專利名稱：轉基因提高丹參中迷迭香酸含量的方法
技術領域：
本發明屬于藥用植物基因工程技術領域，具體涉及到在丹參中轉化金魚草Roseal基因提高迷迭香酸含量的方法。
背景技術：
丹參是我國常用大宗道地藥材，為唇形科鼠尾草屬植物丹參(Salviamiltiorrhiza Bunge)的干燥根及根莖,對心腦血管疾病、癌癥及各種炎癥具有顯著的臨床治療作用。隨著丹參有效成分及其藥理活性的深入研究，近年來以丹參為主要原料的藥品、制劑、化妝品和系列保健產品層出不窮，丹參資源供不應求。伴隨著丹參藥材需求的日益擴大和野生資源的逐漸減少，人工種植面積逐年增大。然而作為常異交植物，丹參種內變異較大，性狀復雜。栽培丹參只種不選的狀況使得各產地丹參質量參差不齊，品種退化嚴重，有效成分含量不穩定，成為丹參作為高品質植物藥大規模進軍國際市場的最大障礙之一。因 此，提高丹參中有效成分的含量，尤其是迷迭香酸的含量，對培育優異的丹參資源具有重要意義。為了提高品質、滿足市場需求，近年來利用基因工程、細胞工程等現代生物技術手段對丹參進行改良以提高其藥材有效成分的含量愈來愈受到人們的重視。在諸多方法之中，利用基因工程技術對藥用植物次生代謝途徑的遺傳特性進行改造，提高藥用植物有效成分含量，培育能夠大量積累目標次生代謝物的新品種，愈來愈受到人們的關注。以轉基因技術為核心的現代分子育種技術在改良藥用植物、豐富中藥資源、提高抗病性和抗逆性、培育高天然藥物含量的新型轉基因藥材中有著誘人的應用前景。但目前利用轉基因技術提高丹參中丹參酚酸類成分的含量，特別是迷迭香酸含量的方法尚無報道。植物代謝途徑是由多種酶參與的多步反應，受發育、環境等因素的影響，而對單個基因進行修飾有時難以奏效。轉錄調控因子可調控植物次生代謝物合成途徑中多個關鍵酶基因的表達，有效地激活或抑制整條代謝途徑，從而調節特定次生代謝物質的合成與否以及積累量的多少。改變轉錄因子的表達往往可導致植物中該轉錄因子所控制性狀發生較大改變，因此，利用基因工程的方法調控轉錄因子是具有應用價值的植物遺傳操作手段。本發明通過構建轉錄因子過表達載體，將金魚草Roseal基因導入丹參中，提高丹參中迷迭香酸的含量，可以填補該領域研究的空白，因而該技術路線具有較強的創新性。

發明內容
本發明所要解決的技術問題在于克服上述技術中的不足，提供一種提高丹參中迷迭香酸含量的新方法。解決上述技術問題所采用的技術方案包括下述步驟I、金魚草Roseal基因的克隆提取金魚草總RNA并反轉錄成cDNA備用，設計金魚草Roseal基因編碼框的上游引物、下游引物，并在上游引物上引入BglII限制性酶切位點和保護堿基GAAGATCT，下游引物上引入BstEII限制件酶切位點和保護堿基CAGGGTCACC,上游引物的序列為5’ -GAAGATCTATGGAAAAGAATTGTCGTGGAGT-3'下游引物的序列為 5’-CAGGGTCACCTTAATTTCCAATTTGTTGGGCCT-3’，以金魚草cDNA為模板，經聚合酶鏈式反應擴增，獲得的擴增產物進行電泳分離，回收擴增產物與PMD19-T Simple載體用T4DNA連接酶連接，連接產物采用熱激轉化法轉入大腸桿菌DH5a，連接產物與大腸桿菌DH5a的體積比為I : 10，連接產物轉入100 μ L大腸桿菌DH5 a感受態細胞中，隨機挑選所得陽性克隆，經菌落聚合酶鏈式反應檢測、測序驗證得到所述基因的編碼序列如下
權利要求
1.ー種轉基因提高丹參中迷迭香酸含量的方法，其特征在于該方法包括下述步驟 (1)金魚草Roseal基因的克隆 提取金魚草總RNA并反轉錄成cDNA備用，設計金魚草Roseal基因編碼框的上游引物、下游引物，并在上游引物上引入BglII限制性酶切位點和保護堿基GAAGATCT，下游引物上引入BstEII限制件酶切位點和保護堿某CAGGGTCACC，卜.游引物的序列為5’ -GAAGATCTATGGAAAAGAATTGTCGTGGAGT-3’，下游引物的序列為 5’ -CAGGGTCACCTTAATTTCCAATTTGTTGGGCCT-3’，以金魚草cDNA為模板，經聚合酶鏈式反應擴增，獲得的擴增產物進行電泳分離，回收擴增產物與PMD19-T Simple載體用T4DNA連接酶連接，連接產物采用熱激轉化法轉入大腸桿菌DH5 α，連接產物與大腸桿菌DH5 α的體積比為I : 10，連接產物轉入100 μ L大腸桿菌DH5a感受態細胞中，隨機挑選所得陽性克隆，經菌落聚合酶鏈式反應檢測、測序驗證得到所述基因的編碼序列如下atggaaaaga attgtcgtgg agtgagaaaa ggtacttgga ccaaagaaga 50agacactctc ttgaggcaat gtatagaaga gtatggtgaa gggaaatggc 100atcaagttcc acacagagca gggttgaacc ggtgtaggaa gagttgcagg 150ctgaggtggt tgaattatct gaggccaaat atcaaaagag gtcggttttc 200gagagatgaa gtggacctaa ttgtgaggct tcataagctg ttgggtaaca 250aatggtcgct gattgctggt agaattcctg gaaggacagc taatgacgtg 300aagaactttt