一株具有抗茶葉致病真菌活性的深海沉積物來源淡紫擬青霉a65的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種具有抗茶葉致病真菌活性的深海沉積物來源淡紫擬青霉A65。該菌為淡紫擬青霉菌，保藏號為：CCTCC?M?2012385，其本身對茶葉致病真菌具有較強的抑制作用，包括抑制致病菌孢子的萌發及菌體的生長。本發明提供的菌株可配制成可濕性粉劑，用于防治茶葉常見致病真菌發病。
【專利說明】一株具有抗茶葉致病真菌活性的深海沉積物來源淡紫擬青 霉A65【技術領域】
[0001]本發明涉及一株具有抗茶葉致病真菌致病性的深海沉積物來源淡紫擬青霉A65。【背景技術】
[0002]中國是茶葉的故鄉，福建是主要茶區，茶樹病蟲種類繁多、發生危害重，茶樹害蟲達390多種、茶樹病害100余種。病蟲為害不僅造成茶葉減產、品質下降，如茶園不合理用藥，農藥殘留超標突出，會污染環境，影響消費者健康，也嚴重阻礙茶葉出口，實施病蟲綜合治理是發展無公害茶葉生產，確保茶葉優質、高產和可持續發展的重要環節。目前，中國茶葉在世界上是產茶大國，但還不是產茶強國，有很大一部分原因就是因為化學農藥殘留問題影響了茶葉的出口。為避免茶農盲目用藥，生產中應采取預防為主、綜合防治的策略，在了解病蟲害規律的基礎上，采取多種措施進行防治，從而達到經濟、無公害的防治效果。微生物農藥具有高效率、低殘留對人畜無害等特點，是一種非常合適的選擇。
[0003]淡紫擬青霉在已有的研究報道中多見用于防治各種根結線蟲，自Jatata等(1979)最早報道了淡紫擬青霉(Paecilomyces Iilacinus)可作為根結線蟲卵和胞囊線蟲卵的有效寄生菌，在實驗室測試中5天可破壞南方根結線蟲卵的胚胎。以后許多國家相繼對淡紫擬青霉的防治效果進行試驗但都僅驗證了淡紫擬青霉對線蟲有防治作用，沒有進一步的應用發展。淡紫擬青霉還能產生豐富的衍生物，其一是類似吲哚乙酸產物，它最顯著的生理功效是低濃度時促進植物根系與植株的生長，因此如果對植物施藥不僅能明顯抑制線蟲侵染，而且能促進植株營養器官的生長，同時對種子的萌發與生長也有促進作用。
[0004]海洋真菌是海洋微生物的重要組成，真菌通過吸附于有機物質上進行滲透營養生長的異養真核生物，與細菌相比，真菌相對高等，代謝能力更強，生命活動更復雜，并又與海洋中動植物有著非常復雜的生態關系，其具有很多陸生真菌沒有的特性，是近年來微生物制劑研究開發的熱點來源。

【發明內容】

[0005]本發明的主要目的在于提供一株具有抗茶葉致病真菌致病性的深海沉積物來源淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus) A65。其由中國典型培養物保藏中心保藏(編號:CCTCCM 2012385，保藏日期2012年9月27日，地點:中國武漢，武漢大學)
[0006]本發明的菌株為深海來源的淡紫擬青霉，生長快速，產孢量大，對茶葉生長中常見的致病真菌具有較強的抑制作用，能對茶園病害防治產生積極預防效果。
[0007]本發明的另一目的在于提供所述的淡紫擬青霉A65的用途，其應用于抑制茶葉致病真菌。尤其是輪斑病源菌和炭疽病源菌。
[0008]本發明的再一目的在于提供一種淡紫擬青霉A65的應用方法，其利用所述的淡紫擬青霉A65的分生孢子，加入助劑配制成可濕性粉劑。
[0009]本發明的再一目的在于提供一種抑制茶葉致病真菌的可濕性粉劑，其組分中包括前述的淡紫擬青霉A65的分生孢子。
[0010]在本發明的推薦實施例中，所述的可濕性粉劑，按重量比包括:
[0011 ] 淡紫擬青霉A65分生孢子 10%
[0012]硅藻土70-80% 以及
[0013]助劑10-20%。
[0014]在本發明中所采用的助劑包括本領域配制粉劑時常用的潤濕劑、分散劑、穩定劑以及紫外保護劑等。
[0015]本發明 申請人:從西南太平洋深海沉積物中分離得到一株真菌。使用ITS4、ITS5引物擴增得到其ITS序列，經BLAST鑒定該株菌為淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)。培養過程中發現其能大量產生分生孢子，經活性篩選發現其活菌能較好的抑制常見茶葉致病真菌的生長及致病真菌孢子的萌發。利用A65發酵獲得的高孢粉加入特定助劑可以得到對常見茶葉致病真菌具有生防效果的可濕性粉劑。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1是淡紫擬青霉A65在PDA平板上的菌落形態；
[0017]圖2是淡紫擬青霉A65在顯微鏡下形態；
[0018]圖3為淡紫擬青霉A65的ITS電泳圖；
