一種開裂鐵皮石斛蒴果種胚的無菌去毒培養方法
【專利摘要】一種開裂鐵皮石斛蒴果種胚的無菌去毒培養方法，其特征在于首先將已開裂的石斛碩果表面進行清理，然后至于超凈工作臺中紫外照射10~15min，接著在無菌條件下將種胚轉移入無菌西林瓶中，用65~75%的酒精浸泡清洗30~60s，然后通過160~200目不銹鋼無菌濾網將種胚濾出，再用吸有0.5~1.5%安替福民的無菌吸管將種胚用轉移入無菌西林瓶中，浸沒消毒10~15min后，將種胚濾出用無菌水轉移入無菌西林瓶中反復沖洗3~5次，用無菌吸管將種胚已微滴方式轉移入培養基中無菌播種培養。本發明的培養方法簡單實用，操作性強，種胚利用率高、萌發率高，解決了開裂石斛蒴果難以利用的行業難題，大大延長了石斛種胚的播種時限。
【專利說明】一種開裂鐵皮石斛蒴果種胚的無菌去毒培養方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種蘭科植物種胚的培養方法，尤其涉及一種開裂鐵皮石斛蒴果種胚的無菌去毒培養方法。
【背景技術】
[0002]鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是傳統名貴珍稀中藥材,具有益胃生津、滋陰清熱等獨特功效，常用與熱病傷津、病后虛熱等多等癥狀。現代藥理研究表明鐵皮石斛在治療糖尿病、免疫調節、抗腫瘤等方面有很好的療效。鐵皮石斛藥用價值、保健價值高，然而因野生鐵皮石斛自然坐果率極低，加之其種子自然條件下萌發率極低，其野生資源己非常稀少，現在國內對于鐵皮石斛的人工培育已經取得一定進展，生產中人工培育主要通過鐵皮石斛的蒴果進行增值培養。
[0003]鐵皮石斛一般于4月中下旬開始開花，5月中下旬為盛花期。授粉成功后的蒴果進過120d的生長發育，蒴果變成黃綠色，基本成熟。隨著成熟度的增加，水分的散失，蒴果會自動開裂散出黃色種胚。目前蒴果的保存時間只能達到30d左右。現階段對于開裂散落出的種胚無法進行無菌去毒播種，例如專利號200310112012.5,200810104220.3、200910036502.9,201110203343.4等進行無菌播種去毒處理時所采用的蒴果均為未開裂的鐵皮石斛蒴果。由于鐵皮石斛坐 果率不高，加之蒴果使用周期短，因此石斛蒴果的有無已經成為現階段制約石斛組培行業可持續發展的決定性因素。

【發明內容】

[0004]本發明所要解決的技術問題是提供一種開裂鐵皮石斛蒴果種胚的無菌去毒培養方法，此方法簡單實用，操作性強，利用率高、萌發率高。解決了開裂石斛蒴果難以利用的行業難題，大大延長了石斛種胚的播種時限，為石斛組培工廠的順利運轉提供了保障。
[0005]本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為:一種開裂鐵皮石斛蒴果種胚的無菌培養方法，其特征在于包括以下步驟:
[0006]I)將開裂的鐵皮石斛蒴果進行表面清理；
[0007]2)將表面清理過的開裂果莢或種胚進行去毒處理:
[0008]將種胚置于超凈工作臺中紫外照射l(Tl5min，然后在無菌條件下將種胚轉移入無菌西林瓶中，之后用質量百分濃度65~75%的酒精浸泡清洗3(T60s，然后用無菌濾網將種胚濾出，再用吸有質量百分濃度0.5^1.5%安替福民的無菌吸管將種胚用轉移入無菌西林瓶中，浸沒消毒l(Tl5min后將種胚用無菌濾網濾出，然后用無菌水將種胚轉移入無菌西林瓶中，用無菌水反復沖洗3飛次；
[0009]3)最后用無菌水以微滴方式將種胚轉移入播種培養基中進行無菌播種培養。
[0010]作為優選，所述步驟2)中酒精的濃度為質量百分濃度70%，酒精浸泡過程中需翻轉混勻搖動。
[0011]作為優選，所述步驟2)中所述無菌濾網采用160-200目不銹鋼無菌濾網。[0012]再優選，所述步驟2)中的安替福民的質量百分濃度為1%。
[0013]最后，所述步驟3)的具體過程為:用無菌水以微滴方式將去毒處理過的種胚轉移入播種培養基中，:1/3~1/2MS液體培養基+萘乙酸(NAA) 0.5^1.0mg/L+6-芐氨基腺嘌呤(BA) 1.0-2.0mg/L+活性炭(AC)0.5^1.5g/L(技術含義是液體培養基中大含量元素濃度減到1/3~1/2，并添加下面物質，使液體培養基中萘乙酸濃度0.5^1.0mg/L, 6-芐氨基腺嘌呤濃度1.0-2.0mg/L，活性炭濃度0.5~1.5g/L)，播種后暗培養3_5d后，置于光照100(Tl500LUX，溫度25±1°C，光照時間12-14h/d的條件下進行培養。
[0014]與現有技術相比，本發明的優點在于:本發明的培養方法簡單實用，操作性強，種胚利用率高、萌發率高，有效地解決了開裂石斛蒴果難以利用的行業難題，大大延長了石斛種胚的播種時限，為石斛組培工廠的順利運轉提供了保障。
