具有生物活性的動物精液保存劑及其制備方法
【專利摘要】本發明的目的是提供一種動物精液保存液及其制備方法，其中含有寡聚原花青素，起抗氧化作用，可延長精液的保存時間，保持動物精子活力。是由1000mL的普通介質和16mg寡聚原花青素混合而成，所述普通介質是由6份葡萄糖、0.37份EDTA、0.375份二水檸檬酸鈉、0-0.12份碳酸氫鈉、0.1份新霉素和100份蒸餾水混合而成，新霉素在精液稀釋前單獨添加。配方中含有寡聚原花青素，起抗氧化作用，可延長精液的保存時間，寡聚原花青素能緩減精液樣本的降解，且對精子活力沒有負作用，保持動物精子活力，特別是對低溫保藏的精子存活率有明顯的提高。
【專利說明】具有生物活性的動物精液保存劑及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種具有生物活性的動物精液保存劑及其制備方法。
【背景技術】
[0002]人工授精(Artificial insemination, Al)技術與體外受精和胚胎移植技術一起極大地提高了動物的繁殖效率。與自然交配相比，以上技術具有許多優勢。就家畜育種而言，以上技術能更快更廣地將我們所期望的遺傳特征進行傳播。一頭公畜的精液可以為多頭母畜授精，人工授精所需的公畜僅為自然交配所需公畜數的四分之一，因而可以節省飼養成本。并且，通過人工授精可以更好地對整個種群進行控制，提高繁殖效率，便于大規模生產。
[0003]人工授精和體外受精技術的關鍵是維持繁殖細胞的活力。人工授精所用的精液，其處理過程因動物品種不同而異。例如，牛的精液需要較低的精子密度，精子密度適當的精液可在吸管中迅速冷凍，在貯存較長時間后也不會對精子活力產生不利影響。相反，豬的精液就不適合上述方法。豬的精液體積大，精子數量多，因而在給母豬授精前需要對精液進行稀釋。使用冷凍精液對母豬進行人工授精的效果并不理想。公豬的精液在運輸前需要用適當的保存液進行稀釋，并冷卻到約17°C。這種保存液的作用是增加精液的體積，并為精子細胞提供營養物質。精液在貯存幾天后，精子活力也會顯著降低。
[0004]目前，最好的具有生物活性的動物精液保存劑可以維持公豬的精子活力約3-7天。這么短的保存時間為豬的人工授精帶來不少限制。有許多商品化的具有生物活性的動物精液保存劑，包括短期、中期和長期保存劑。保存劑以固體形式出售，用水稀釋后使用。
[0005]各種動物的具有生物活性的動物精液保存劑中都含有適合該種動物的緩沖鹽、能量物質和抗生素。典型的保存劑中至少含有一種緩沖鹽(如碳酸氫鈉或HEPES)和一種碳源(如葡萄糖)。另外還可能含有乙二胺四乙酸(EDTA)、牛血清蛋白，及一種或多種抗生素。在實際使用過程中，使用者需要配制出適合相應動物的保存劑。保存劑的PH值通常在
6.5-7.5,6.8-7.2較為適合。細胞中蛋白質、DNA和RNA的交聯導致有機生命體衰老。這種交聯是自由基引起的，已經證實自由基引起生命大分子交聯是導致衰老的主要原因之一。自由基是氧的不穩定存在形式，在機體正常代謝過程也會產生。化學物質、環境污染物、陽光、輻射、藥物、酒精、病毒、細菌和寄生蟲也會誘導機體產生大量的自由基。當機體內的自由基氧化過度時，就會損壞細胞膜和細胞組件，如膠原蛋白和彈性蛋白。
[0006]寡聚原花青素(Oligomeric Proanthocyanidins,OPCs)是從葡萄籽、葡萄皮和松樹皮中提取的抗氧化物質，是一組生物黃酮類分子組成的復合物，在機體內作為自由基清除劑。OPCs的抗氧化能力是維生素E的50倍，維生素C的20倍，是迄今為止發現的最好的天然抗氧化劑之一。此外，它還有防癌抗癌，防治心血管疾病，抗輻射，調節免疫力，改善人體微循環及保護皮膚等多種作用，是歐洲等國最受歡迎的植物藥之一。OPCs是含雙黃酮衍生物的天然多酚類化合物的總稱，是由不同數量的兒茶素(Catechin)、表兒茶素(Epicatechin, EC)、 表沒食子兒茶素(Epigallocatechin, EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(Epicatechin gal late, ECG)和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)等經C4-C6或C4-C8鍵縮合而成。