[0019]圖4是淡紫擬青霉A65對茶葉致病真菌的抑制效果，其中
`[0020]A為輪斑病源菌抑制效果，中間:茶葉致病真菌；兩邊:A65 ；
[0021]B為炭疽病源菌抑制效果，中間:茶葉致病真菌；兩邊:A65。
【具體實施方式】
[0022]實施例1
[0023]A本發明所涉及菌株的分離鑒定
[0024]利用PDA+氯霉素+鏈霉素平板從20份太平洋海底深海沉積物中分離了 28株真菌，以分離自茶葉病斑的茶葉致病真菌，莖點霉屬LH2(Phoma sp.),茶輪斑病源菌LH13 (Pestalotiopsis theae),茶炭疽病源菌 LH30 (Colletotrichum gloeosporioides),葡座球腔菌 LH107 (Neofusicoccum sp.),鏈格孢屬 LH129 (Alternaria sp.),擬盤多毛屬LH162 (Pestalotiopsis sp.)為指示菌,采用平板對峙法檢測了這28株深海來源真菌的抑制茶葉致病真菌活性，其中I株絲狀真菌A65表現出較好的抑制效果，其對LH13的抑制距離達到15.08mm。
[0025]該菌株A65經分類學研究和分子生物學研究鑒定為淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus)，并由中國典型培養物保藏中心保藏(編號:CCTCC M 2012385，保藏日期2012年9月27日，地點:中國武漢，武漢大學)。
[0026]采用常規方法，研究了該菌的主要培養特性。該菌有輪狀分枝的分生孢子梗。分生孢子多數稍呈橢圓形，少數近梭形或圓形，單細胞，無色。生長和產孢的最適溫度范圍為25-300C ;適宜的培養基pH為4-8。馬鈴薯、蛋白陳、蔗糖、硝酸鈣、磷酸氫二鈉組成的培養基是該菌生長和發酵產孢最佳而比較廉價的培養基。
[0027]該菌的微生物學特征為:A65真菌在PDA平板培養生長速度較快，平均每天能達到8.36mm.。養3天，菌落顏色呈淺紫紅色，突起，表面粉質，輪紋明顯。菌絲無色，有隔膜。分生孢子梗輪狀分枝，2-3輪層，一層具2-5個分生孢子小梗，小梗瓶狀或基部稍膨大，頂端稍細長。分生孢子鏈狀著生，遠方的孢子先成熟，大小為2.75-3.0O X 1.6 μ m，單孢、無色、多數稍呈梭形，少數橢圓形，表面光滑，見圖1和圖2。
[0028]在PDA液體培養中，按每200ml接種I塊6mm菌塊的比例接種發酵培養基，28 V、180rpm搖培3天可見白色菌絲球出現,第4天開始大量產孢,到第7天產孢達到一個小高潮，隨后在第9天產孢達到最大。隨著培養時間的延長，菌絲球從白色最終變成淺紫色，液體培養基顏色也相應地變紫灰色。
[0029]B淡紫擬青霉A65的基因組DNA提取
[0030](I)將保種或已純化的真菌接種到PDA平板上，28°C生長5_7天后，用無菌的牙簽挑取少量菌絲體至EP管，放入液氮中凍30-60min ；
[0031](2)取出冷凍的菌體，每管加入400 μ I 65°C預熱的CTAB buffer抽提液，65°C振蕩水浴搖床中保溫45-60min ；
[0032](3)加入等體積的酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，充分混勻，13000r/min離心20-30min，將上層水相移入新管；
[0033](4)重復第(3)步；
[0034](5)上清加入0.7v異丙醇,于4°C中靜置30min或者過夜；
[0035](6) 13000r/min離心15min,除去上清,沉淀用70%乙醇洗漆2次,吹干；
[0036](9)以 2Oul DDW 溶解沉淀，_20°C保存。
[0037]取5 μ L DNA與I μ L溴酚藍；在0.8%的瓊脂糖凝膠檢測其純度和濃度。
[0038]C菌株鑒定
[0039]通過引物ITS45，-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3，和 ITS55，-GGA AGT AAAAGTCGT AAC AAG G-3’對 Α65 基因組 DNA 進行擴增，PCR 為 94°C預變性 3min 94°C變性 lmin，53°C復性45s，72°C延伸45s:32個循環，72°C延伸10min，4°C保溫。將擴增片段用T載克隆轉化到DH5 α。跑膠驗證得到陽性克隆(見圖3)。
[0040]陽性克隆進行測序，獲得淡紫擬青霉Α65的ITS序列如下
[0041]TCCTCCGCTT ATTGATATGC TTAAGTTCAG CGGGTATTCC TACCTGATCC GAGGTCAACT 60