【具體實施方式】
[0015]以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0016]實施例一:
[0017]將開裂的鐵皮石斛蒴果進行表面清理。將表面清理過的開裂果莢或種胚粉置于超凈工作臺中紫外照射lOmin。超凈工作臺技術含義是工作臺的潔凈度達到百級(目前生物接種設備中的最高級別)，即每立方米內的菌落數為百個，一般室內的潔凈度為百萬級即每立方空間菌落數為百萬個。然后在無菌條件下將種胚轉移入無菌西林瓶中，之后用70%的酒精浸泡清洗30s，然后通過160目不銹鋼無菌濾網將種胚濾出，再用吸有1%安替福民的無菌吸管將種胚用轉移入無菌西林瓶中，浸沒消毒lOmin，將種胚用160目不銹鋼無菌濾網濾出，然后用無菌水轉移入無菌西林瓶中，用無菌水反復沖洗3次。用無菌水以微滴方式將去毒處理過的種胚轉移入播種培養基中，播種培養基為:1/2MS+NAA0.5mg/L+BAl.0mg/L+AC0.5g/L，播種后按培養3d后，置于光照1000-1500LUX，溫度25 土 1°C，光照時間12h/d的條件下進行培養，培養30天后，發現萌發率為98%，污染率為1.0%。
`[0018]實施例二:
[0019]將表面清理過的開裂果莢或種胚粉置于超凈工作臺中紫外照射12min。然后在無菌條件下將種胚轉移入無菌西林瓶中，之后用70%的酒精浸泡清洗45s，然后通過180目不銹鋼無菌濾網將種胚濾出，再用吸有1%安替福民的無菌吸管將種胚用轉移入無菌西林瓶中，浸沒消毒12min，將種胚用180目不銹鋼無菌濾網濾出，然后用無菌水轉移入無菌西林瓶中，用無菌水反復沖洗4次。用無菌水以微滴方式將去毒處理過的種胚轉移入播種培養基中，播種培養基為:1/2MS+NAA0.8mg/L+BAl.5mg/L+ACl.0g/L,播種后按培養4d后，置于光照1000-1500LUX，溫度25±1°C，光照時間13h/d的條件下進行培養，培養30天后，發現萌發率為96%，污染率為0.8%。
[0020]實施例三:
[0021]將表面清理過的開裂果莢或種胚粉置于超凈工作臺中紫外照射15min。然后在無菌條件下將種胚轉移入無菌西林瓶中，之后用70%的酒精浸泡清洗60s，然后通過200目不銹鋼無菌濾網將種胚濾出，再用吸有1%安替福民的無菌吸管將種胚用轉移入無菌西林瓶中，浸沒消毒15min，將種胚用200目不銹鋼無菌濾網濾出，然后用無菌水轉移入無菌西林瓶中，用無菌水反復沖洗5次。用無菌水以微滴方式將去毒處理過的種胚轉移入播種培養基中，播種培養基為:1/2MS+NAA1.0mg/L+BA2.0mg/L+ACl.5g/L，播種后按培養5d后，置于光照1000-1500LUX，溫度25土1°C，光照時間14h/d的條件下進行培養，培養30天后，統計發現萌發率為92%，污染率為0.5%。`
【權利要求】
1.一種開裂鐵皮石斛蒴果種胚的無菌去毒培養方法，其特征在于包括以下步驟: 1)將開裂的鐵皮石斛蒴果進行表面清理； 2)將表面清理過的開裂果莢或種胚進行去毒處理: 將種胚置于超凈工作臺中紫外照射l(Tl5min，然后在無菌條件下將種胚轉移入無菌西林瓶中，之后用質量百分濃度65~75%的酒精浸泡清洗30-60S，然后用無菌濾網將種胚濾出，再用吸有質量百分濃度0.5^1.5%安替福民的無菌吸管將種胚用轉移入無菌西林瓶中，浸沒消毒l(Tl5min后將種胚用無菌濾網濾出，然后用無菌水將種胚轉移入無菌西林瓶中，用無菌水反復沖洗3飛次； 3)最后用無菌水以微滴方式將種胚轉移入播種培養基中進行無菌播種培養。
2.根據權利要求1所述的無菌去毒培養方法，其特征在于所述步驟2)中酒精的濃度為質量百分濃度70%，酒精浸泡過程中需翻轉混勻搖動。
3.根據權利要求1所述的無菌去毒培養方法，其特征在于所述步驟2)中所述無菌濾網采用160-200目不銹鋼無菌濾網。
4.根據權利要求1所述的無菌去毒培養方法，其特征在于所述步驟2)中的安替福民的質量百分濃度為1%。
5.根據權利要求1所述的 無菌去毒培養方法，其特征在于所述步驟3)的具體過程為:用無菌水以微滴方式將去毒處理過的種胚轉移入播種培養基中，播種培養基為:1/3~1/2MS液體培養基+萘乙酸0.5~1.0mg/L+6-芐氨基腺嘌呤1.0~2.0mg/L+活性炭0.5~1.5g/L，播種后暗培養3~5d后，置于 光照1000-1500LUX，溫度25土1°C，光照時間12~14h/d的條件下進行培養。
【文檔編號】A01H4/00GK103563741SQ201210264112
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年7月27日 優先權日:2012年7月27日
【發明者】何心展, 李振達 申請人:寧波德健生物科技有限公司