專利名稱：一種鐵皮石斛組織培養一步成苗的方法
技術領域：
本發明涉及鐵皮石斛的組培技術領域，尤其涉及一種鐵皮石斛組織培養ー步成苗的方法。
背景技術：
鐵皮石斛，被譽為“中華九大仙草之首”，為蘭科多年生草本植物。生于山地半陰濕的巖石上，喜溫暖濕潤氣候和半陰半陽的環境，不耐高溫、干燥，不耐寒。鐵皮石斛為石斛之極品，它因表皮呈鐵綠色而得名，具有益胃生津，滋陰清熱等藥用價值。鐵皮石斛種子微小，自然萌發率和繁殖率低，生產上的種苗均來自組織培養。目前，鐵皮石斛的組培育苗主要通過原球莖誘導、幼苗分化與壯苗培養3個階段來實現，培養 時間較長、成本較高。因此，如何縮短培養時間、提高培養效率、降低培養成本已成為促進鐵皮石斛產業加速發展的當務之急。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種鐵皮石斛組織培養ー步成苗的方法。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的一種鐵皮石斛組織培養ー步成苗的方法，包括以下步驟
(1)制備成苗培養基以B5為基礎培養基，每升B5培養基中添加0.Img的6-芐氨基嘌呤、0. 3mg的a -萘こ酸、2. Og的活性炭、3. 5g的瓊脂和30g的蔗糖，加熱至沸騰，加熱過程中攪拌，待瓊脂完全溶解后，調節PH值至6. 0，得成苗培養基；均勻地將成苗培養基分裝于培養容器中，邊分裝邊攪拌，避免活性炭沉底，分裝完畢后加蓋；培養容器加蓋后，放入高壓滅菌鍋內滅菌，滅菌條件為121°C下滅菌20分鐘，滅菌后取出培養容器，冷卻后備用；
(2)鐵皮石斛果實滅菌將鐵皮石斛果實放入水中清洗干凈；在無菌條件下，將鐵皮石斛果實在體積百分比濃度為75%的こ醇溶液中浸泡I分鐘，取出用無菌水清洗若干遍，放入體積百分比濃度為2%的次氯酸鈉溶液滅菌10分鐘，再用無菌水清洗若干適，吸干水分后放入無菌培養皿中備用；
(3)接種解開鐵皮石斛果實的果皮，把種子均勻地灑在成苗培養基表面，蓋緊蓋子；
(4)培養將完成接種的培養容器移入培養室，培養條件為溫度25°C，光照時間每天12小時，光照強度1500 20001x，培養時間約為3個月，得到0. 5-1. 0 cm的幼苗；
(5)轉接首先配置壯苗培養基每升B5培養基中添加0.5mg的6-芐氨基嘌呤、I. Omg的a -萘こ酸、3. Og的活性炭、3. Og的瓊脂和30g的蔗糖，加熱至沸騰，加熱過程中攪拌，待瓊脂完全溶解后，調節PH值至6. 0，得狀苗培養基；然后將幼苗轉接至壯苗培養基，繼續培養，直至苗高5-6cm時，移栽至大棚。本發明的有益效果是本發明通過合理掌控兩種激素用量及相互間的配比，以及其他輔料的添加，促進鐵皮石斛種子一歩成苗，而不必經過原球莖階段，縮短培養時間2個月左右，降低了經濟成本。轉接結果也表明，一歩成苗培養成的組培苗長勢旺盛，符合生產所需，可作為鐵皮石斛生產種苗的重要來源。
具體實施例方式本發明鐵皮石斛組織培養ー步成苗的方法，包括以下步驟
I.成苗培養基準備
(I)配制以B5為基礎培養基，每升B5培養基中添加0. Im g的6-芐氨基嘌呤、0. 3mg的a -萘こ酸、2. Og的活性炭，3. 5g的瓊脂和30g的蔗糖，加熱至沸騰，加熱過程中攪拌，待瓊脂完全溶解后，調節pH值至6. 0，得成苗培養基。(2)分裝均勻地將培養基分裝于培養容器中，邊分裝邊攪拌，避免活性炭沉底，分裝完畢，加蓋。(3)滅菌培養容器加蓋后，及時放入高壓滅菌鍋內滅菌，滅菌條件為121°C下滅菌20分鐘，滅菌后及時取出培養容器，冷卻后備用。2.外植體滅菌
