一株對茶葉病源真菌具有抗性的深海沉積物來源枯草芽孢桿菌b5的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一株對茶葉病源真菌具有抗性的深海沉積物來源枯草芽孢桿菌B5。該菌為枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis），其菌種保藏號為：CCTCC?M?2012384。該菌株活菌對常見茶葉病原真菌具有很強的拮抗性，能很好的適應各種環境，其加工產品可濕性粉劑能用于防治茶葉多種真菌病害。為茶園病害生物防治提供了一種新的菌株產品。
【專利說明】一株對茶葉病源真菌具有抗性的深海沉積物來源枯草芽孢
桿菌B5
【技術領域】
[0001]本發明涉及一株具有抗茶葉多種病原真菌致病性的深海沉積物來源枯草芽孢桿菌B5，該菌對常見茶葉病原真菌致病性具有很強的拮抗效果。
【背景技術】
[0002]中國是茶葉的故鄉，福建是主要茶區，茶樹病蟲種類繁多、發生危害重，茶樹害蟲達390多種、茶樹病害100余種。病蟲為害不僅造成茶葉減產、品質下降，如茶園不合理用藥，農藥殘留超標突出，會污染環境，影響消費者健康，也嚴重阻礙茶葉出口，實施病蟲綜合治理是發展無公害茶葉生產，確保茶葉優質、高產和可持續發展的重要環節。目前，中國茶葉在世界上是產茶大國，但還不是產茶強國，有很大一部分原因就是因為化學農藥殘留問題影響了茶葉的出口。為避免茶農盲目用藥，生產中應采取預防為主、綜合防治的策略，在了解病蟲害規律的基礎上，采取多種措施進行防治，從而達到經濟、無公害的防治效果。微生物農藥具有高效率、低殘留對人畜無害等特點，是一種非常合適的選擇。
[0003]深海占地球表面積的49%，是地球表面最大的生物棲息場所，深海環境中微生物基因資源的開發具有現實、重要的資源及科學價值。典型深海特征為低溫(<5°C )和高壓(最高達IlOMPa)，據估計在此極端條件下，深海環境中可培養微生物還不到0.01%。深海微生物由于其處于高壓、低溫(部分區域如熱液口為高溫)、厭氧、極端PH梯度、高鹽濃度、高金屬濃度、無光照、寡營養、高鹵素等到特殊極端環境中，可產生許多結構新穎、功能獨特及毒副作用低的次生代謝產物，各種代謝產物常常導致深海微生物尤其是深海細菌具有獨特的對陸生菌抗性。這類具有真菌抗性深海細菌如今也成為了研究開發的熱點。
[0004]菌對植物病原真菌的拮抗作用包含多`種機制，一般認為有競爭作用、重寄生作用、抗生作用、誘導抗性以及協同拮抗作用。
[0005]競爭作用，主要為對生存空間和營養的競爭。枯草芽孢桿菌對環境的適應能力強、生長速度遠快于病原菌，能與病原菌產生空間和營養的競爭，從而抑制其的生長，降低其種群數量，在抑制病原真菌過程中起著重要作用。酶的溶菌作用，枯草芽孢桿菌可以產生一系列揮發性和非揮發性的次生代謝物，抑制病原菌的生長，主要與3_1，3葡聚糖酶、幾丁質酶、木聚糖酶、蛋白酶和纖維素酶等有關，通過酶的作用使真菌細胞壁遭到破壞，繼而引起原生質解體。抗生作用，許多芽孢桿菌產生揮發性或非揮發性的抗菌素類物質，這些抗生物質的化學性質各不相同，包括了枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短桿菌肽等活性物質等幾大類。
[0006]1985年，北京農業大學陳延熙等研制的以枯草芽孢桿菌為主要成分的“增產菌”已在全國50多種農作物上推廣施用，主要用于防治小麥紋枯病、水稻稻瘟病和油菜菌核病等，作物增產率達10%-50%。1992年，王雅平等利用枯草芽孢桿菌A014菌株對小麥赤霉病進行了防效研究，試驗表明該菌株對小麥赤霉病防效達50.6%。1993年，王雅平等從絲瓜根際土壤中分離到枯草芽孢桿菌TG26菌株田間試驗表明該菌株對西瓜枯萎病和小麥赤霉病防效分別為79.6%和73.1%，并具有顯著的增產效果。1994年，張學君等用分離到的枯草芽孢桿菌B3菌株對小麥紋枯病進行防治試驗，田間防效達50%-80%。1997年，陳志誼等用枯草芽孢桿菌B-916防治水稻紋枯病，防效達50%-81%。2002年，顧真榮等用枯草芽孢桿菌G3防治菜豆和茄子苗期的菌核病和炭疽病，防效分別為64.1%和35.4%，對番茄葉霉病防效為78.8%。
