專利名稱：具有分泌吲哚乙酸iaa功能的分枝桿菌、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株分枝桿菌，尤其涉及一株具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝桿菌，該分枝桿菌能促進(jìn)蘭花組培苗生長及種子萌發(fā)。本發(fā)明還涉及了該株分枝桿菌的制備方法及其在蘭花組培苗生長及種子萌發(fā)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蘭科植物{Orchidaceae、俗稱蘭花(OrcAioO，是單子葉植物，多年生草本，地生、附生或腐生，是被子植物中最大的科之一。蘭花的經(jīng)濟(jì)價值很高，其中多數(shù)種是著名觀賞花卉和名貴藥用植物。蘭花的繁殖主要有分株、扦插、組織培養(yǎng)和種子無菌播種等。在自然條件下，種子不能正常萌發(fā)，根也不能滿足植物體對水分和營養(yǎng)物質(zhì)的需求，使蘭科植物的人工栽培相當(dāng)困難。組織快繁技術(shù)已應(yīng)用于蘭科植物，實(shí)現(xiàn)了蘭科植物的工廠化育苗，但組培·苗移栽成活率很低、生長緩慢、開花延遲、甚至不開花。近年來，蘭科植物內(nèi)生菌的發(fā)現(xiàn)及其對蘭花生長的促進(jìn)作用為蘭科植物人工栽培提供了新思路。最初的研究報(bào)道是在20世紀(jì)80年代，澳大利亞科學(xué)家從地生蘭的根基部分離出內(nèi)生細(xì)菌，由此解開了蘭花內(nèi)生細(xì)菌研究的序幕。國外科學(xué)家在對卷萼兜蘭{PaphiopediIum apple-tonianurii)和節(jié)莖石仙桃 ipholidota articulata)的相關(guān)細(xì)菌進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)，部分蘭科植物的相關(guān)細(xì)菌具有不同程度的分泌IAA的能力，并能促進(jìn)植物種子萌發(fā)。這一發(fā)現(xiàn)提醒我們，蘭科植物與其微生態(tài)系統(tǒng)中的細(xì)菌之間存在著密切關(guān)系。國內(nèi)對于蘭花內(nèi)生細(xì)菌的研究正處于起步階段，2009 2010年分別有研究報(bào)道了從春蘭根部分離得到可分泌IAA的內(nèi)生細(xì)菌，這些內(nèi)生細(xì)菌種類具有豐富的多樣性。分枝桿菌主要包括結(jié)核分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌和麻風(fēng)分枝桿菌等。據(jù)報(bào)道分枝桿菌屬中的某種菌TZh51對降解土壤中的多環(huán)芳烴(如菲、熒葸和芘)，對受污染的土壤有一定修復(fù)作用。另有分枝桿菌對廢水和污泥中的苯系化合物、對汽車燃油中的噻吩硫有降解能力，由此揭示了某些分枝桿菌具有對人類有益的一面。該菌在植物生長方面的作用尚未見詳細(xì)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能促進(jìn)蘭花組培苗生長及種子萌發(fā)的具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝桿菌。本發(fā)明還提供了上述分枝桿菌的制備方法以及該菌種在蘭花種子萌發(fā)及組培苗生長中的應(yīng)用。本發(fā)明具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝桿菌所采用的技術(shù)方案是一種具有分泌口引哚乙酸IAA功能的分枝桿菌,其分類命名為分枝桿菌應(yīng)avium Mya-zhOl,已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2012年3月28日，保藏編號為CCTCC NO M2012092。
該菌株具有以下特性該菌株在固體培養(yǎng)基中呈橙黃色顆粒狀，生長緩慢，在羅-琴培養(yǎng)基中需2 3周形成菌落，菌體形態(tài)呈棒桿狀，無芽孢，好氧，革蘭氏染色陽性，有莢膜。所述分枝桿菌為鳥-胞內(nèi)分枝桿菌。所述分枝桿菌的16S rDNA序列如下，其序列編號為SEQ ID NO :3，
5’ -GACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGAAAGGCCCCTTCGGGGGTACTCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGACCTTTAGACGCATGTCTTTTGGTGGAAAGCTTTTGCGGTGTGGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGTCCGGCCACACTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCACCATCGACGAAGGTTCGGGTTTTCTCGGATTGACGGTAGGTGGAGAAGAAGCACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGTTTGTCGCGTTGTTCGTGAAATCTCACGGCTTAACTGTGAGCGTGCGGGCGA TACGGGCAGACTAGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTCCTTCCTTGGGATCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGTACCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATGCACAGGACGCGTCTAGAGATAGGCGTTCCCTTGTGGCCTGTGTGCAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTCATGTTGCCAGCGGGTAATGCCGGGGACTCGTGAGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGCTGCGATGCCGCAAGGTTAAGCGAATCCTTTTAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCAGTGGCCTAACCCTTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGATCGGCGATTGGGACG-3，。本發(fā)明具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝桿菌的制備方法所采用的技術(shù)方案是所述分枝桿菌來源于蝴蝶蘭花梗，經(jīng)分離、純化獲得。該方法包括以下步驟
