專利名稱：毛葡萄離體再生培養方法
技術領域：
本發明涉及農業科學領域，尤其是ー種毛葡萄離體再生培養方法。
背景技術：
毛葡萄(Kiii1S heyneana Roem. & Schult.)又名絨毛葡萄、五角葉葡萄,在我國華中、華東、西南、華南北部、西北的陜、甘及華北的山西均有分布，是分布最為廣泛的野生葡萄種類之一。毛葡萄抗性強、適應性好，結果系數高，易與葡萄栽培品種雜交，既是葡萄栽培的優良抗性砧木，也是葡萄抗性育種的優良親本。由干葡萄遺傳背景復雜、生命周期長，使常規雜交育種在品種改良上受到極大限制，通過轉基因技術可實現毛葡萄抗性性狀與葡萄栽培品種的品質性狀有效結合，培育出優質高抗葡萄新品種。轉基因技術的關鍵是高效再生體系的建立，而毛葡萄離體再生研究未見報道。

發明內容
本發明的目的是提供ー種毛葡萄離體再生培養方法，它能為毛葡萄遺傳轉化奠定堅實基礎，為葡萄其他優良性狀向毛葡萄的轉移提供了一條有效的途徑，以滿足農業生
產需要。本發明是這樣實現的毛葡萄離體再生培養方法，包括以下步驟，
步驟一、無菌系的建立在生長季節選取生長健壯的毛葡萄新梢作為外植體，用自來水沖洗干凈，在超凈工作臺上，先用體積百分比為70%的酒精漂洗30s，再用無菌水沖洗3次后，用質量百分比為O. 1%的升汞溶液(即相當于Ig氯化汞溶解在I升水中)浸泡消毒8-lOmin后，用無菌水沖洗5_6次，然后剪除新梢兩端褐化部分后，剪成單芽莖段，接種到MS培養基中，在溫度為25±1°C,光照強度為40umol · s_1 · πΓ2,光照時間為12h/d的培養條件下，培養誘導至腋芽萌發，獲得誘導的腋芽葉片；
步驟ニ、不定芽誘導取步驟一中獲得的誘導的腋芽葉片剪成O. 5X0. 5cm2見方的小塊，在葉片背面沿葉脈垂直方向劃三刀，正面向上接種到MS培養基上，在溫度為25±1°C，光照強度為40umol · S-1 · m_2，光照時間為12h/d的條件下培養20d，葉片開始向上卷起，25-30d劃傷處再生出不定芽，30-45d大量產生再生不定芽；
步驟三、生根培養取步驟ニ中產生的不定芽，將其接種到1/2MS生根培養基中，先光下培養7d,再暗培養7d后，然后轉入光下繼續培養至正常生根，獲得試管苗；培養溫度為25±1°C,光照強度為40umol · s_1 · πΓ2，光照時間為12h/d ；
步驟四、煉苗移栽選取步驟三中生有3-4條根，長為4-5cm的試管苗，在102. Sumol -S-1 ·πΓ2的光照條件下煉苗7d，然后從培養瓶中取出試管苗，洗凈試管苗根部培養基，用質量百分比為O. 1% KMnO4溶液浸根10s，再移栽到滅菌的珍珠巖基質中，用1/8MS營養液澆透，之后每隔7d澆灌I次營養液，并從移栽后第2-3d始每隔7d澆灌I次1000倍質量百分比為40%的多菌靈溶液，加蓋與營養缽相同大小的塑料杯保持濕度，置于溫度為25土 TC的培養室內培養至植株長出3-5條新根后移栽到盛有營養土的營養缽中，置于溫、室內煉苗30d，最后定植到大田即可。步驟一中采用的MS培養基為國際通用的培養基，并在該MS培養基中每升添加
2.Omg的6-芐基嘌呤，O. 2mg的吲哚こ酸，20 g蔗糖和5g瓊脂粉，其pH值為5. 8-6. O。步驟ニ中采用的MS培養基為國際通用的培養基，并在該MS培養基中每升添加8. 0-8. 5 mg的6-芐基嘌呤，O. 3-0. 35 mg的吲哚丁酸，O. 20-0. 26 mg的吲哚こ酸，18-32 g蔗糖和5g瓊脂粉，pH5. 8-6. O。步驟三中采用的1/2MS培養基是指MS培養基中的大量元素減半，其它元素不變，并在該MS培養基中每升添加O. 08-0. 5g吲哚丁酸，0-0. 14 g吲哚こ酸，20g蔗糖和5g瓊脂粉，ρΗ5· 8-6. O。·