[0007]可濕性粉劑是農藥中技術比較成熟的劑型，是農藥的四大劑型之一，廣泛應用于農藥病害防治。可濕性粉劑一直處于穩步發展的狀態，目前已形成了較大的生產能力。近年來不斷有新的助劑、新的載體應用到可濕性粉劑的創制上，質量不斷得到提高，在農業生產中發揮了重要作用。可濕性粉劑由原藥、填料、表面活性劑、輔助劑等混合后粉碎到一定的細度而制成的制劑。表面活性劑包括分散劑、潤濕劑等，輔助劑包括熱穩定劑、光穩定劑、警戒劑等。可濕性粉劑使用時加水稀釋，能夠形成穩定的懸浮液，噴霧施用，與水具有高度親和性，故稱為“可濕性”，也有稱為水和性，稱為“水和劑”或“可分散性粉劑”。

【發明內容】

[0008]本發明的主要目的在于提供一株具有抗茶葉致病真菌致病性的深海沉積物來源枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B5。其由中國典型培養物保藏中心保藏(編號:CCTCCM2012384，保藏日期2012年9月27日，地點:中國武漢，武漢大學)。
[0009]本發明的菌株為深海來源，生長快速，芽孢率高，對茶葉生長中常見的致病真菌具有較強的抑制作用，能對茶園病害防治產生積極預防效果。
[0010]本發明的另一目的在于提供所述的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) B5的用途，其應用于抑制茶葉致病真菌。尤其是輪斑病源菌和炭疽病源菌。
[0011]本發明的再一目的在于提供一種枯草芽孢桿菌B5的應用方法,其利用所述的枯草芽孢桿菌B5菌體和芽孢體，加入助劑配制成可濕性粉劑。
[0012]本發明的再一目的在于提供一種抑制茶葉致病真菌的可濕性粉劑，其包括前述的枯草芽孢桿菌B5。
[0013]在本發明的推薦實施例中，前述的可濕性粉劑，按重量比包括:
[0014]枯草芽抱桿菌B580~90%
[0015]硅藻土10-15% 以及
[0016]助劑5-10%
[0017]在本發明中所采用的助劑包括本領域配制粉劑時常用的潤濕劑、分散劑、穩定劑以及紫外保護劑等。
[0018]本發明 申請人:從西南太平洋深海沉積物中分離得到一株細菌。使用16S 1、16S II引物擴增得到16S序列，經BLAST鑒定該株菌為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，經抑菌活性篩選發現其活菌對常見茶葉病源真菌具有良好生長抑制作用。經過碳氮源和無機鹽的單因子篩選以及四因素三水平的正交試驗確定了枯草芽孢桿菌B5的最佳發酵培養基配方。通過對其活菌進一步研究，利用發酵獲得的活菌按照一定比例加入特定助劑配制了對常見茶葉致病真菌具有生防效果的可濕性粉劑。
【專利附圖】

【附圖說明】[0019]圖1是枯草芽孢桿菌B5在LB平板上的菌落形態；
[0020]圖2是枯草芽孢桿菌B5在顯微鏡下形態；
[0021]圖3為枯草芽孢桿菌B5的16S電泳圖；
[0022]圖4是枯草芽孢桿菌B5對茶葉致病真菌的抑制效果，其中
[0023]A為輪斑病源菌抑制效果，中間:茶葉致病真菌；兩邊B5 ；
[0024]B為炭疽病源菌抑制效果，中間:茶葉致病真菌；兩邊B5。
【具體實施方式】
[0025]實施例1
[0026]A本發明所涉及菌株的分離鑒定
[0027]本發明 申請人:從西南太平洋盆地1584m深海沉積物中板分離了 32株細菌，以分離自茶葉病斑的茶葉致病真菌，莖點霉屬LH2(Phoma sp.),茶輪斑病源菌LH13 (Pestalotiopsis theae),茶炭疽病源菌 LH30 (Colletotrichum gloeosporioides),葡座球腔菌 LH107 (Neofusicoccum sp.),鏈格孢屬 LH129 (Alternaria sp.),擬盤多毛屬LH162 (Pestalotiopsis sp.)為指示菌，采用平板對峙法檢測了這32株深海來源細菌的抑制茶葉致病真菌活性，其中I株枯草芽孢桿菌B5表現出較好的抑制效果，其對LH13、L30的抑制距離分別達到15. 45mm、14.62mm。
[0028]該菌株B5經分類學研究和分子生物學研究鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，并由中國典型培養物保藏中心保藏(編號:CCTCC M 2012384，保藏日期2012年9月27日，地點:中國武漢，武漢大學)。