(O分枝桿菌Mya-ZhOl的分離，剪取蝴蝶蘭新鮮的花梗，用自來水沖洗掉花梗上的灰塵等雜物，在超凈工作臺上進(jìn)行表面消毒，用無菌吸水紙吸干花梗表面的水分，用無菌的剪刀或手術(shù)刀剪切長為4cm的花梗小段，將花梗放置于MS培養(yǎng)基上，25°C條件下培養(yǎng)；1-2個月后，將花梗上長出的小芽切下，接種培養(yǎng)在羅-琴培養(yǎng)基上，I個月之后即可看到叢生芽或小苗周圍出現(xiàn)橙黃色的菌株，即為Mya-zhOl菌株；
(2)分枝桿菌Mya-zhOl的純化培養(yǎng),將從蝴蝶蘭外植體上分離出的Mya-zhOl菌按照純化菌株的常規(guī)方法，在羅-琴固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，置于30°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)I個月，挑取培養(yǎng)基上長出的單菌落，即可得到多株純菌株。本發(fā)明還給出了上述具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝桿菌在蘭花種子萌發(fā)及組培苗生長中的應(yīng)用。在該應(yīng)用中，所述分枝桿菌Mya-zhOl利用外源色氨酸，分泌植物生長素IAA。在蘭花組培苗生長的應(yīng)用如下將分枝桿菌Mya-zhOl接種于蘭花組培苗基部，其預(yù)培養(yǎng)在MS培養(yǎng)基上，24-25°C條件下培養(yǎng)，蘭花組培苗的生長良好，其中，蘭花品種為蝴蝶蘭或石斛蘭；在蘭花種子萌發(fā)中的應(yīng)用如下將蘭花種子浸泡于分枝桿菌Mya-zhOl菌液中一段時間，再播種于通用的蘭花組織培養(yǎng)基上，24-25°C條件下培養(yǎng)，蘭花種子萌發(fā)并出根長葉，所述蘭花品種為蝴蝶蘭或石斛蘭。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明用于促進(jìn)蘭花組培苗生長時，將一定濃度的分枝桿菌Mya-zhOl接種于組培苗基部，按蘭花組織培養(yǎng)條件培養(yǎng)；用于促進(jìn)蘭花種子萌發(fā)時，將蘭花種子經(jīng)本領(lǐng)域常規(guī)方法消毒后，浸泡于適宜濃度的分枝桿菌Mya-zhOl菌液一段時間，再播種于蘭花種子萌發(fā)培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基)中，按照蘭花組織培養(yǎng)適宜條件進(jìn)行培養(yǎng)，本發(fā)明菌株可有效的促進(jìn)蘭花組培苗生長及種子萌發(fā)，這對于生長較為緩慢的蘭花組織培養(yǎng)及工廠化生產(chǎn)組培苗具有重要意義。



圖I是分枝桿菌Mya-zhOl革蘭氏染色的顯微鏡照片；
圖2是分枝桿菌Mya-zhOl在羅-琴培養(yǎng)基上的生長情況；
圖3是實(shí)施例三中分枝桿菌Mya-zhOl在不同培養(yǎng)基中分泌IAA能力情況對比表；
圖4是分枝桿菌Mya-zhOl對蝴蝶蘭組培苗生長的影響對比圖，其中a圖為未接種分枝桿菌Mya-zhOl的對照苗生長圖；b圖為接種了分枝桿菌Mya-zhOl(細(xì)菌濃度IO8 cfu / mL)的組培苗生長圖；c圖為接種了 10倍稀釋液(細(xì)菌濃度IO7 cfu / mL)的分枝桿菌Mya-zhOl菌液的組培苗的生長圖；d圖為接種了 IO2倍稀釋液(細(xì)菌濃度IO6 cfu / mL)的分枝桿菌Mya-zhOl菌液的組培苗的生長圖；e圖為接種了 IO4倍稀釋液(細(xì)菌濃度IO4 cfu / mL)的分枝桿菌Mya-zhOl菌液的組培苗的生長圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明具體公開了一種具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝桿菌，該菌株在固體培養(yǎng)基中呈橙黃色顆粒狀，生長緩慢，在羅-琴培養(yǎng)基中需2-3周形成菌落。菌體形態(tài)呈棒桿狀，無芽孢，好氧，革蘭氏染色陽性(染色顯微鏡照片見圖1)，有莢膜。其生理生化特征如表I所示。表I :分枝桿菌Mya-zhOl的生理生化特征
權(quán)利要求
1.一種具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝桿菌，其分類命名為分枝桿菌{Mycobacterium avium') Mya-zhOl,已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號為CCTCCM 2012092。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝桿菌，其特征在于，該菌株具有以下特性該菌株在固體培養(yǎng)基中呈橙黃色顆粒狀，生長緩慢，在羅-琴培養(yǎng)基中需2 3周形成菌落，菌體形態(tài)呈棒桿狀，無芽孢，好氧，革蘭氏染色陽性，有莢膜。