步驟四中采用的1/8MS營養液是指MS培養基中的大量元素為1/8，其它元素不變，并在該MS培養基中每升添加O. 05mg ·じ1吲哚こ酸。由于采用上述的技術方案，與現有技術相比，本發明采用植物組織培養技術成功實現毛葡萄葉片離體再生，毛葡萄再生率可達37%以上，最高可達93. 3%，生根率可達90%以上，成活率可達100%，為毛葡萄遺傳轉化奠定堅實基礎，為葡萄其他優良性狀向毛葡萄的轉移提供了一條有效的途徑；本發明方法簡單，成本低廉，使用效果好。本發明的實施例I :毛葡萄離體再生培養方法，包括以下步驟，
步驟一、無菌系的建立在生長季節選取生長健壯的毛葡萄“花溪-4”新梢為外植體，在自來水下沖洗干凈后，先在體積百分比70%的酒精中浸泡30s，無菌水沖洗3次，再用質量百分比為O. 1%升汞溶液浸泡消毒8min，無菌水沖洗5次，剪成單芽莖段，接種到MS培養基上(每升MS培養基附加2. Omg的6-芐基嘌呤，O. 2mg的吲哚こ酸，20g蔗糖和5g瓊脂粉，ρΗ5· 8-6. O), MS培養基的溫度為25土1°C，光照強度為40umol · s-1 · πΓ2，光照時間為12h/d ;培養誘導至腋芽萌發，獲得誘導的腋芽葉片；
步驟ニ、不定芽誘導取步驟一中獲得的誘導的腋芽葉片剪成O. 5X0. 5cm2見方的小塊，在葉片背面沿葉脈垂直方向劃三刀，正面向上接種到MS培養基上(每升MS培養基添加8. 0-8. 5 mg的6-芐基嘌呤，O. 3-0. 35 mg的吲哚丁酸，O. 20-0. 26 mg的吲哚こ酸，18-32 g蔗糖和5g瓊脂粉，ρΗ5· 8-6. O)，在溫度為25±1°C，光照強度為40umol · s-1 · πΓ2，光照時間為12h/d的條件下培養20d，葉片開始向上卷起，25-30d劃傷處再生出不定芽，30-45d大量產生再生不定芽；45d再生率可達93. 3% ;
步驟三、生根培養取步驟ニ中產生的不定芽，將其接種到1/2MS生根培養基中(1/2MS培養基是指MS培養基中的大量元素減半，其它元素不變，并在該MS培養基中每升添加8. 0-8. 5 mg的6-芐基嘌呤，O. 3-0. 35 mg的吲哚丁酸，O. 20-0. 26 mg的吲哚こ酸，18-32 g蔗糖和5g瓊脂粉，pH5. 8-6. O)，先光下培養7d，再暗培養7d后，然后轉入光下繼續培養至正常生根，獲得試管苗；培養溫度為25±1°C，光照強度為40umol · s—1 · m_2，光照時間為12h/d ；30d后生根率可達92. 5% ；
步驟四、煉苗移栽選取步驟三中生有3-4條根，長為4-5cm的試管苗，在102. Sumol -S-1 ·πΓ2的光照條件下煉苗7d，然后從培養瓶中取出試管苗，洗凈試管苗根部培養基，用質量百分比為O. 1% KMnO4溶液浸根10s，再移栽到滅菌的珍珠巖基質中，用1/8MS營養液(1/8MS營養液是指MS培養基中的大量元素為1/8，其它元素不變，并在該MS培養基中每升添加O. 05mg じ1吲哚こ酸)澆透，之后每隔7d澆灌I次營養液，并從移栽后第2-3d始每隔7d澆灌I次1000倍質量百分比為40%的多菌靈溶液，加蓋與營養缽相同大小的塑料杯保持濕度，置于溫度為25± I°C的培養室內培養至植株長出3-5條新根后移栽到盛有營養土的營養缽中，置于溫室內煉苗30d，最后定植到大田，成活率100%。本發明的實施例2 :毛葡萄離體再生培養方法，包括以下步驟，
