一種含乳酸菌的復(fù)合益生菌飼料添加劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種含乳酸菌的復(fù)合益生菌飼料添加劑，是由40-60％的嗜酸乳酸桿菌、15-20％的嗜淀粉乳酸桿菌、5-10％唾液乳酸桿菌、5-10％嗜熱鏈球菌、5-10％多形擬桿菌和5-10％的葡萄糖經(jīng)噴霧冷凍干燥復(fù)合形成。所有菌株均分離自豬腸道食糜。本發(fā)明中考慮了動(dòng)物腸道的各個(gè)部分，將腸道前段產(chǎn)乳酸的乳酸菌與腸道后段分解纖維素和多糖的多形擬桿菌相結(jié)合，菌種間的配合比例與健康動(dòng)物腸道中相應(yīng)菌的組成相近，能更好地發(fā)揮彼此的優(yōu)勢(shì)，更好地促進(jìn)動(dòng)物的健康，提高飼料消化率，提高動(dòng)物生產(chǎn)性能。
【專利說明】一種含乳酸菌的復(fù)合益生菌飼料添加劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種含乳酸菌的復(fù)合益生菌飼料添加劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]健康動(dòng)物腸道的各個(gè)部分都定殖著一種典型的微生物，并與動(dòng)物形成有益的共生關(guān)系。由于集約化高密度養(yǎng)殖方式的出現(xiàn)，家畜對(duì)腸道菌群失衡相當(dāng)敏感，從而導(dǎo)致對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收能力降低，生長(zhǎng)遲滯。為了克服這些困難，人們向動(dòng)物飼糧中添加抗生素。事實(shí)也表明，這一做法在降低腹泄和促進(jìn)生長(zhǎng)方面相當(dāng)有效。可是，有害微生物抗藥性的產(chǎn)生對(duì)獸藥抗生素的使用造成了嚴(yán)重的干擾，并且抗生素本身的效用也因此而降低，且存在殘留問題及與人類致病菌產(chǎn)生交叉耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)，從而對(duì)人類健康造成潛在危害。抗生素抗藥性從動(dòng)物傳遞給人的可能性及消費(fèi)者對(duì)此的警醒，使得禁止在飼料中使用抗生素及限制獸用抗生素的使用成為畜禽養(yǎng)殖的必然趨勢(shì)。
[0003]基于以上原因，尋求一種更天然的飼用添加劑，即益生菌，則成為人們廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)。早期關(guān)于酸乳產(chǎn)品對(duì)人類有益作用的研究發(fā)現(xiàn)，腸道微生物群落中最有益的部分為乳酸菌。乳酸菌在各種商品益生菌制劑中最為常見，其次為芽胞桿菌。
[0004]在動(dòng)物的胃腸道中，由于環(huán)境pH值、滲透壓、可發(fā)酵底物等因素的變化，菌群的分布呈現(xiàn)出明顯的區(qū)域性(表1)。因而由單一菌株或單一菌株復(fù)合物組成的乳酸菌類產(chǎn)品很難在整個(gè)腸道中形成優(yōu)勢(shì)菌群。
[0005]表1.豬和禽胃 腸道主要部位分布的主要菌群。
[0006]
【權(quán)利要求】
1.一種含乳酸菌的復(fù)合益生菌飼料添加劑，其特征在于:是由40-60%的嗜酸乳酸桿菌、15-20%的嗜淀粉乳酸桿菌、5-10%唾液乳酸桿菌、5-10%嗜熱鏈球菌、5-10%多形擬桿菌和5-10%的葡萄糖經(jīng)噴霧冷凍干燥復(fù)合形成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的含乳酸菌的復(fù)合益生菌飼料添加劑，其特征在于:所有菌株均分離自豬腸道食糜。