ggaatactca tgtggggaag aatttaggcg aggatggaga 350acgatgccgg aaaaatgtta tgaacacaaa aaccattaag ctgactaata 400tcgtaagacc ccgagctcgg accttcaccg gattgcacgt tacttggccg 450agagaagtcg gaaaaaccga tgaattttca aatgtccggt taacaactga 500tgagattcca gattgtgaga agcaaacgca attttacaat gatgttgcgt 550cgccacaaga tgaagttgaa gactgcattc agtggtggag taagttgcta 600gaaacaacgg aggatgggga attaggaaac ctattcgagg aggcccaaca 650aattggaaat taa66^ (2)構建含有金魚草Roseal基因的植物表達載體 用BglII和BstEII雙酶切含有金魚草Roseal基因的pMD 19-T Simple載體和pCAMBIA-1302植物表達載體，回收的酶切產物，用T4DNA連接酶連接，連接產物采用熱激轉化法轉化大腸桿菌DH5 α，挑取單克隆，進行菌落聚合酶鏈式反應檢測和提取質粒酶切篩選陽性克隆，得到含有金魚草Roseal基因的植物表達載體,該表達載體序列如核苷酸序列表<210>2 ； (3)制備含有金魚草Roseal基因的植物表達載體的根瘤農桿菌菌株 將含有金魚草Roseal基因的植物表達載體轉化根瘤農桿菌ΕΗΑ105感受態細胞，采用液氮凍融法進行轉化，轉化后的產物于28°C恒溫培養箱中倒置培養18 36小吋，挑取抗性單菌落進行菌落聚合酶鏈式反應篩選，獲得含有金魚草Roseal基因植物表達載體的根瘤農桿菌菌株； (4)制備轉基因丹參植株 采用常規組織培養方法獲得無菌丹參試管苗，根瘤農桿菌介導的丹參遺傳轉化體系采用葉盤法，即將繼代培養15天的丹參無菌苗葉片切成小塊，轉入每IL培養基中含有IOmL濃度為I. Omg/mL的6-芐氨基腺嘌呤、ImL濃度為I. Omg/mL的a_萘こ酸的MS培養基上預培養I天，用含有金魚草Roseal基因植物表達載體的根瘤農桿菌菌株浸染預培養過的丹參葉片，浸染方法為28°C恒溫100轉/分鐘浸染25 30分鐘，浸染過的葉片置于每IL培養基中含有IOmL濃度為I. Omg/mL的6-芐氨基腺嘌呤、ImL濃度為I. Omg/mL的a_萘こ酸的MS培養基上暗培養2 3天至葉片邊緣有農桿菌長出，葉片從培養基上取出，轉接到每IL培養基中含有IOmL濃度為3mg/mL的潮霉素和IOmL濃度為200mg/mL的頭孢霉素的MS培養基中進行培養，長出抗性芽后將其轉入到每IL培養基中含有IOmL濃度為3mg/mL的潮霉素和IOmL濃度為200mg/mL的頭孢霉素的1/2MS培養基上生根，獲得潮霉素抗性的再生丹參植株，用金魚草Roseal基因的特異性檢測引物聚合酶鏈式反應擴增再生丹參植株的DNA，波長為302nm的紫外線下觀察到663bp目的條帶的陽性株系即為轉基因丹參植株。
2.根據權利要求I所述的轉基因提高丹參中迷迭香酸含量的方法，其特征在于在構建含有金魚草Roseal基因的植物表達載體步驟(2)中，所述的用BglII和BstEII雙酶切為取含有金魚草Roseal基因的pMD19_T Simple載體、IOXH Buffer、二次蒸懼水、限制性內切酶BglII于37°C反應I小時20分鐘，再加入限制性內切酶BstEII，60°C反應I小時，限制性內切酶BglII與限制性內切酶BstEII、含有金魚草Roseal基因的pMD19-TSimple載體、二次蒸餾水、IOXHBuffer的體積比為3 3 20 19 5 ； 取？041^從-1302植物表達載體、10父!1 Buffer、二次蒸餾水、限制性內切酶BglII于37°C反應I小時20分鐘，再加入限制性內切酶BstEII，60°C反應I小時，限制性內切酶BglII與限制性內切酶BstEII、pCAMBIA-1302植物表達載體、二次蒸餾水、IOXH Buffer的體積比為3 3 20 19 :5。
全文摘要
一種轉基因提高丹參中迷迭香酸含量的方法，該方法包括金魚草Rosea1基因的克隆、構建含有金魚草Rosea1基因的植物表達載體、制備含有金魚草Rosea1基因的植物表達載體的根癌農桿菌菌株、制備轉基因丹參植株4個步驟。實時熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈式反應檢測轉基因丹參中金魚草Rosea1基因的表達；對表達金魚草Rosea1基因的轉基因丹參中迷迭香酸含量進行高效液相色譜測定，篩選得到迷迭香酸含量提高的轉基因丹參植株。采用本發明獲得的轉基因丹參植株，生長90天的干燥根中，迷迭香酸的含量高達129.37±3.47mg/g，是非轉化普通丹參干燥根中迷迭香酸含量的2.16倍。
文檔編號A01H5/00GK102827866SQ201210351718
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月20日 優先權日2012年9月20日
發明者王喆之, 陳玉芹, 宋銀, 姚偉, 王東浩 申請人:陜西師范大學