步驟一、無菌系的建立在生長季節選取生長健壯的毛葡萄“農院-11”新梢為外植體，在自來水下沖洗干凈后，先在體積百分比為70%的酒精中浸泡30s，無菌水沖洗3次，再用質 量百分比為O. 1%升汞溶液浸泡消毒8min，無菌水沖洗5次，剪成單芽莖段，接種到MS培養基上(每升MS培養基附加2. Omg的6-芐基嘌呤，O. 2mg的吲哚こ酸，20g蔗糖和5g瓊脂粉，ρΗ5· 8-6. O), MS培養基的溫度為25土1°C，光照強度為40umol · s-1 · πΓ2，光照時間為12h/d ;培養誘導至腋芽萌發，獲得誘導的腋芽葉片；
步驟ニ、不定芽誘導取步驟一中獲得的誘導的腋芽葉片剪成O. 5X0. 5cm2見方的小塊，在葉片背面沿葉脈垂直方向劃三刀，正面向上接種到MS培養基上(每升MS培養基添加8. 0-8. 5 mg的6-芐基嘌呤，O. 3-0. 35 mg的吲哚丁酸，O. 20-0. 26 mg的吲哚こ酸，18-32 g蔗糖和5g瓊脂粉，ρΗ5· 8-6. O)，在溫度為25±1°C，光照強度為40umol · s-1 · πΓ2，光照時間為12h/d的條件下培養20d，葉片開始向上卷起，25-30d劃傷處再生出不定芽，30-45d大量產生再生不定芽；35d時再生率可達37. 5% ；
步驟三、生根培養取步驟ニ中產生的不定芽，將其接種到1/2MS生根培養基中(1/2MS培養基是指MS培養基中的大量元素減半，其它元素不變，并在該MS培養基中每升添加
8.0-8. 5 mg的6-芐基嘌呤，O. 3-0. 35 mg的吲哚丁酸，O. 20-0. 26 mg的吲哚こ酸，18-32 g蔗糖和5g瓊脂粉，pH5. 8-6. O)，先光下培養7d，再暗培養7d后，然后轉入光下繼續培養至正常生根，獲得試管苗；培養溫度為25±1°C，光照強度為40umol · s—1 · m_2，光照時間為12h/d ；30d后生根率可達96. 9% ；
步驟四、煉苗移栽選取步驟三中生有3-4條根，長為4-5cm的試管苗，在102. Sumol -S-1 ·πΓ2的光照條件下煉苗7d，然后從培養瓶中取出試管苗，洗凈試管苗根部培養基，用質量百分比為O. 1%ΚΜη04溶液浸根10s，再移栽到滅菌的珍珠巖基質中，用1/8MS營養液(1/8MS營養液是指MS培養基中的大量元素為1/8，其它元素不變，并在該MS培養基中每升添加O. 05mg じ1吲哚こ酸)澆透，之后每隔7d澆灌I次營養液，并從移栽后第2-3d始每隔7d澆灌I次1000倍質量百分比為40%的多菌靈溶液，加蓋與營養缽相同大小的塑料杯保持濕度，置于溫度為25土 1°C的培養室內培養至植株長出3-5條新根后移栽到盛有營養土的營養缽中，置于溫室內煉苗30d，最后定植到大田，成活率100%。花溪_4及農院-11均是從野外收集的貴州野生毛葡萄優良單株，與栽培葡萄品種相比，果粒小，含糖量較低、含酸量較高，但抗病、抗蟲性及抗旱性好，既可作為釀酒葡萄栽培，也可用于砧木利用，更是提高栽培品種抗性的優良親本。
權利要求