3.一種含乳酸菌的復(fù)合益生菌飼料添加劑的制備方法:其特征在于，包括以下步驟: A、動(dòng)物腸道中嗜酸乳酸桿菌、嗜淀粉乳酸桿菌、唾液乳酸桿菌、嗜熱鏈球菌和多形擬桿菌的分離、純化與鑒定: Al、樣本的采集與稀釋: 無菌取豬空腸和盲腸內(nèi)容物各lg，分別置于含有小玻璃珠的滅菌三角瓶?jī)?nèi)(50mL)，按I: 10 (g: V)的比例加入滅菌生理鹽水，充分振蕩30分鐘，使其成為均勻的懸液，此懸液為第一個(gè)稀釋度(10-1)，另取滅菌小試管若干，每支加入滅菌生理鹽水4.5mL,取10_1稀釋液0.5mL加入第二管混勻得第二稀釋度(10-2)，依次類推作遞減稀釋，終稀釋度為10-11 ； A2、配制選擇性培養(yǎng)基: 嗜酸乳酸桿菌、嗜淀粉乳酸桿菌和唾液乳酸桿菌的選擇性培養(yǎng)基制備方法如下:酪朊水解物10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、檸檬酸二銨2g、吐溫801.0mL、三水醋酸鈉25g、磷酸二氫鉀6g、七水硫酸鎂0.58g、七水硫酸亞鐵0.03g、四水硫酸猛0.15g、瓊脂15g，調(diào)節(jié)pH至5.4，于121 °C滅菌15min，傾注滅菌平皿，-4°C保存?zhèn)溆茫? 嗜熱鏈球菌的選擇性培養(yǎng)基制備方法如下:胰蛋白胨10g、大豆蛋白胨5g、牛肉浸膏5g、酵母浸膏5g、葡萄糖20g、氯化鈉5g、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.3g、瓊脂15g、蒸懼水1L、試劑A、試劑B，將以上成分加熱溶于IL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至6.1，于121°C滅菌15min，冷卻至約500C，加入試劑A和試劑B，前者IOOmL,后者10mL，混勻后傾注滅菌平皿，_4°C保存?zhèn)溆茫? 多形擬桿菌的分離選用NBGT血瓊脂培養(yǎng)基其制備方法如下:馬肉浸液930mL、脒蛋白胨10g、酵母浸膏5g、葡萄糖1.5g、L-胱氨酸0.2g、L-半胱氨酸0.5g、?；悄懰徕clg、瓊脂15g，將各固體成分加熱溶化于馬肉浸液中，調(diào)pH至7.8，于121°C滅菌15min。冷卻至約50°C，每95mL，以無菌操作加入新霉素(2mg/mL水溶液)0.2mL, 0.1 %煌綠水溶液0.1mL和脫纖維馬血5mL，混勻后傾注滅菌平皿，于-4°C下保存?zhèn)溆茫? A3、接種: 選擇10-5、10-6和10-7三個(gè)稀釋度進(jìn)行接種，每個(gè)稀釋度接種三個(gè)平皿，每個(gè)平皿接種IOOuL懸池液，接種后用涂布器涂布均勾。 培養(yǎng)結(jié)束后于平皿中選擇疑似菌落在相應(yīng)的培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，以達(dá)到純化菌種的目的，培養(yǎng)條件同上； A4、鑒定: 提取純化后各菌株的DNA和16S rRNA進(jìn)行堿基序列分析，并用BLAST軟件包中的Clustal W程序與GeneBank中的堿基序列進(jìn)行對(duì)比,DNA序列相似度大于70%且16S rRNA序列相似度大于90%時(shí)判定為該菌株； B、擴(kuò)大培養(yǎng) B1、一次擴(kuò)培: 一次擴(kuò)培培養(yǎng)基制備方法如下:嗜酸乳酸桿菌、嗜淀粉乳酸桿菌、唾液乳酸桿菌和嗜熱鏈球菌的擴(kuò)培培養(yǎng)基配方如下:大豆蛋白胨50 g、牛肉浸膏50g、酵母浸膏50g、葡萄糖200g、乳糖20g、鮮柑桔汁50mL，將以上組份溶解于IL去離子水中，于121°C條件下滅菌20min，冷卻后-4°C保存?zhèn)溆茫? 