專利名稱：一種高雄山蟲草子實體低產孢菌株及子實體人工培養方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物及其子實體的人工培養方法，尤其是一種高雄山蟲草低產孢菌株及其子實體的人工培養方法，屬于真菌培養技術領域。
背景技術：
高雄山蟲草 Cordyceps takaomontana Yakush. &Kumaz. 1941 (=Isaria tenuipespeck (1879) =Isaria japonica Yasuda (1915) =Paecilomyces tenuipes (Peck) Samson(1974) =Paecilomyces japonica)是一種優良的蟲草資源，它在抗癌、抗抑郁、抗蟲、抗菌、抗病毒及調節免疫力等方面有明顯作用。它的抗癌成分乙酰環氧單端 孢烯二醇(4 β -acetoxyscirpene-3 α，15-diol = AETD)的抗癌活性比目前用于臨床癌癥病患者治療用的順鉬強約4-6倍，且毒性低，安全范圍大。因此，高雄山蟲草無論作為藥物開發還是作為保健品應用都具有廣闊前景。在韓國，高雄山蟲草已經應用于食品及保健品中。由于高雄山蟲草的野生資源稀少，利用人工培養生產其子實體，是對高雄山蟲草進行人工開發的必由之路。但目前在高雄山蟲草人工培養中存在的主要問題之一是在子實體生長過程中會產生大量的分生孢子，當這些分生孢子大量存在時，對提高蟲草子實體產量和生產人員的健康安全都造成了較大影響，因此，尋找低產孢的高雄山蟲草菌株和人工培養方法是當前高雄山蟲草子實體人工培養中重點需要解決的問題。

發明內容
本發明所要解決的技術問題在于，提供一種高雄山蟲草子實體低產孢菌株及子實體的人工培養方法。在該人工培養方法下該菌株可發育形成產孢極低的子實體，在高雄山蟲草的人工培養中具有良好的應用前景。為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下
本發明提供的高雄山蟲草，屬于糞殼菌綱、肉座菌目、麥角菌科、蟲草屬，菌株為高雄山蟲草子實體低產抱菌株A1105 (Cordyceps takaomontana A1105),菌株保藏號為CCTCCM 2012307，于2012年8月9日在中國典型培養物保藏中心(地址中國.武漢.武漢大學)保藏。上述的高雄山蟲草子實體低產孢菌株Al 105分離自摧病昆蟲標本,在Czapek瓊脂培養基上，25°C下培養21天時，菌落平均直徑為32mm，正面白色到肉色，粉質，背面白色到褐色，菌落平展、薄，邊緣整齊，未見形成環帶或放射溝，未見角變現象，未見形成孢梗束。本發明的高雄山蟲草低產孢子實體人工培養方法，包含以下步驟(I)人工培養基制備取去皮的小麥粒100g，用清潔水浸泡12h，濾去多余水分后放入培養盒內，采用高壓間歇滅菌法滅菌2-3次備用，每次滅菌溫度控制在115°C，時間控制在40min ；
(2)將Al 105菌株搖瓶培養制成種子液，向培養基上接種種子液45ml，置于25V下暗培養10天左右，見有轉色跡象時，轉入16 1和22°C下，交替變溫培養各12h ;其中在22°C時，見光培養12h，光照強度為200x1，在16°C時，暗培養12h ;25天后即可收獲子實體。上述的高雄山蟲草低產孢子實體人工培養方法中，步驟(I)所述培養盒體積為13cmX 8cmX 11cm,步驟(2)所述培養基體積為 13cmX 8cmX 3. 5cm。前述的高雄山蟲草低產孢子實體人工培養方法中，步驟(2)所述A1105菌株搖瓶培養的溫度為25°C，轉速250r/min，培養4天，菌絲段達IO7Iiil'前述的高雄山蟲草低產孢子實體人工培養方法中，在步驟(2)所述子實體第一次收獲后補水，按照與第一次培養相同的方法，進行二次培養，共計可收獲近雙倍產量。有益效果與現有技術相比，本發明提供的是一種高雄山蟲草子實體低產孢菌株 及子實體的人工培養方法，在該人工培養方法下該菌株可發育形成產孢極低的子實體，有效解決了現有技術在高雄山蟲草人工培養中，子實體生長過程中會產生大量分生孢子的技術難題，保障了生產人員的健康安全，同時也提高了高雄山蟲草子實體的產量，在高雄山蟲草的人工培養中有良好的應用前景。


圖1是本發明的高雄山蟲草菌株A1105在Czapek瓊脂培養基上培養性狀(正面)；圖2是本發明的高雄山蟲草菌株A1105在Czapek瓊脂培養基上培養性狀(背面)；圖3是采用本發明的菌株及方法培養獲得的高雄山蟲草子實體。下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步的說明。
具體實施例方式實施例1。1、人工培養時種子液的制備1.1材料與方法1.1.1 材料I)菌株如圖1、圖2所示，高雄山蟲草Al 105，分離自野外采集的蟲生標本，在Czapek瓊脂培養基上，25°C下培養21天時，菌落平均直徑為32mm，正面白色到肉色，粉質，背面白色到褐色，菌落平展、薄，邊緣整齊，未見形成環帶或放射溝，未見角變現象，未見形成孢梗束。2)培養基①菌種活化培養基PDA培養基。②高雄山蟲草液體培養基馬鈴薯200g煮沸30min濾汁，加入葡萄糖20g，加水至1000ml, 121。。，滅菌 25min，備用。1.1. 2方法將活化好的菌株A1105，用打孔器沿菌落邊緣打孔后接入裝有高雄山蟲草液體培養基的250ml三角瓶中，裝液量為50ml，置于25°C，250r/min下培養4天。1. 2結果培養4天后備用。將培養液混勻后作為種子接種到滅好菌的人工培養基中。2、高雄山蟲草生產子實體的人工培養基制備