[0029]該菌的微生物學特征為:在LB平板上37°C培養48h后，菌落呈現淡黃色，淡營養條件下為污白色，菌落邊緣不整齊稍顯粗糙不透明，隨著生長時間增長菌落呈褶皺狀，褶皺中間向空中凸起(圖1)。細菌單個或鏈狀排列，單細胞0.6-0.8X2.2-3.5微米，著色均勻。無莢膜，革蘭氏陽性菌，芽孢0.6-0.9X1.8-2.5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。在液體培養基中生長時，常形成皺醭。需氧菌，發酵過程大量耗氧。采用孔雀綠番紅復合染色后可以看到紅色的桿狀枯草芽孢桿菌B5的菌體和綠色的芽孢體(圖 2)。
[0030]該芽孢桿菌對環境適應能力很強，4°C _42°C均能生長，在pH3這種強酸的條件下也能夠生長，直到PH9都能較好的生長，在pH6-8之間能很好的生長，其發酵液含菌量達到頂峰，pHIO時細菌生長急劇惡化，維持在低生物量水平。
[0031]發酵該菌時采用本發明中的發酵培養基，按1%的接種量，在37°C，200r/min的條件下發酵48h能達到最佳的發酵結果。
[0032]B枯草芽孢桿菌B5的基因組DNA提取
[0033]SDS法提取枯草芽孢桿菌B5的基因組DNA:
[0034]I)菌株在37°C搖床(200r/min)培養過夜；
[0035]2)取ImL菌液,8000r/min離心5min,棄上清；加入500 μ LSTE重懸；
[0036]3) 8000r/min離心5min,棄上清；加入600 μ L TE用槍頭反復吹打重懸；
[0037]4)加入質量分數 20% 的 SDS 25 μ L，20mgl/mL 蛋白酶K，I μ L RNase, 100 μ L IOmg/mL的溶菌酶，混勻，37°C恒溫水育120min ；[0038]5)加入等體積的V(酚):V(氯仿):V (異戊醇)=25: 24: I混合液混勻，放置20_30s, 12000r/min離心IOmin,將上清再移至新管中；
[0039]6)加入0.7倍體積的異丙醇輕輕混合，4°C靜置120min ；
[0040]7)12000r/min離心20min，棄上清，加入體積分數70%的乙醇洗滌，12000r/min離心2min，棄上清液，重復洗滌后取100 y L的ddH20重懸DNA，一 20°C保存備用。
[0041]C菌株鑒定
[0042]通過引物16S 15’ AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’ 和 16S II 5’ GGT TAC CTTGTTACGACT T-3’對枯草芽孢桿菌B5基因組DNA進行擴增，PCR為94°C預變性5min 94°C變性90s，55°C復性90s，72°C延伸90s ;32個循環，72°C延伸10min，4°C保溫。將擴增片段用T載克隆轉化到DH5ci。跑膠驗證得到陽性克隆(見圖3)。
[0043]對陽性克隆進行測序，獲得枯草芽孢桿菌B5的16S序列如下
【權利要求】
1.一株深海沉積物來源的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)B5，保藏號為:CCTCCM2012384。
2.如權利要求1所述的枯草芽孢桿菌B5的用途，其特征在于，應用于抑制茶葉致病真菌。
3.如權利要求2所述的枯草芽孢桿菌B5的用途，其特征在于，所述的茶葉致病真菌為輪斑病源菌或炭疽病源菌。
4.一種枯草芽孢桿菌B5的應用方法，其特征在于:利用所述的枯草芽孢桿菌B5的菌體和芽孢體，加入助劑配制成可濕性粉劑。
5.一種抑制茶葉致病真菌的可濕性粉劑，其包括權利要求1所述的枯草芽孢桿菌B5。
6.如權利要求5所述的一種抑制茶葉致病真菌的可濕性粉劑，按重量比包括: 枯草芽孢桿菌B5 80-90% 硅藻土10-15%以及 助劑5-10%。`
【文檔編號】A01P3/00GK103789220SQ201210432271
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年10月31日 優先權日:2012年10月31日
【發明者】湯熙翔, 鄧欽文, 易志偉 申請人:國家海洋局第三海洋研究所