥含有一定的關(guān)鍵序列，這些序列在調(diào)控中起到關(guān)鍵作用，而其余的序列對于調(diào)控來說并不是必需的。內(nèi)含子的兩個剪接位點5’ GU—AG3’和分支位點的A堿基具有高度的保守性，在完成RNA正確剪接中是必須的。Rose等對擬南芥全基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，內(nèi)含子增強基序是分散排布，距離啟動子近端的內(nèi)含子增強效應(yīng)高于其他位置，并且構(gòu)建了一個增強序列識別器--頂Eter，以此預(yù)測了擬南芥中內(nèi)含子增強相關(guān)基序(見


圖1，Rose et al.，Plantcell, 2008, 20:543-551 )，并對水稻的內(nèi)含子分析后發(fā)現(xiàn)這種增強基序具有一定的保守性。泛素(ubiquitin)是ー種存在于大多數(shù)真核細胞中的由76個氨基酸殘基組成的高度保守的蛋白質(zhì)。1992年，Christensen等從玉米中克隆出了編碼泛素蛋白的Ubi-I和Ubi-2基因，并準確定位了 Ubi-I的啟動子、轉(zhuǎn)錄起始位點、5’側(cè)翼序列處的0. 9kb轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)和完整的5’非編碼區(qū)，并構(gòu)建pUBI-CAT載體，在玉米和其它單子葉植物的原生質(zhì)體中進行驗證，發(fā)現(xiàn)Ubi-I啟動子比CaMV35S具有更高的增強基因表達的效應(yīng)(Christensen etal.,Plant Mol Biol，1992，18 :675-689)。Vain等通過比較發(fā)現(xiàn)，ubil內(nèi)含子與側(cè)翼外顯子的41nt所構(gòu)建的載體(p35Subi⑶S)在玉米懸浮細胞中的增強效應(yīng)高于其它載體，增強效應(yīng)可提高71倍(Vainet al. ,Plant cell R印，1996，15 :489_494)。王悅冰比較了玉米泛素蛋白基因的第一內(nèi)含子(ubil)、水稻肌動蛋白基因的第一內(nèi)含子(actl)、玉米こ醇脫氫酶基因的第一內(nèi)含子(adhl)和馬鈴薯高賴氨酸基因SBgLR基因的第二內(nèi)含子(SBgLR2)對基因表達的增強作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ubil增強報告基因的表達能力最強。目前尚未見到對Ubil內(nèi)含子進行特定位點的突變，以獲得增強基因表達能力更強的內(nèi)含子序列的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是對來源于玉米泛素蛋白基因Ubil內(nèi)含子進行改造，提供ー種可以增強基因表達的內(nèi)含子，通過構(gòu)建該改造的泛素蛋白內(nèi)含子的植物表達載體，將其應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物的培育中，可以提高其他基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達。本發(fā)明通過如下工作達到了上述發(fā)明目的I、內(nèi)含子突變載體的構(gòu)建策略本發(fā)明以P5內(nèi)含子序列(SEQ ID NO: I)為目標序列，增加內(nèi)含子增強序列基序 TCGATC的數(shù)量，改造ubil-P5內(nèi)含子，通過序列分析，將ll-16bp、78-83bp、282-287bp和510-515bp依次突變?yōu)楸Ｊ匦蛄?-TCGATC (SEQ ID NO: I中有下劃線處為待突變位點)。SEQ ID NO: II GTACAOGGAT GCGACCTGTA CGTCAGACAC GTTCTGATTG CTAACTTGCC AGTGTTTCTC61 TTTGGGGAAT CCTGGGATGG CTCTAGCCGT TCCGCAGACG GGATOGATTT CATGATTTTT121 TTTGTTTOGT TGCATAGGGT TTGGTTTGCC CTTTTCCTTT ATTTCAATAT ATGCCGTGCA181 CTTGTTTGTC GGGTCATCTT TTCATGCTTT TTTTTGTCTT GGTTGTGATG ATGTGGTCTG241 GTTGGGCGGT OGTTCTAGAT CGGAGTAGAA TTAATTCTGT TTCAAACTAC