先清洗將外植體鐵皮石斛果實放入清水中，加少許洗潔精，清洗果實表面，后用流水沖洗干凈。滅菌事先將鑷子和燒杯滅菌，在無菌條件下，用鑷子將果實在體積百分比濃度為75 %的こ醇溶液中浸泡I分鐘，取出用無菌水清洗2遍，放入體積百分比濃度為2%的次氯酸鈉溶液滅菌10分鐘，再用無菌水清洗6遍，吸干水分，放入無菌培養皿中備用。3.接種
用無菌解剖刀解開鐵皮石斛果實的果皮，把種子均勻地灑在培養基表面，立刻蓋緊蓋子。4.培養
將完成接種的培養容器移入培養室，培養條件為■ 溫度25°C，光照時間每天12小時，光照強度1500 20001x，培養時間約為3個月，得到0. 5-1. 0 cm的幼苗；培養期間要勤檢查，發現污染及時移除。5.轉接
配置壯苗培養基每升B5培養基中添加0. 5mg的6-芐氨基嘌呤、I. Omg的a -萘こ酸、3. Og的活性炭、3. Og的瓊脂和30g的蔗糖。加熱至沸騰，加熱過程中攪拌，待瓊脂完全溶解后，調節PH值至6. 0，得狀苗培養基。將高0.5-1. 0 cm的幼苗轉接至壯苗培養基，繼續培養，直至苗高5-6 cm時，移栽至大棚。
權利要求
1.一種鐵皮石斛組織培養一步成苗的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)制備成苗培養基以B5為基礎培養基，每升B5培養基中添加O.Img的6-芐氨基嘌呤、O. 3mg的α -萘乙酸、2. Og的活性炭、3. 5g的瓊脂和30g的蔗糖，加熱至沸騰，加熱過程中攪拌，待瓊脂完全溶解后，調節PH值至6. 0，得成苗培養基；均勻地將成苗培養基分裝于培養容器中，邊分裝邊攪拌，避免活性炭沉底，分裝完畢后加蓋；培養容器加蓋后，放入高壓滅菌鍋內滅菌，滅菌條件為121°C下滅菌20分鐘，滅菌后取出培養容器，冷卻后備用； (2)鐵皮石斛果實滅菌將鐵皮石斛果實放入水中清洗干凈；在無菌條件下，將鐵皮石斛果實在體積百分比濃度為75%的乙醇溶液中浸泡I分鐘，取出用無菌水清洗若干遍，放入體積百分比濃度為2%的次氯酸鈉溶液滅菌10分鐘，再用無菌水清洗若干遍，吸干水分后放入無菌培養皿中備用； (3)接種解開鐵皮石斛果實的果皮，把種子均勻地灑在成苗培養基表面，蓋緊蓋子； (4)培養將完成接種的培養容器移入培養室，培養條件為溫度25°C，光照時間每天12小時，光照強度1500 20001x，培養時間約為3個月，得到O. 5-1. O cm的幼苗； (5)轉接首先配置壯苗培養基每升B5培養基中添加O.5mg的6-芐氨基嘌呤、I. Omg的α -萘乙酸、3. Og的活性炭、3. Og的瓊脂和30g的蔗糖，加熱至沸騰，加熱過程中攪拌，待瓊脂完全溶解后，調節PH值至6. 0，得狀苗培養基；然后將幼苗轉接至壯苗培養基，繼續培養，直至苗高5-6cm時，移栽至大棚。
全文摘要
本發明公開了一種鐵皮石斛組織培養一步成苗的方法，該方法通過合理調配培養基中兩種激素的比例和劑量，同時加入活性炭等輔料，使得鐵皮石斛種子直接發育成幼苗，將幼苗轉接到壯苗培養基之后，成活率達99.5%以上。本發明可將鐵皮石斛組織培養的成苗時間縮短2個月，顯著提高培養效率，降低經濟成本，可作為鐵皮石斛組培苗生產的重要方法。
文檔編號A01H4/00GK102845308SQ20121036891
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月27日 優先權日2012年9月27日
發明者沈曉霞, 沈宇峰, 王志安 申請人:浙江省中藥研究所有限公司