通常將聚合度較低的二~四聚體稱為低聚原花青素或寡聚原花青素(Oligomeric Proanthocyanidins, OPCs),將五聚體及以上多聚體稱為高聚原花青素或多聚原花青素(Polymeric Proanthocyanidins,PPCs)。由于鍵合位置及構象的不同，原花青素存在多種異構體，這給天然產物中原花青素純組分的分離及分析帶來了相當的難度。在二聚體中，已分離鑒定的就有8種結構形式，分別命名為BI~B8等等。三聚體中，也因參與構成組分的單體及其相連接碳原子位置的不同形成各種結構，并分別被命名為Cn(n= 1，2..)。在自然界中，一般二聚體分布較廣，研究得也較多。綠茶中含有豐富的EGCG，含量高于松樹皮和葡萄籽。葡萄籽中EGCG的含量約占總OPCs含量的15%，而綠茶中EGCG的含量約占總OPCs的50%。
[0007]各種動物的具有生物活性的動物精液保存劑中都含有適合該種動物的緩沖鹽、能量物質和抗生素。典型的保存劑中至少含有一種緩沖鹽(如碳酸氫鈉或HEPES)和一種碳源(如葡萄糖)。另外還可能含有乙二胺四乙酸(EDTA)、牛血清蛋白，及一種或多種抗生素。但是目前的保存劑中卻缺少防止精液免于自由基氧化而使活性降低的抗氧化劑成份。

【發明內容】

[0008]為解決上述技術問題，本發明提供一種動物精液保存液及其制備方法，其中含有寡聚原花青素，起抗氧化作用，可延長精液的保存時間，保持動物精子活力。
[0009]一種具有生物活性的動物精液保存劑，是由1000mL的普通介質和16mg寡聚原花青素混合而成，所述普通介質是由6份葡萄糖、0.37份EDTA、0.375份二水檸檬酸鈉、0-0.12份碳酸氫鈉、0.1份新霉素和100份蒸餾水混合而成，新霉素在精液稀釋前單獨添加。[0010]進一步的，所述的寡聚原花青素包括白花色苷和花青苷。
[0011]進一步的，所述的寡聚原花青素可來源于松樹皮、葡萄籽、葡萄皮、越桔、酸果蔓、綠茶和紅茶。
[0012]一種具有生物活性的動物精液保存劑的制備方法，包括以下步驟:
[0013]S1.制備兩種粉狀介質，這兩種粉狀介質中至少有一種介質含有至少一種寡聚原
花青素；
[0014]S2.將兩種粉狀介質混合在一起；
[0015]S3.將兩種粉狀介質的混合物用純水稀釋成溶液；
[0016]S4.將豬精液樣本加入到溶液中，最好是采集后立即加入；
[0017]S5.使精液樣本與溶液的滲透壓相平衡，然后分成一定的體積保存，其中OPCs可緩減精液的降解，并對精子活力無負面影響，另外保存液的PH值低于7.5，滲透壓約低于350m0sm。
[0018]進一步的，上述粉狀介質中可至少含有兩種、三種或四種寡聚原花青素。
[0019]與現有技術相比本發明的有益效果為:由于本發明提供一種動物精液保存液的配方中含有寡聚原花青素，起抗氧化作用，可延長精液的保存時間，寡聚原花青素能緩減精液樣本的降解，且對精子活力沒有負作用，保持動物精子活力，特別是對低溫保藏的精子存活率有明顯的提1?。【具體實施方式】
[0020]下面對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0021]一種具有生物活性的動物精液保存劑，是由1000mL的普通介質和16mg寡聚原花青素混合而成，所述普通介質是由6g葡萄糖、0.37gEDTA、0.375g 二水檸檬酸鈉、0.12g碳酸氫鈉、0.1g新霉素和100ml蒸懼水混合而成,新霉素在精液稀釋前單獨添加。
[0022]進一步的，所述的寡聚原花青素包括白花色苷和花青苷。
[0023]進一步的，所述的寡聚原花青素可來源于松樹皮、葡萄籽、葡萄皮、越桔、酸果蔓、綠茶和紅茶。
[0024]一種具有生物活性的動物精液保存劑的制備方法，包括以下步驟:
[0025]S1.制備兩種粉狀介質，這兩種粉狀介質中至少有一種介質含有至少一種寡聚原