[0042]CTAAGAMGT TGGGCGTTTT ACGGCGTGAC CGCCTCCGCG CTCCGGTGCG AGGTGTGTGC 120
[0043]TACTACGCAG GGGAGGCTGC GGCGGGGTCG CCACTGCATT TCGGGGGCGG CTGGTGTGCC 180
[0044]GTCCCCCAAC ACCGAGGCCC CGGGGGGGGC TCGAGGGTTG AAATGACGCT CGAACAGGCA 240
[0045]TGCCCGCCAG MTGCTGGCG GGCGCMTGT GCGTTCAAAG ATTCGATGAT TCACTGAATT 300
[0046]CTGCAATTCA CATTACTTAT CGCATTTCGC TGCGTTCTTC ATCGATGCCA GAACCAAGAG 360
[0047]ATCCGTTGTT GAAAGTTTTG ATTCATTTGT TTTTGCTTGT GCAACTCAGA GAAGAAATTC 420
[0048]CGCCCGCTGG GCGTAATGCA AGAGAGTTTG GGGTCCCTGC GGCGGGCGCC TGGGTCCGGC 480
[0049]GCCGGCGCGG GGGCAGGCGG CCGGGGCGTT CCCGCCGAGG CAACTGAGGT AAGGTTCACA 540
[0050]GTGGGTTTGG GAGTTGTATA ACTCGGTAAT GATCCCTCCG CTGGTTCACC AACGGAGACC 600
[0051]TTGTTACGAC TTTTACTTCC620
[0052]對淡紫擬青霉Α65的ITS序列進行BLAST分析，結果顯示該序列和Paecilomyceslilacinus strain B59ACGENE Bank ID:ΗΜ242263.I)相似度最高，達到99%。故可鑒定該株菌屬于淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)。
[0053]實施例2淡紫擬青霉A65對茶葉致病真菌致病性的抑制作用
[0054]真菌淡紫擬青霉A65接種到PDA培養基28°C培養7天后，用加有0.1%吐溫-10的滅菌水在平板內把分生孢子沖洗下來，裝入EP管中，血細胞計數器計數，逐級稀釋孢子濃度到1 X 1O6個/ml制備成A65孢子懸浮液。采用平板對峙法測定A65對茶葉致病真菌的抑制作用。
[0055]平板對峙法:在平板底部劃垂直交叉十字，在PDA平板距離中心等距離處放置濾紙塊，紙塊上接種20 μl的孢子懸液；在平板中央接種直徑6mm的指示病原菌菌餅，28°C下培養5-7d，至拮抗菌與各指示菌菌落間產生明顯抑菌帶時測量拮抗帶寬度。以不接種拮抗菌，只接指示菌做對照(圖4)。
[0056]實施例3淡紫擬青霉A65可濕性粉劑的配制
[0057]單因素測定法:利用單一變量法從待選的各種載體、助劑中逐一篩選出合適的劑型載體為硅藻土，其他助劑若干。
[0058]正交實驗法:用正交表安排多因素試驗的方法，稱為正交試驗設計法。其特點為:①完成試驗要求所需的實驗次數少數據點的分布很均勻；③可用相應的極差分析方法、方差分析方法、回歸分析方法等對試驗結果進行分析，引出有價值的結論。
[0059]正交試驗設計方法是用正交表來安排試驗的。
[0060]經實驗，最后得出本發明的最佳配方為可濕性粉劑配方是10%淡紫擬青霉A65分生孢子，70%-80%硅藻土，其他助劑10%-20%。
【權利要求】
1.一種深海沉積物來源淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)A65,保藏號為:CCTCCM2012385。
2.如權利要求1所述的淡紫擬青霉A65的用途，其特征在于，應用于抑制茶葉致病真菌。
3.如權利要求2所述的淡紫擬青霉A65的用途，其特征在于，所述的茶葉致病真菌為輪斑病源菌或炭疽病源菌。
4.一種淡紫擬青霉A65的應用方法，其特征在于:利用權利要求1所述的淡紫擬青霉A65的分生孢子，加入助劑配制成可濕性粉劑。
5.一種抑制茶葉致病真菌的可濕性粉劑，其包括權利要求1所述的淡紫擬青霉A65的分生孢子。
6.如權利要求5所述的一種抑制茶葉致病真菌的可濕性粉劑，按重量比包括: 淡紫擬青霉A65分生孢子 10% 硅藻土70-80%以及 助劑10-20%。`
【文檔編號】A01N25/14GK103789211SQ201210432272
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年10月31日 優先權日:2012年10月31日
【發明者】湯熙翔, 鄧欽文, 易志偉 申請人:國家海洋局第三海洋研究所