1.ー種毛葡萄離體再生培養方法，其特征在于包括以下步驟， 步驟一、無菌系的建立在生長季節選取生長健壯的毛葡萄新梢作為外植體，用自來水沖洗干凈，在超凈工作臺上，先用體積百分比為70%的酒精漂洗30s，再用無菌水沖洗3次后，用質量百分比為O. 1%的升汞溶液浸泡消毒8-lOmin后，用無菌水沖洗5-6次，然后剪除新梢兩端褐化部分后，剪成單芽莖段，接種到MS培養基中，在溫度為25土 1°C，光照強度為40umol · S-1 · m_2，光照時間為12h/d的培養條件下，培養誘導至腋芽萌發，獲得誘導的腋芽葉片； 步驟ニ、不定芽誘導取步驟一中獲得的誘導的腋芽葉片剪成O. 5X0. 5cm2見方的小塊，在葉片背面沿葉脈垂直方向劃三刀，正面向上接種到MS培養基上，在溫度為25±1°C，光照強度為40umol · S-1 · m_2，光照時間為12h/d的條件下培養20d，葉片開始向上卷起，25-30d劃傷處再生出不定芽，30-45d大量產生再生不定芽； 步驟三、生根培養取步驟ニ中產生的不定芽，將其接種到1/2MS生根培養基中，先光下培養7d，再暗培養7d后，然后轉入光下繼續培養至正常生根，獲得試管苗；培養溫度為25±1°C,光照強度為40umol · s_1 · πΓ2，光照時間為12h/d ； 步驟四、煉苗移栽選取步驟三中生有3-4條根，長為4-5cm的試管苗，在102. Sumol · s—1 · πΓ2的光照條件下煉苗7d，然后從培養瓶中取出試管苗，洗凈試管苗根部培養基，用質量百分比為O. 1%ΚΜη04溶液浸根10s，再移栽到滅菌的珍珠巖基質中，用1/8MS營養液澆透，之后每隔7d澆灌I次營養液，并從移栽后第2-3d始每隔7d澆灌I次1000倍質量百分比為40%的多菌靈溶液，加蓋與營養缽相同大小的塑料杯保持濕度，置于溫度為25土 TC的培養室內培養至植株長出3-5條新根后移栽到盛有營養土的營養缽中，置于溫室內煉苗30d，最后定植到大田即可。
2.根據權利要求I所述的毛葡萄離體再生培養方法，其特征在于步驟一中采用的MS培養基為國際通用的培養基，并在該MS培養基中每升添加2. Omg的6-芐基嘌呤，O. 2mg的吲哚こ酸，20 g蔗糖和5g瓊脂粉，其pH值為5. 8-6. O。
3.根據權利要求I所述的毛葡萄離體再生培養方法，其特征在于步驟ニ中采用的培養基為國際通用的培養基，并在該MS培養基中每升添加8. 0-8. 5 mg的6-芐基嘌呤，O. 3-0. 35 mg的吲哚丁酸，O. 20-0. 26 mg的吲哚こ酸，18-32 g蔗糖和5g瓊脂粉，pH5. 8-6. O。
4.根據權利要求I所述的毛葡萄離體再生培養方法，其特征在于步驟三中采用的1/2MS培養基是指MS培養基中的大量元素減半，其它元素不變，并在該MS培養基中每升添加O. 08-0. 5g吲哚丁酸，0-0. 14 g吲哚こ酸，20g蔗糖和5g瓊脂粉，pH5. 8-6. O。
5.根據權利要求I所述的毛葡萄離體再生培養方法，其特征在于步驟四中采用的1/8MS營養液是指MS培養基中的大量元素為1/8，其它元素不變，并在該MS培養基中每升添加O. 05mg ·じ1卩引哚こ酸。
全文摘要
本發明公開了一種毛葡萄離體再生培養方法，包括以下步驟無菌系的建立、不定芽誘導、生根培養及煉苗移栽。本發明采用植物組織培養技術成功實現毛葡萄葉片離體再生，毛葡萄再生率可達37%以上，最高可達93.3%，生根率可達90%以上，成活率可達100%，為毛葡萄遺傳轉化奠定堅實基礎，為葡萄其他優良性狀向毛葡萄的轉移提供了一條有效的途徑。本發明方法簡單，成本低廉，使用效果好。
文檔編號A01H4/00GK102742507SQ20121027355
公開日2012年10月24日 申請日期2012年8月3日 優先權日2012年8月3日
發明者劉偉, 張文娥, 潘學軍, 馬孟增 申請人:貴州大學