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝桿菌，其特征在于所述分枝桿菌為鳥_胞內(nèi)分枝桿菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝桿菌，其特征在于，所述分枝桿菌的 16S rDNA 序列如下5’-GACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGAAAGGCCCCTTCGGGGGTACTCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATAGGACCTTTAGACGCATGTCTTTTGGTGGAAAGCTTTTGCGGTGTGGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGTCCGGCCACACTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGGGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCACCATCGACGAAGGTTCGGGTTTTCTCGGATTGACGGTAGGTGGAGAAGAAGCACCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGTGGTTTGTCGCGTTGTTCGTGAAATCTCACGGCTTAACTGTGAGCGTGCGGGCGATACGGGCAGACTAGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTCCTTCCTTGGGATCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGTACCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATGCACAGGACGCGTCTAGAGATAGGCGTTCCCTTGTGGCCTGTGTGCAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTCATGTTGCCAGCGGGTAATGCCGGGGACTCGTGAGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGCTGCGATGCCGCAAGGTTAAGCGAATCCTTTTAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCAGTGGCCTAACCCTTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGATCGGCGATTGGGACG-3，。
5.一種如權(quán)利要求I所述的具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝桿菌的制備方法，其特征在于所述分枝桿菌來源于蝴蝶蘭花梗，經(jīng)分離、純化獲得。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝桿菌的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟 (O分枝桿菌Mya-zhOl的分離，剪取蝴蝶蘭新鮮的花梗，用自來水沖洗掉花梗上的灰塵等雜物，在超凈工作臺上進(jìn)行表面消毒，用無菌吸水紙吸干花梗表面的水分，用無菌的剪刀或手術(shù)刀剪切長為4cm的花梗小段，將花梗放置于MS培養(yǎng)基上，25°C條件下培養(yǎng)；1_2個月后，將花梗上長出的小芽切下，接種培養(yǎng)在羅-琴培養(yǎng)基上，I個月之后即可看到叢生芽或小苗周圍出現(xiàn)橙黃色的菌株，即為Mya-zhOl菌株； (2)分枝桿菌Mya-zhOl的純化培養(yǎng),將從蝴蝶蘭外植體上分離出的Mya-zhOl菌按照純化菌株的常規(guī)方法，在羅-琴固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，置于30°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)I個月，挑取培養(yǎng)基上長出的單菌落，即可得到多株純菌株。
7.—種如權(quán)利要求I所述的具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝桿菌在蘭花種子萌發(fā)及組培苗生長中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述分枝桿菌Mya-zhOl利用外源色氨酸，分泌植物生長素IAA。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用如下將分枝桿菌Mya-zhOl接種于蘭花組培苗基部，其預(yù)培養(yǎng)在MS培養(yǎng)基上，24-25°C條件下培養(yǎng)，蘭花組培苗的生長良好，其中，蘭花品種為蝴蝶蘭或石斛蘭。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用如下將蘭花種子浸泡于分枝桿菌Mya-zhOl菌液中一段時間，再播種于通用的蘭花組織培養(yǎng)基上，24-25°C條件下培養(yǎng)，蘭花種子萌發(fā)并出根長葉，其中，蘭花品種為蝴蝶蘭或石斛蘭。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株能促進(jìn)蘭花組培苗生長及種子萌發(fā)的具有分泌吲哚乙酸IAA功能的分枝桿菌，該分枝桿菌的制備方法以及該菌種在蘭花種子萌發(fā)及組培苗生長中的應(yīng)用。該株具有分泌IAA功能的分枝桿菌Mycobacteriumavium Mya-zh01保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為中國·武漢·武漢大學(xué)，郵編430074，保藏日期2012-3-28，保藏編號CCTCCNOM2012092；所述分枝桿菌Mycobacteriumavium Mya-zh01來源于蝴蝶蘭花梗，經(jīng)分離、純化獲得；本發(fā)明菌株可分泌吲哚乙酸(Indole-3-aceticacid，IAA)，具有促進(jìn)蘭花組培苗生長及種子萌發(fā)的能力，這對于生長較為緩慢的蘭花組織培養(yǎng)及工廠化生產(chǎn)組培苗具有重要意義。本發(fā)明可應(yīng)用于蘭花栽培技術(shù)領(lǐng)域。
文檔編號A01N63/02GK102888375SQ201210368480
公開日2013年1月23日 申請日期2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月28日
發(fā)明者潘麗晶, 張妙彬, 陳繼敏, 任淑梅, 王燕鸝, 吳熙文 申請人:珠海市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究中心