2.1實驗材料2.1.1 材料小麥。2.1.1其他材料及儀器較密閉的透光容器(培養盒或罐頭瓶)，人工氣候箱或人工氣候室等。2. 2 方法2. 2.1 預處理將一定量去皮的小麥(比如IOOg小麥)，放入體積為13X8Xllcm的培養盒中，根據小麥品種的不同經水浸泡12h左右備用。2. 2. 2 滅菌·將浸泡好的小麥濾去多余的水分，然后采用高壓間歇滅菌法滅菌2-3次備用，每次滅菌溫度控制在115 °C，時間控制在40min ；3、高雄山蟲草子實體生產的人工培養及結果3.1接種將培養好的種子液用無菌處理的噴槍均勻噴施在培養基的表面(13X8X3. 5cm體積的培養基上可噴灑45ml的種子液)，然后放入培養箱。3. 2培養在25°C下進行暗培養10天左右，見菌絲密集布滿整個培養基，并有轉色跡象時，改變培養條件為22°C，12h見光培養，光照強度為200x1左右為宜，然后再改變培養條件為16°C，12h暗培養，兩者交替進行。3. 3結果在培養4周左右時即可收獲。可用剪刀等將子實體從培養基上切下來保鮮或烘干保存。在本例中，每個培養面積為13X8cm大的培養基上可生產出鮮重為35g左右，干重為8g左右的子實體，子實體的平均長度在5-6cm，直徑為l-2mm (見圖3);經計數檢測，每克鮮重子實體所含有的分生孢子數目僅為3.6X107，相對很小。因此，該菌株和該條件下有利于低產孢子實體的產生。收獲后可根據實際情況適當補水后進行二次培養，培養方法同第一次，每盒進行二次培養后共計可以收獲蟲草子實體鮮重70g左右，干重16g左右。本發明中培養時可根據使用的小麥品種不同，適當增減浸泡時間；滅菌時采用間歇滅菌這樣滅菌更徹底，而且可以在相對較低溫度(115°C )下滅菌，以延長培養盒的使用壽命，節約成本；培養時光照度不宜過高，過高會促使子實體產分生孢子，且子實體形態易變形。另外，培養中菌株選擇也較為重要，有的菌株在子實體剛形成不久就開始在子實體表面形成較多的白色分生孢子，這種菌株不宜使用。本發明的實施方式不限于上述實施例，在不脫離本發明宗旨的前提下做出的各種變化均屬于本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種高雄山蟲草子實體低產孢菌株A1105，保藏號為CCTCC M2012307。
2.根據權利要求1所述的高雄山蟲草子實體低產孢菌株，其特征在于分離自罹病昆蟲標本，在Czapek瓊脂培養基上，25°C下培養21天時，菌落平均直徑為32mm，正面白色到肉色，粉質，背面白色到褐色，菌落平展、薄，邊緣整齊，未見形成環帶或放射溝，未見角變現象，未見形成孢梗束。
3.—種如權利要求1或2所述的高雄山蟲草低產孢子實體人工培養方法，其特征在于 包含以下步驟(1)人工培養基制備取去皮的小麥粒100g，用清潔水浸泡12h，濾去多余水分后放入培養盒內，采用高壓間歇滅菌法滅菌2-3次備用，每次滅菌溫度控制在115 °C，時間控制在 40min ；(2)將Al105菌株搖瓶培養制成種子液，向培養基上接種種子液45ml，置于25°C下暗培養10天左右，見有轉色跡象時，轉入16°C和22°C下，交替變溫培養各12h ;其中在22°C 時，見光培養12h，光照強度為200x1，在16°C時，暗培養12h ；25天后即可收獲子實體。
4.根據權利要求3所述的高雄山蟲草低產孢子實體人工培養方法，其特征在于步驟(1)所述培養盒體積為13cmX8cmXIlcm,步驟(2)所述培養基體積為13cmX8cmX3. 5cm。
5.根據權利要求3所述的高雄山蟲草低產孢子實體人工培養方法，其特征在于步驟(2)所述Al105菌株搖瓶培養的溫度為25°C，轉速250r/min，培養4天，菌絲段達IO7Iiil'
6.根據權利要求3所述的高雄山蟲草低產孢子實體人工培養方法，其特征在于在步驟(2)所述子實體第一次收獲后補水，按照與第一次培養相同的方法，進行二次培養。
全文摘要
本發明公開了一種高雄山蟲草子實體低產孢菌株及子實體人工培養方法。該菌株為高雄山蟲草子實體低產孢菌株A1105，其子實體的人工培養方法包括種子液制備、人工培養基制備、接種、培養、收獲等步驟。在本發明的人工培養方法下該菌株可發育形成產孢極低的子實體，有效解決了現有技術在高雄山蟲草人工培養中子實體生長過程會產生大量分生孢子的技術難題，保障了生產人員的健康安全，同時也提高了高雄山蟲草子實體的產量，在高雄山蟲草的人工培養中有良好的應用前景。
文檔編號A01G1/04GK103004463SQ20121036816
公開日2013年4月3日 申請日期2012年9月28日 優先權日2012年9月28日
發明者梁建東, 田維毅, 王平, 韓潔, 何光志, 王文佳, 蔡琨 申請人:貴陽中醫學院