花青素；
[0026]S2.將兩種粉狀介質混合在一起；
[0027]S3.將兩種粉狀介質的混合物用純水稀釋成溶液；
[0028]S4.將豬精液樣 本加入到溶液中，最好是采集后立即加入；
[0029]S5.使精液樣本與溶液的滲透壓相平衡，然后分成一定的體積保存，其中OPCs可緩減精液的降解，并對精子活力無負面影響，另外保存液的PH值低于7.5，滲透壓約低于350m0sm。
[0030]進一步的，上述粉狀介質中可至少含有兩種、三種或四種寡聚原花青素。
[0031]本發明的制備過程如下:
[0032]1.試劑準備:在采集精液前，首先配制具有生物活性的動物精液保存劑的相關組分。
[0033]貝茲維爾解凍液(BTS)溶液的配制按生產商說明書進行配制。然后再根據后續處理需要加足量的其它組分。取以上溶液75mL注入IOOmL的用于保存精液的塑料管中。
[0034]2.精液的收集、處理和貯存:隨機選擇性成熟的公豬進行人工采精。每次采集精液后，用光度計(546nm濾光器)檢測精液中精子的濃度。至少數10組精子的數量，然后評定這10組精子中活動精子的百分數。將每頭公豬的精液分成體積相等的若干份，每份含活動精子數1*109，在36±0.1°C的溫度下將上述分成等份的精液分別加入75mL精液保存液中，使得每個塑料管中的活精子濃度為4*107。精液分散到保存液中后，測定每個塑料管中的可活動精子數(精子活力)。
[0035]3.樣品的保存和數據的收集:將精液樣本貯存在35°C的條件下。并周期性在輕輕將塑料管中的精液混勻。在貯存的第0、1和2天，將樣本輕輕混勻后取出5mL進行檢測精子活力。將載玻片預熱至37°C，于精子活力檢測時使用。通過檢測高代謝率、高自由基產量條件下精液中的精子活力來評定OPCs的作用效果，所得結果與不含OPCs的精液保存液中的精子活力相比較，以判定OPCs的作用效果。
[0036]將貝茲維爾解凍液(BTS)與葡萄籽提取物混合形成具有生物活性的動物精液保存劑，且使保存劑中葡萄籽提取物的濃度為8mg/L、16mg/L或25mg/L。在貯存的第I天和第2天檢測精子活力，貯存溫度為37°C。結果總結于表1。對于公豬B，在高代謝率、高自由基產量條件下，經OPCs處理后的精子活力更高。[0037]表1
[0038]
【權利要求】
1.一種具有生物活性的動物精液保存劑，其特征在于:是由1000mL的普通介質和16mg寡聚原花青素混合而成，所述普通介質是由6份葡萄糖、0.37份EDTA、0.375份二水檸檬酸鈉、0-0.12份碳酸氫鈉、0.1份新霉素和100份蒸懼水混合而成，新霉素在精液稀釋前單獨添加。
2.根據權利要求1所述的具有生物活性的動物精液保存劑，其特征在于:所述的寡聚原花青素包括白花色苷和花青苷。
3.根據權利要求1或2所述的具有生物活性的動物精液保存劑，其特征在于:所述的寡聚原花青素可來源于松樹皮、葡萄籽、葡萄皮、越桔、酸果蔓、綠茶和紅茶。
4.一種具有生物活性的動物精液保存劑的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: 51.制備兩種粉狀介質，這兩種粉狀介質中至少有一種介質含有至少一種寡聚原花青素； 52.將兩種粉狀介質混合在一起； 53.將兩種粉狀介質的混合物用純水稀釋成溶液； 54.將豬精液樣本加入到溶液中，最好是采集后立即加入； 55.使精液樣本與溶液的滲透壓相平衡，然后分成一定的體積保存，其中OPCs可緩減精液的降解，并對精子活力無負面影響，另外保存液的PH值低于7.5，滲透壓約低于350m0sm。
5.根據權利要求4所的具有生物活性的動物精液保存劑的制備方法，其特征在于:所述粉狀介質中可至少含有 兩種、三種或四種寡聚原花青素。
【文檔編號】A01N1/02GK103651330SQ201210353139
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月21日 優先權日:2012年9月21日
【發明者】劉洋 申請人:臨沂思科生物科技有限公司