多形擬桿菌擴(kuò)培培養(yǎng)基配方如下:酪蛋白胨10g、大豆蛋白胨3g、脒蛋白胨10g、酵母浸膏5g、牛肉浸膏2.2g、葡萄糖3g、磷酸二氫鈉2.5g、血清消化蛋白胨或消化血液13.5g、氯化鈉3g、可溶性淀粉5g、L-半胱氨酸0.3g、硫乙醇酸納0.3g，將以上組份溶解于IL去離子水中，調(diào)節(jié)pH至7.3，于121°C條件下滅菌15min，冷卻后-4°C保存?zhèn)溆茫? 將一次擴(kuò)培培養(yǎng)基分裝于IOOmL培養(yǎng)瓶中，每瓶分裝20mL，用接種絲挑取經(jīng)鑒定后的嗜酸乳酸桿菌、嗜淀粉乳酸桿菌、唾液乳酸桿菌和嗜熱鏈球菌菌落，分別接種到培養(yǎng)基中，在36°C下，一個(gè)大氣壓的90%氮?dú)?10%二氧化碳環(huán)境中厭氧靜置培養(yǎng)16-18h，待pH為3.8-4.5時(shí),一次擴(kuò)培完成。多形擬桿菌于37°C條件下,厭氧靜置培養(yǎng)76h ； B2、二次擴(kuò)培:二次擴(kuò)培培養(yǎng)基制備方法如下: 嗜酸乳酸桿菌、嗜淀粉乳酸桿菌、唾液乳酸桿菌和嗜熱鏈球菌的擴(kuò)培培養(yǎng)基配方如下:大豆蛋白胨200g、棉籽糖20g、鮮柑桔汁IOOmU氯化鈉10g，將以上組份溶解于2L蒸餾水中，放置到容量為4L的小型 發(fā)酵罐中，于121°C條件下滅菌20min備用； 多形擬桿菌二次擴(kuò)培培養(yǎng)基配方如下:胰化酪蛋白胨150g、大豆蛋白胨50g、磷酸氫二鉀25g、氯化鈉50g、可溶性淀粉5g、L-半胱氨酸0.3g、硫乙醇酸納0.3g，將以上組份溶解于IL去離子水中，調(diào)節(jié)pH至7.3，放置于2L的小型發(fā)酵罐中，于121°C條件下滅菌15min備用； 將各個(gè)菌株的一次擴(kuò)培發(fā)酵液同時(shí)接種到二次擴(kuò)培培養(yǎng)基中，乳酸菌在40°C溫度下恒溫厭氧靜置培養(yǎng)12-14h，pH達(dá)3.8-4.5時(shí)完成二次擴(kuò)培；多形擬桿菌在37°C下恒溫厭氧靜置培養(yǎng)48h后完成二次擴(kuò)培； B3、收集發(fā)酵菌泥: 將二次擴(kuò)培得到的發(fā)酵液無菌操作裝入離心管中，25°C條件下，lOOOOrpm/min離心5min，棄去上清液，所得離心沉淀物即為菌泥，用1%蛋白胨水溶液將菌泥重新懸浮成為懸濁液，且使細(xì)菌濃度約為109cfu/mL ； B4、噴霧急速冷凝法對(duì)各菌株進(jìn)行微膠囊包被處理 B41、海藻酸鹽混合物的制備:將海藻酸鈉2% (w/v)、MRS肉湯5.5% (w/v)，甘油5%(w/v)、黃源膠0.26% (w/v)、吐溫200.1 % (w/v)和細(xì)菌懸濁液20% (w/v)加入一定量的蒸餾水中混勻即得； B42、將以上混合物注入霧化器中霧化，霧化時(shí)空氣壓力為0.6kgf/cm2，液體壓力為0.4kgf/cm2 ； B43、霧化后的液體微滴用裝有適量氯化鈣溶液(0.5mol/L)的收集槽中，收集過程中通過磁力攪拌器不輕輕攪拌氯化鈣溶液； B44、液體微滴在氯化鈣溶液中硬化15min，然后用高密篩網(wǎng)過濾，并用蒸餾水洗滌兩次，然后再轉(zhuǎn)入殼聚糖乳酸溶液中，輕輕攪拌15min使海藻酸鹽微膠囊表面被均勻包被；B45、再將B44處理后的微膠囊過濾并洗滌后，于_72°C冷凍干燥6h，然后于_75°C再干燥18h，干燥時(shí)壓力設(shè)定為5.33Pa。
【文檔編號(hào)】A23K1/16GK103652322SQ201210353138
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年9月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月21日
【發(fā)明者】劉洋 申請(qǐng)人:臨沂思科生物科技有限公司