CTGGTGGATT301 TATTAATTTT GGATCTGTAT GTGTGTGCCA TACATATTCA TAGTTAOGAA TTGAAGATGA361 TGGATGGAAA TATCGATCTA GGATAGGTAT ACATGTTGAT GCGGGTTTTA CTGATGCATA421 TACAGAGATG CTTTTTGTTC GCTTGGTTGT GATGATGTGG TGTGGTTGGG CGGTCGTTCA481 TTCGTTCTAG ATOGGAGTAG AATACTGTTT CAAACTACCT GGTGTATTTA TTAATTTTGG541 AACTGTATGT GTGTGTCATA CATCTTCATA GTTACGAGTT TAAGATGGAT GGAAATATCG601 ATCTAGGATA GGTATACATG TTGATGTGGG TTTTACTGAT GCATATACAT GATGGCATAT661 GCAGCATCTA TTCATATGCT CTAACCTTGA GTACCTATCT ATTATAATAA ACAAGTATGT721 TTTATAATTA TTTTGATCTT GATATACTTG GATGATGGCA TATGCAGCAG CTATATGTGG781 ATTTTTTTAG CCCTGCCTTC ATAOGCTATT TATTTGCTTG GTACTGTTTC TTTTGTCGAT841 GCTCACCCTG TTGTTTGGTG TTACTTCTGC AG載體構(gòu)建策略如附圖5所示。經(jīng)改造的P5內(nèi)含子的序列，為SEQ ID N0:2。2、突變載體pSG (13i_Mn)N的構(gòu)建首先以p7Z⑶S (13i_P5)質(zhì)粒為模板，以MP78F與MP78R為引物(表2)，用寶生物工程有限公司的TaKaRa MutanBEST Kit進行定點突變，在P5內(nèi)含子片段的78bp_83bp處引入突變位點TCGATC，轉(zhuǎn)化后獲得第一個中間突變載體，命名為p7Z⑶S (13 -Μ1)中間載體；再以此質(zhì)粒為模板，MPlIF與MPlIR為引物(表2)在Ilbp_16bp引入第二個突變位點，命名為P7ZGUS (13 -Μ2)中間載體；依次以MP282F 與 MP282R、MP510F 與 MP510R 為引物(表 I)分別在 282bp287bp和510bp-515bp引入第三個和第四個突變點，獲得p7Z⑶S (13 -Μ3)中間載體和p7Z⑶S(13 -Μ4)中間載體；見如下表I :表I四個中間載體的構(gòu)建情況ー覽
權(quán)利要求
1.一種可以提聞基因表達的內(nèi)含子序列，其特征是具有SEQ ID NO :2所不的核昔酸序列。
2.權(quán)利要求I所述的內(nèi)含子序列在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
3.一種提高內(nèi)含子表達水平的方法，其特征是在內(nèi)含子的特定位點進行突變。
4.權(quán)利要求3所述的方法，所述內(nèi)含子是泛素蛋白內(nèi)含子，所述突變是將SEQID NOI中 ll-16bp、78-83bp、282-287bp 和 510_515bp 分別突變?yōu)楸Ｊ匦蛄幸籘CGATC。
5.ー種植物表達載體，其特征是含有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。
6.權(quán)利要求5所述的載體在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明通過對來源于玉米泛素蛋白基因ubil內(nèi)含子進行改造，將該內(nèi)含子特定位點突變?yōu)楸Ｊ匦蛄校峁┝艘环N可以增強基因表達的內(nèi)含子序列。本發(fā)明還提供了含有該改造的泛素蛋白基因ubil內(nèi)含子的植物表達載體，將其應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物的培育中，可以提高其他基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達。
文檔編號A01H5/00GK102747084SQ20121025146
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月19日
發(fā)明者朱莉, 潘陽陽, 郎志宏, 黃大昉 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所